Abstract
På grunn av de lave totale responsrate på 10-47% til målrettet kreftbehandling, er det et økende behov for prediktiv biomarkører. Vi forsøkte å identifisere gener forutsi respons på fem som allerede er godkjent tyrosinkinasehemmere. Vi testet 45 kreftcellelinjer for følsomhet for sunitinib, erlotinib, lapatinib, sorafenib og gefitinib på klinisk administrert doser. En motstand matrise ble bestemt, og genekspresjonsprofiler til undergrupper av resistente vs. sensitive cellelinjer ble sammenlignet. Tre eksemplarer genekspresjonssignaturer ble hentet fra caArray prosjektet. Betydningen analyse av mikromatriser og rang produkter ble søkt om funksjonsvalg. Ninety-fem gener ble også målt med RT-PCR. I tilfelle av fire sunitinib motstand forbundet gener, ble resultatene validert i kliniske prøver ved immunohistokjemi. En liste over 63 topp gener assosiert med resistens mot de fem tyrosinkinasehemmere ble identifisert. Kvantitativ RT-PCR-analyse bekreftet 45 av 63 gener identifisert ved microarray analyse. Bare to gener (
ANXA3 Hotell og
RAB25
) var relatert til følsomhet mot mer enn tre-hemmere. Immunhistokjemisk analyse av sunitinib-behandlet metastatiske nyrecellekarsinomer bekreftet sammenhengen mellom RAB17, LGALS8, og EpCAM og total overlevelse. I sammendraget, bestemt vi prediktive biomarkører for fem tyrosinkinasehemmere, og validert sunitinib motstand biomarkører ved immunhistokjemi på en uavhengig pasient kohort
Citation. Pénzváltó Z, Tegze B, Szász AM, Sztupinszki Z, Liko jeg, Szendrői A, et al. (2013) Identifisere resistensmekanismer mot fem tyrosinkinasehemmere Målretting erbB /RAS Pathway i 45 Cancer Cell Lines. PLoS ONE 8 (3): e59503. doi: 10,1371 /journal.pone.0059503
Redaktør: Stefan Wölfl, Universität Heidelberg, Tyskland
mottatt: 21. august 2012; Godkjent: 15 februar 2013; Publisert: 29 mars 2013
Copyright: © 2013 Pénzváltó et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Studien ble støttet av OTKA PD 83154, ved Tippe-prosjektet (gi nr. 259 303 av Health.2010.2.4.1.-8 call), ved TAMOP-4.2.1.B-09/1 /KMR-2010-0001 og av Alexander von Humboldt Stiftung. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Den tilhørighet Dr István Liko med Richter Gedeon endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Målrettet terapi i behandling av kreft refererer til bruk av spesielle midler som påvirker spesifikke molekylære funksjoner i signaloverføringsveier involvert i utviklingen av kreft fenotype. Erlotinib er gefitinib, sorafenib, sunitinib og lapatinib all klinisk brukes tyrosinkinasehemmere (TKI) rettet mot reseptorer og nedstrøms medlemmer av ErbB /RAS sti [1]. Erlotinib og gefitinib er reversible epidermal vekstfaktor-reseptor (EGFR) tyrosinkinase-inhibitorer som brukes i behandling av ikke-småcellet lungekreft. Om lag 10% av pasientene responderer på behandlingen i det europeiske og nordamerikanske befolkningen [2]. Lapatinib hemmer tyrosinkinase-domenet av den epidermale vekstfaktor-reseptor (EGFR) og human epidermal vekstfaktor-reseptor-2 (HER2). Den er godkjent for behandling av brystkreft, hvor den samlede svarprosenten til denne behandlingen er 24% [3]. Sorafenib hemmer RAF, VEGFR, PDGFR, Flt-3, c-Kit reseptorer. Den partielle responsraten er 10%, når den administreres til pasienter med langt fremskreden nyrecelle-karsinom [4]. Sunitinib er en liten-molekyl fler målrettet reseptortyrosinkinasehemming (RTK) hemmer som ble godkjent av FDA for behandling av nyrecellekreft (RCC) og imatinib-resistente gastrointestinal stromal tumor (GIST). Objektiv responsrate er 31% i første linje behandling av nyrecellekreft [5]. På grunn av de lave totale responsrate på 10-47% [6] – [10], er det et økende behov for biomarkører forutsi respons på målrettet terapi behandling
I tillegg farmakokinetiske parametre, en svulst kan distribuere forskjellig molekyl. mekanismer for å oppnå motstand mot målrettet terapi midler: målmolekylet kan være gjenstand for modifikasjon, kan nedstrøms forandringer av veien føre til resistens mot et middel rettet mot en oppstrøms molekyl, eller andre veier kan bli aktivert som alternativt formidler kreftcelle overlevelse og proliferasjon. For eksempel, den T790M mutasjon av
EGFR
genet har beholdt evnen til å aktivere reseptoren nedstrømsveien, men samtidig reduserer bindingen av gefitinib og erlotinib til reseptoren og således fører til resistens [11].
MET
forsterkning fører til motstand mot erlotinib og gefitinib gjennom aktivering av alternative veier [12]. Interleukin-8 kan aktivere et alternativ vei som fører til sunitinib motstand [13]. Mutasjoner av gener nedstrøms medlemmer av veien kan også bidra til motstand mot målrettede terapimidler, som beskrevet tidligere i tilfelle av
KRAS product: [14],
PTEN product: [15],
BRAF product: [16], og
PIK3CA product: [17]. Når en nedstrøms komponent av signaleringssystemet aktiverer vei, ble inhibering av blokkeringen av en oppstrøms medlem vist seg å være ineffektiv. Disse nedstrøms endringer kan anvendes som negative prediktorene for legemidler som virker på oppstrømsiden av denne vanedannende element av reaksjonsveien, slik som beskrevet før for
KRAS product: [18]. Hvis
KRAS
havner en aktiverende mutasjon, midler som påvirker EGFR vil ikke ha noen effekt på tumorvekst [19].
Tidligere studier har allerede beskrevet at bruk av genuttrykk data, kombinert med
in vitro
medikament følsomhetsanalyser, kan anvendes for å utvikle signaturer som kan klassifisere respons på konvensjonelle anticancermidler [20], [21]. I en annen studie ble et panel av cancercellelinjer behandlet med dasatinib, en multitarget kinase inhibitor, og følsomhet overfor medikamentet ble målt. Parallelt ble uttrykk data generert fra det samme panel av cellelinjer som brukes til å utvikle en signatur for å forutsi følsomheten til medikamentet [22]. I en annen studie ble et panel av lungekreftcellelinjer brukes til å utvikle genekspresjonssignaturer som forutsier følsomhet for EGFR-hemmere gefitnib [23] og erlotinib [24]. Til slutt, de vanligste betydelige gener av en
in vitro
og en
in vivo
studien var i stand til å forutsi respons på rapamycin [25]. Selv om fokus på enkelt terapeutiske midler i en type kreft, disse studiene allerede demonstrert kraften av genuttrykk profiler for å forutsi respons på en bestemt agent.
I denne studien, tok vi en bredere tilnærming som mål å identifisere genet signaturer i forbindelse med iboende motstand mot 5 allerede godkjente tyrosinkinasehemmere rettet mot erbB /RAS-veien. For å få nye prediktive biomarkører, korrelert vi følsomheten av 45 cellelinjer som representerer 15 forskjellige kreft enheter til uttrykk mønstre. De beste resultater kandidat gener ble deretter validert ved hjelp QRT-PCR. Til slutt ble klinisk validering utført ved hjelp av immunhistokjemi basert på microarray på et sett av nyrecellekarsinomer fra pasienter behandlet med sunitinib.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
Godkjennings nummer for prøvetaking av National Scientific og forskningsetiske komité (ETT-TUKEB) (Ungarn) er # 185/2007. Generelt informert samtykke ble innhentet før operasjonen. National vitenskapelige og forskningsetiske komité ikke har bedt om en skriftlig tillatelse, fordi det var en retrospektiv studie, og pasientene ble behandlet anonymt.
Cell Culture
Vi har fått 45 ATCC cellelinjer . Før valget, fravær av
KRAS
mutasjon i cellelinjene ble bekreftet ved hjelp av Katalog av somatiske mutasjoner i Cancer (søk gjort på 25
th av juni 2010). Cellene ble dyrket i henhold til ATCC protokoller (https://www.lgcstandards-atcc.org/). I tillegg, antibiotika (penicillin-streptomycin, Invitrogen, kat. Nr .: 15070-063, Amphotericin B, Invitrogen, kat. Nr .: 15290-026) ble tilsatt. Cellelinjene er oppsummert i tabell 1. En oversikt over studien er presentert i Figur 1.
Bokser med grå bakgrunn representerer opplæring trinn, mens hvit bakgrunn representerer validerings trinn.
DNA Isolasjon og kvalitetskontroll
DNA ble isolert ved hjelp av Qiagen DNeasy blod og vev Kit (Qiagen, Hilden, kat. nr .: 69 506) i henhold til produktbrukerhåndboken. Kvantitet og kvalitet av DNA ble testet ved hjelp av et Nanodrop 1000-system (BCM, Houston, TX, USA). DNA (A260) og protein (A280) konsentrasjoner og prøve renhet (260/280-forhold) ble målt og høy kvalitet DNA ble anvendt for videre analyse. DNA ble lagret ved -80 ° C.
Autentisering av cellelinjer
Autentisering ble utført for cellelinjer oppnådd mer enn 4 år siden fra ATCC som bruker kort tandem repeat (STR) analyse av 10 spesifikke loci i det humane genom og en mus spesifikk markør. Autentisering ble utført av StemElite ID System på Fragment Analysis Facility, Johns Hopkins University (Baltimore, USA). STR profiler av de anvendte cellelinjer ble sammenlignet med den STR profildatabase av Leibniz Institute DSMZ – tyske samling av mikroorganismer og cellekulturer (https://www.dsmz.de). Alle cellelinjer inkludert i denne studien var forurensning-fri.
Resistance Tester
Legemidler ble brukt i deres kommersielt tilgjengelig form, og ble brukt til cellene i 3 konsentrasjoner (C1, C2, C3 ). C1 = 0,1 * C2 og C3 = 10 * C2. Konsentrasjon C2 ble utledet fra klinisk brukte doser (se tabell 2).
MTT analysen (Roche, kat. Nr .: 11465007001), ble brukt til å teste anti-proliferativ effekt av reagenser og celle levedyktighet. I hvert eksperiment, 2000 celler /brønn ble sådd ut i 100 ul medium på 96-brønners plater. Etter en dags inkubasjon ble Forlading celler farget. På samme tid ble kulturene behandlet med alle 5 studerte stoffer på C1, C2 og C3 konsentrasjoner. På den femte dagen ble forsøket avsluttet, og cellene ble farget. Absorbansen ble avlest med en Thermo Scientific Multiskan® FC. Absorbansen målt ved 595 nm ble korrigert med bakgrunn målt ved 690 nm. Alle målinger ble gjentatt tre ganger, og for beregning av bestandighetsindeks (RI) verdier, ble gjennomsnitt av 3 målinger som brukes. Den bestandighetsindeks (RI) ble beregnet ved formelen [26]: hvor N
pre er mediet absorbansverdi av Forlading (som representerer antall celler ved begynnelsen av behandlingen), N
innlegget er mediet absorbansen verdi av kontroll (som representerer antall celler ved slutten av behandlingen med kjøretøyet behandling bare), og N
2 er mediet absorbansverdien av behandlede celler behandlet med C2 konsentrasjon av det studerte medikamentet. C1 og C3-konsentrasjoner ble anvendt som interne kontroller for å overvåke det dynamiske området av agentene. Bare cellelinjer som oppfylte kvalitetskriteriene N
post N
pre og avvik i cellevekst innen repetisjoner. 15% var inkludert i evalueringen
funksjonsvalg
Raw microarray data for de cellelinjer ble generert i GSK caArray prosjektet (ftp://caftpd.nci.nih.gov/pub/caARRAY/transcript_profiling). caArray ble utviklet ved hjelp av caBIG retningslinjer kompatibilitet, samt microarray genuttrykk Data (MGED) samfunnets standarder for microarray data. Etter nedlasting, de raw.CEL filene var MAS5 normalisert i R statistisk sikkerhet (www.r-project.org) ved hjelp av AFFY Bioconductor bibliotek [27]. rangert MAS5 blant de beste normaliseringsmetoder i forhold til resultatene fra QRT-PCR målinger i vår siste studie [28]. Hver cellelinje ble målt på de mikromatriser av triplikater – i det siste trinnet av den pre-prosessering gjennomsnittet av disse ble beregnet. Som probe sett med svært lav overflod er ikke bare usannsynlig å holde biologisk betydning, men er også utsatt for feil, gjorde vi en filtrering for å beholde bare probe sett med en gjennomsnittlig uttrykk over 100, og maksimal uttrykk i løpet av 1000. Den komplette normalisert database er presentert i tabell S1.
Den fullstendige datasettet som består av uttrykket profilene har blitt arrangert i 2 timer, i henhold til motstands egenskapene til cellelinjer. Mellomliggende cellelinjer ble ekskludert. Dette valget resulterte i 5 datasett, som ble behandlet som selvstendige klasse oppgaver. For å få en liste av gener beste korrelert til motstand, brukte vi Betydningen Analyse av mikromatriser (SAM) [29] og rang produkter [30], [31]. Mens SAM er den mest brukte metoden, ble rangerer produkter funnet å levere best mulig ytelse i en setting som ligner på vårt prosjekt med lav utvalgsstørrelse i en tidligere oversikt over tilgjengelige funksjonen utvelgelsesmetoder [32]. Effekten av genet sett til å diskriminere resistente og sensitive cellelinjer ble beregnet ved å bruke Prediksjon Analyse av mikromatriser [33]. R-fil av den brukte statistisk analyse er tilgjengelig i supplerende materiale Script S1.
For å vurdere evnen til genet-sett for å forutsi overlevelse, vi søkte i Pubmed GEO for datasett med tilgjengelig klinisk oppfølging hvor kreftpasienter ble behandlet med en av de fem undersøkte midler. Til slutt, for å søke etter genet lister som ligner på genene våre og for å identifisere gener som korrelerer med de identifiserte gener, brukte vi CCancer søkemotor [34].
RNA Isolation og kvalitetskontroll
Etter homogenisering bruker Qiashredder, ble RNA isolert med Qiagen RNeasy kit (Qiagen, Hilden, Tyskland) i henhold til produktbrukerhåndboken. Kvantitet og kvalitet av det isolerte RNA ble testet ved hjelp av en Nanodrop 1000 system (BCM, Houston, TX, USA) og ved gel elektroforese å bruke en Agilent Bioanalyzer system (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA, USA). RNA (A260) og protein (A280) konsentrasjoner og prøve renhet (260/280 ratio) ble målt. Bare høy kvalitet, intakt total RNA ble akseptert for prøver som også viste vanlige 18S og 28S ribosomalt RNA bøye mønster på Bioanalyzer analyse. RNA ble holdt ved -80 ° C til RT-PCR-måling.
TaqMan®-analysen
TaqMan real-time PCR ble anvendt for å måle ekspresjonen av 95 utvalgte gener (pluss en husholdningsgenet) ved hjelp en Micro Fluidic Card System (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) i 40 cellelinjer. Målingene ble utført med en ABI PRISM® 7900HT Sequence Detection System som beskrevet i produktene brukerhåndboken. Genene ble valgt for å omfatte de beste genene korrelert til resistens mot de forskjellige midler. I tillegg basert på et litteratursøk, et sett av gener korrelert til målrettet terapi motstand og medlemmer av EGFR /RAS sti ble også lagt for ytterligere analyser. Listen over inkluderte gener er presentert i tabell S2.
Data Analysis av RT-PCR Målinger
For første dataanalyse SDS 2.2-programvaren ble brukt. Deltaet Ct-verdier (som representerer uttrykket normalisert til ribosomal 18S uttrykk) ble gruppert etter motstandsegenskaper mot de ulike aktørene i grupper. Deretter ble t-test utføres for å sammenligne ekspresjon av genet i de forskjellige gruppene uavhengig av hverandre. Statistisk signifikans ble satt til p. 0,05
nyrecellekarsinom (RCC) Prøvetaking
Pasientene ble behandlet ved Institutt for Urologi, Semmelweis University, Budapest, Ungarn mellom 2005 og 2010. Prøvene ble samlet i henhold til state-of-the-art patologi protokoll fra alle pasienter operert for nyrecellekreft. Det ble imidlertid bare pasienter med senere metastatisk sykdom inkludert i studien, som bare disse pasientene fikk en målrettet terapi behandling. De to agenter i klinisk bruk for metastatisk RCC er sunitinib og sorafenib. Av disse er sunitinib administrert i den første linje innstilling, og dermed ble disse pasientene utvalgt for immunhistokjemisk analyse. Microarray (TMA) av alle FFPE- prøver ble konstruert med Tissue Micro-Array Builder instrument (Histopatologi Ltd., Pécs, Ungarn). I TMA, ble duplikater av 2 mm brede kjerner brukes av hver svulst representerer deres mest relevante områdene i henhold til histopatologi.
Immunohistochemistry
immunhistokjemiske (IHC) reaksjoner ble utført på 4 mikrometer tykke seksjoner hentet fra TMA blokker. Etter deparaffinization ble lysbilder varmet i mikrobølgeovn i Target Retrieval Solution (DAKO, Carpenteria, CA, USA) i 30 minutter. En automatisert Ventana Benchmark immunostainer systemet ble brukt i henhold til protokollen «880» (og «870» for LGALS8) gitt av produsenten (Ventana Medical Systems Inc., Tucson, AZ, USA). RAB17 (fortynning, 1:200), LGALS8 (01:50), EpCAM (1:100) og CD9 (1:300) antistoffer ble brukt til farging. Vev ble kontra med Mayers hemalaun (00-8011, Zymed Laboratories Inc.). Positive kontroller og negative kontroll vev ble anvendt i alle forsøk IHC. Ved CD9, LGALS8, RAB17 cytoplasma reaksjon, for EpCAM membran farging ble akseptert som riktig lokalisering.
De fargede objektglass ble digitalisert med et lysbilde scanner (Mirax MIDI Scan, 3DHistech Ltd., Budapest, Ungarn), og intensiteten av reaksjonen (0: negativ reaksjon, en: svak positivitet, 2: moderat positivitet, 3: sterk reaksjon) og hyppigheten av positivt fargede celler (0:0-1%, 1:1-5% 2:5-10%, 3:10-20%, 4:20-33%, 5:33-50%, 6:50-66%, 7:66-80%, 8:80-100%) var vurderes separat. Endelig sammenheng mellom 25-persentilen overlevelse grupper samt Kaplan-Meier overlevelses tomter basert på gruppering ved hjelp av median ble beregnet i WinStat for Excel (R. Fitch Software, Bad Krozingen, Tyskland).
Resultater
Resistance Tests
motstanden i hver cellelinje ble målt i tre paralleller for hver av de tre konsentrasjonene av de fem agenter. Deretter ble cellelinjene rangert basert på deres RI verdier. En mellomliggende verdi RI ble betegnet som å være innenfor median RI verdien +/- 10% av RI rekkevidde. Cellelinjer som stiller høyere RIs ble utpekt som bestandig, og cellelinjer med lavere RIs som sensitive. En komplett oversikt over separasjon av cellelinjer i grupper er vist i tabell 1.
Identifikasjon av Diskriminerende Gener
For klassifisering, gener ble filtrert for å inkludere bare de som oppnådde en minst 2 ganger forskjell i gjennomsnitts uttrykket forhold mellom cellelinjer som er utpekt som sensitiv eller resistent. Deretter ble funksjonen utvalg med SAM og rangere produktene utført. Bare de genene ble akseptert som betydelig, som oppnådde en falsk funnrate på under 20%. Den fullstendige listen over viktige gener i Tabell S3.
Nøyaktigheten av klassifiseringen i leave-one-out kryssvalidering innstillingen med alle gener i cellelinjene resulterte i en effektivitet på 92,8% i PAM (cellelinjer med mellommotstander ble ekskludert). Bruken av de 100 genene identifisert av rang produkter resulterte i 79% riktige spådommer. De riktige klassifikasjoner som bruker de 100 beste rang produkter identifisert gener er presentert i blått og feilklassifisering i rødt i tabell S4.
Selv om de undersøkte agenter er i klinisk bruk allerede i over 7 år, men vi klarte ikke å finne publisert datasett egnet for meta-analyse av det identifiserte gen-settet. Dermed kunne vi ikke utføre en
i silico
validering på prediksjon av klinisk respons eller overlevelse. Ved hjelp CCancer, har alle sammen 27 publikasjoner med overlapp gensettene blitt identifisert. Disse er angitt i tabell S5.
TaqMan Validering av cellelinje-avledet Gene profiler
TaqManq RT-PCR resultatene er oppsummert i tabell 3. 45 av de 63 gener assosiert med resistens i funksjonen utvalg ved hjelp av microarray data ble bekreftet under p 0,05 og 23 av disse under p 0,01. Den høyeste signifikans ble oppnådd ved å
ITGB4 product: (p = 0,005) av erlotinib-motstand forbundet, etter
IADA product: (p = 0,003) av gefitinib-assosierte gener ved å
FAT4 product: (p = 0,011) av sorafenib forbundet gener og av
Furin Hotell og
ME1 product: (p = 0,011) av lapatinib assosierte gener. Flere gener ble betydelig bekreftet av sunitinib-motstand genet signatur inkludert
KRT18 product: (p = 0,001),
LGALS8 product: (p = 0,019),
RAB17 product: (p = 0,002 ),
CD9 product: (p = 0,002) og
PPL product: (p = 0,001). I mellomtiden, bare 7 av de 32 gener som tidligere er beskrevet i litteraturen som i forbindelse med motstand mot den målrettede terapimidler ble bekreftet. Den komplette normalisert resultat av TaqMan analysene er tilgjengelig som tabell S6.
Noen av genene ble forbundet med resistens mot flere agenter. Den høyeste betydningen av disse ble oppnådd ved
COL3A1 product: (p 0,001 i tilfelle av sorafenib-resistens),
GJA1 product: (p 0,001 ved sunitinib-resistens) og
KRT19 product: (p 0,001 ved sunitinib-motstand). Vi har også avbildet gener assosiert med resistens mot flere agenter ved hjelp av en sirkus-plott (se figur 2). Ved hjelp av denne metode kan man gjenkjenne det høye antall gener assosiert med sunitinib resistens og tilstedeværelsen av bare et enkelt gen korrelert til lapatinibs motstand. Bare to gener (
ANXA3 Hotell og
RAB25
) ble korrelert til iboende motstand mot minst fire agenter.
Circos tomt på RT-PCR validert korrelasjoner for gener assosiert med resistens mot flere agenter som er identifisert av microarray analyse. Tykkelsen på bånd relatere til
log (p)
av sammenhengen (se tabell 2.). Merk det høye antallet gener assosiert med sunitinib motstand og enkelt gen assosiert med lapatinib motstand. De to mest informative gener er ANXA3 og RAB25, hver forbundet med resistens mot fire agenter.
IHC-basert validering i nyrecellekarsinomer
Til sammen 39 sunitinib-behandlede pasienter med metastatisk nyre celle carcinoma ble inkludert i studien. Pasientprøver ble tatt før administrasjon av førstelinje TKI og er derfor lik måling av genuttrykk i cellelinjer uten behandling. Gjennomsnittsalderen for pasientene var 59 år, 63% av pasientene var kvinner. Median total overlevelse er 14 måneder med 12/39 dødsfall. Gjennomsnittlig overlevelse er 20 måneder. Delvis metastasectomy ble utført i tilfelle av sytten pasienter. Representative bilder av immunhistokjemisk farging for tre proteiner kodet av de identifiserte genene er vist i figur 3. Den detaljerte resultater i alle prøvene for alle genene er presentert i tabell S7.
Representative eksempler på immunhistochemical validering for CD9, EpCAM og LGALS8. Venstre kolonne: normal nyre, høyre kolonne: utvalgte svulstvev
Den økte fargeintensitet av LGALS8 (p = 0,026) og RAB17 (p = 0,018) og hyppigheten av positive celler for EpCAM (s. = 0,01) og LGALS8 (p = 0,01) ble korrelert til forbedret overlevelse. I mellomtiden CD9 – selv om viser en trend mot redusert overlevelse hos pasienter som har økt fargeintensitet (p = 0,14) – var ikke signifikant. Kaplan-Meier overlevelses tomt for EpCAM er avbildet i figur 4.
Kaplan-Meier overlevelses plott av sunitinib-behandlet metastatisk RCC prøvene delt inn i to grupper basert på medianen av EpCAM positive celler (p = 0,01).
Diskusjoner
Målrettet terapi agenter som handler via erbB /RAS sti angitt mainstream kreft terapi retningslinjer. Som fortsatt bare 10-47% av pasientene svare på disse terapi, er det av største betydning for å identifisere driverne og potensielle markører for motstand. I vår studie har vi brukt 45 kreftcellelinjer og genom-wide genekspresjonssignaturer for å identifisere potensielle nye iboende biomarkør gener. Som potensiell klinisk anvendelse av vår strategi, validert vi produkter av resistensassosierte gener ved IHC analyse i sunitinib-behandling nyrecellekarsinomer.
Vi brukte en heterogen panel av kreftcellelinjer som stammer fra lunge (brukt TKI inkluderer erlotinib og gefitinib), bryst (lapatinib), renal (sorafenib og sunitinib), og lever (sorafenib). Cellelinjer med kjent RAS-mutasjon ble utelatt, da aktive RAS-mutasjoner gjengi hemning av tyrosinkinaser oppstrøms helt ineffektive, som tidligere er vist for tykktarmskreft [35]. Valg av cellelinjer gjør det mulig å identifisere robuste gener relatert til tidligere uidentifiserte uavhengige veier.
I en fersk studie av Barretina et al, et stort panel av cellelinjer ble undersøkt for å identifisere markører for følsomhet mot et sett av cytotoksisk og målrettede midler, inkludert tre av de tyrosinkinasehemmere brukt i denne studien (erlotinib, lapatinib og sorafenib) ved å måle følsomhet på IC50 og EC50-verdier [36]. For å øke kliniske relevansen av kreftcellelinje testing, brukte vi medikamentkonsentrasjoner anvendt i kliniske settinger, som vi forventet å finne de mest pålitelige søker markører ved konsentrasjoner også oppnåelig hos pasienter [37], [38]. Robusthet tilnærming ved hjelp av slike forhåndsdefinerte kliniske konsentrasjoner støttes av vellykket validering i en klinisk kohort av sunitinib-behandlede pasienter.
Vi har funnet mest kryssresistens forbundet gener relatert til sunitinib-motstand. Interessant, hittil bare noen få gener har blitt korrelert med sunitinib-motstand i litteraturen mens antall kandidat gener som er involvert i resistens mot de andre midler som er mye større. Derfor har vi spesielt fokus på sunitinib motstand og utført immunhistokjemiske eksperimenter på tumorprøver for å validere diskriminerende potensialet i fire nye kandidat biomarkører,
LGALS8
,
RAB17
,
EpCAM
, og
CD9
.
Vår første kandidat genet
LGALS8
koder for et medlem av galectin familien. Galectins har vært implisert i mange funksjoner, inkludert utvikling, differensiering, celle-celle adhesjon, celle-matriks interaksjoner, vekstregulering, apoptose, og RNA-spleising. Galectin-8 også kan være involvert i angiogenese [39], og uttrykket endres under hypolaryngeal og laryngeal tumorprogresjon [40]. Det andre genet,
RAB17
er en epitelial celle-spesifikk GTPase spiller en viktig rolle i reguleringen av membranen handel [41]. Den tredje gen, epitelceller adhesjonsmolekyl (
EpCAM
) er en membran protein med proto-onkogen egenskaper som er uttrykt i en rekke kreftformer og er en lovende kreft narkotika mål. Det fungerer som et homotypisk kalsium-uavhengig celleadhesjonsmolekyl. Frigivelsen av det intracellulære domene av molekylet resulterer i aktivering av WNT veien [42]. Høy uttrykk for
EpCAM
er assosiert med dårlig prognose i galleblæren kreft [43]. Til slutt,
CD9
spiller en rolle i mange cellulære prosesser, inkludert differensiering, adhesjon, signaltransduksjon, vekst, og i undertrykkelse av kreftcelle motilitet og metastasering. Miyake
et al
vist at pasienter med invasive duktale karsinomer redusert uttrykk for
CD9
protein var assosiert med dårlig prognose [44]. IHC flekker Resultatene bekreftet sammenhenger mellom
LGALS8, RAB17 Hotell og
EpCAM Hotell og overlevelse av nyrekreft pasienter som behandles med sunitinib, mens CD9 mislyktes i å oppnå betydelig diskriminerende potensial.
ifølge resultatene av vår studie disse genene kan representere nye kandidater til å identifisere pasienter som kan ha nytte av sunitinib terapi. Mens immunhistokjemisk analyse validert 3 av de 4 biomarkør kandidater, vil en større klinisk studie være nødvendig for å strengt beregne kraften og bekrefte sin klinisk betydning.
I det siste tiåret, onkogen avhengighet har blitt anerkjent som en av de nøkkelfaktorer for kreft evolusjon som også kan markere veier og gener for målrettet terapi [45]. Men på grunn av tilpasning av kreftceller, kan medikamentavhengighet som følge av intensiv behandling vinne oncogenet avhengighet som er nylig blitt demonstrert i lungecancercellelinjer [46]. For å forstå disse prosessene, identifisering av gener, som har en funksjonell rolle i resistens mot flere målrettet terapi midler, er av høy prioritet.
Til tross for lignende virkningsmekanisme, ikke-genet ble identifisert til å være korrelert med følsomheten mot alle fem agenter i vår studie. To gener,
ANXA3 Hotell og
RAB25
var knyttet til fire narkotika.
Annexin 3 plakater (ANXA3) spiller en rolle i cellevekst og signaltransduksjon [47], og ble tidligere knyttet til platina motstand i eggstokkreft [48]. Produktet av
ANXA3
genet ble også identifisert som en av de tyrosin-fosforylering mål av EGFR ved immunpresipitering og western blotting [49].
ANXA3
ble identifisert som en av de fire nedregulert gener involvert i prostata kreft progresjon i en fersk studie som sammenlignet EGFR muterte og ikke-muterte tumorer [50]. Våre resultater antyder muligheten for involvering av
ANXA3
i pante trasé slik at kreftcellene å omgå TKI behandling.
RAB25
er medlem av RAS onkogen familien. Tap av
RAB25
var forbundet med menneske kolorektal adenokarsinomer [51] og trippel-negativ brystkreft [52], men genet har ennå ikke undersøkt i forhold til tyrosinkinase motstand. Fremtidige studier med pasienter med samtidig sekvensert tyrosin kinaser og RAS signalveien medlemmer er nødvendig for å vurdere dens relevans i målrettet terapi.
I sammendraget presenterer vi en omfattende analyse rørledning for fremtidige studier av de undersøkte tyrosinkinasehemmere. Som et bevis på prinsipp valgte vi et sett av gener assosiert med sunitinib motstand (agenten med minst publiserte prediktive biomarkører) for testing i en klinisk kohort.
Hjelpemiddel Informasjon
Tabell S1.
Normalisert microarray data av alle genene i alle cellelinjer.
doi: 10,1371 /journal.pone.0059503.s001 plakater (XLSX)
Tabell S2.
Liste over de som er valgt for QRT-PCR validering gener.
