Abstract
Mutasjoner i Wnt /beta-catenin veien er til stede i de fleste av alle sporadiske kolorektal kreft (CRC), og histondeacetylase hemmere indusere apoptose i CRC celler med slike mutasjoner. Dette apoptose motvirkes av (1) den signaliserte heterogeniteten av CRC cellepopulasjoner, og (2) overlevelsesreaksjonsveier indusert av mitogener utskilt fra apoptotiske celler. Fenomener av signale heterogenitet og apoptose indusert overlevelse utgjør de umiddelbare mekanismene for resistens mot histondeacetylase hemmere, og sannsynligvis andre kjemoterapeutika. Vi utforsket strategi for å forsterke CRC celledød ved å hemme alle overlevelses trasé indusert av pro-apoptotiske middel LBH589, en histondeacetylase inhibitor: AKT, JAK /STAT, og ERK signalering. Den apoptose fremmende evnen til en cocktail av syntetiske inhibitorer av proliferasjon ble sammenlignet med virkningene av de naturlig produkt propolis. Vi utnyttet kolorektal adenom, narkotika-sensitive og resistente tykktarmskreft celler å evaluere apoptotiske potensialet i kombinasjonsbehandlinger. Resultatene tyder på at en effektiv tilnærming til CRC kombinasjonsbehandling er å kombinere apoptose-induserende legemidler (f.eks histondeacetylase hemmere, som LBH589) med midler som demper alle kompenserende overlevelses trasé indusert under apoptose (for eksempel cocktail av hemmere av apoptose- assosiert spredning). Det samme paradigmet kan brukes på en CRC forebyggende metode, som den apoptotiske virkning av butyrat, et diett-avledet histone deacetylase-inhibitor, er utvidet med andre kosttilskudd midler som modulerer overlevelsesreaksjonsveier (f.eks propolis og kaffeekstrakt). Dermed kan kosttilskudd komponert av gjærings fiber, propolis, og kaffe ekstrakt effektivt motvirke neoplastisk vekst i tykktarmen
Citation. Bordonaro M, Drago E, Atamna W, Lazarova DL (2014) Omfattende Suppression of All apoptose indusert Formerinasanalyse Pathways som en foreslått tilnærming til Colorectal Cancer Prevention and Therapy. PLoS ONE 9 (12): e115068. doi: 10,1371 /journal.pone.0115068
Redaktør: Maria Cristina Vinci, Centro Cardiologico Monzino, Italia
mottatt: 11 juli 2014; Godkjent: 18 november 2014; Publisert: 11.12.2014
Copyright: © 2014 Bordonaro et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle relevante data er innenfor papir
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health (1R15CA152852-01, Lazarova). Den Funder hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet. Ingen ekstra ekstern finansiering ble mottatt for denne studien
Konkurrerende interesser:. M. Bordonaro, W. Atamna, og E. Drago har ingen konkurrerende interesser. Darina L. Lazarova har fått forskningsmidler fra Manuka Health New Zealand, Ltd, og hun er en av oppfinnerne av patentsøknad PCT /NZ2014 /000 060 innlevert via Patent Cooperation Treaty på vegne av Manuka Health New Zealand, Ltd, «Therapeutics komposisjoner og bruker dette «. Darina L. Lazarova har ingen økonomisk interesse i denne patentsøknaden. Det finnes ingen tekniske kontorer, arbeidsplasser, produkter under utvikling eller markedsført produkter å erklære. De erklærte konkurrerende interesser endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
forbedring av anti-kreft forebyggende og terapeutiske strategier har redusert kreftrelatert dødsfall med 20% de siste 20 årene [1]. I tillegg er begrepet onkogenet avhengighet [2] påvirket utviklingen av molekylært målrettet terapi. Men de fleste av disse behandlinger forlenge livet til kreftpasienter i gjennomsnitt etter noen få måneder [3]. En årsak til dette resultatet er at svulster utviser resistens mutasjoner som enten er forhånds-eksisterende i et lavt antall kreftceller før behandling, eller er ervervet etter legemiddeladministrasjon [3]. I fravær av resistensgivende mutasjoner, kreftceller også tilpasse seg det selektive medikamenttrykket ved å regulere sine signal- nivåer. For eksempel
BRAF
-mutant melanomceller eksponert for vemurafenib utvikle resistens mot agenten ved oppregulering deres BRAF uttrykk [4]. Tilsvarende EGFR-mutant lungekreftceller behandlet med en EGFR-inhibitor nedregulere PTEN og øke AKT overlevelse signale [5]. Derfor bør utformingen av anti-cancer-terapier ta hensyn til ikke bare den mutasjons landskapet i en svulst, men også cellesignale heterogenitet som eksisterer selv blant genetisk identiske kreftceller [6]. Signalerings heterogenitet er en komponent i den umiddelbare resistensmekanismer (IMR).: Dette er endringene i signaleringskaskader som forekommer innen 24 timer etter behandling og tillater en brøkdel av en kreftcellepopulasjon til å overleve medikamentbehandling
CRC celler utsatt for histondeacetylase hemmere (HDACis) også utviser IMR. Vi har gitt bevis for at HDACis indusere apoptose av CRC celler delvis gjennom hyperaktive av WNT /catenin signal [7]. Men CRC celle populasjoner er heterogene i form av WNT /catenin nivåer, og celler som ikke hyperinduce veien, overleve eksponering for HDACis [7], [8]. Den signaliserer heterogenitet av cellepopulasjoner er ikke på grunn av eksistensen av celle subpopulasjoner med forhåndsbestemte nivåer av WNT /catenin aktivitet. Dermed har vi flowcytometri-sortert enkelt CRC celler med høy WNT /catenin signalnivåer, og funnet ut at de resulterende klonale bestandene er så heterogene i Wnt signale nivå som den overordnede befolkningen (data ikke publisert). Denne heterogeniteten er sannsynligvis opprettholdes ved sideveis inhibering [9], en innføring av en bestemt skjebne etter noen få celler fra en gruppe av tilsvarende celler [10]. I denne prosessen, er stokastiske variasjoner i ekspresjon av reseptoren HAKK og dets ligander på tilstøtende celler forsterket gjennom celle-til-celle-interaksjoner. Samspillet mellom HAKK og dets ligander føre til frigjøring av sine intracellulære domener. Cellene med høyere nivåer av HAKK intracellulære domenet undertrykke WNT aktivitet; mens de celler med høyere nivåer av HAKK ligander øke WNT aktivitet [9]. I normale tarmceller, bidrar side hemning til terminal differensiering [11]; imidlertid, i CRC-celler, støtter lateral inhibering aliserte heterogenitet uten terminal differensiering. Lignende signale heterogenitet er blitt observert
in vivo product: [12] – [15]
Den andre komponenten i IMR er den apoptose-indusert proliferasjon, et fenomen som støttes av de apoptotiske celler som skiller ut. mitogener. Disse mitogener stimulere proliferasjon av overlevende celler i en hvilken som helst apoptotiske befolkning [16] – [21]. Vi har funnet at i CRC-cellepopulasjoner som gjennomgår HDACi-utløste apoptose, er det økt ekspresjon av mitogener og en påfølgende induksjon av overlevelses flere signalveier [9], [22]. Her rapporterer vi en strategi for å hindre omfattende alle overlevelses trasé, og forbedre apoptotisk respons på CRC celler til både syntetiske og diett-avledet HDACis (f.eks LBH589 og smørsyre).
Materialer og metoder
1. Cellekultur, rekombinante plasmider, og kjemikalier
Den humane cellelinje CRC HCT-116 ble oppnådd fra American Type Culture Collection (Rockville, MD). HCT-116 cellelinjen ble genotypet ved korte tandem repeat analyse. Den samme analysen av HCT-R celler bekreftet at disse cellene er knyttet til foreldre HCT-116 celler. Cellelinjen HCT-R var avledet fra HCT-116 ved dyrkning av sperre cellene i økende konsentrasjoner av butyrat som tidligere beskrevet [8]. HCT-116 og HCT-R-cellelinjer ble dyrket i a-MEM-medium med 10% føtalt bovint serum (FBS). Menneske colonic microadenoma LT 97 celler var en slags gave fra Dr. B. Marian (Institute of Cancer Research, Medical University Wien, Østerrike). LT-97-celler ble dyrket som tidligere beskrevet [23], [24]. De følgende cellelinjer ble dyrket i a-MEM med 10% FBS: human småcellet karsinom binyrene /cortex SW13 celler (minus fenotype, isolert ved fortynning kloning fra en heterogen prøve ATCC CCL105 i laboratoriet til Dr. Elizabeth Hull, Midwestern Universitet , AZ), human neural crest-avledet ikke-nevronale stamceller LA1-5s celler (gitt av Dr. R. Ross, Fordham University, New York), normal human fetal colonic celler CCD841CoN ((ATCC CRL-1790), humane embryonale nyre epitelial HEK293T celler (ATCC CRL-1573), og mus embryonale fibroblaster CCL92 (ATCC CCL-92). Sodium butyrate ble hentet fra Sigma, koffeinsyre phenethyl ester (CAPE) -enhanced propolis (propolis med Cyclopower, med CAPE på 6 mg /g ) fra Manuka Health New Zealand Ltd, AZD6244, LBH589, og MK2206 fra Selleck Chemicals, pyridone 6 fra Santa Cruz Biotechnology, fryse tørket pulverkaffe (The Daily Chef, Sams West, Inc.). Alle agenter unntatt smørsyre ble suspendert i dimetylsulfoksid , og stamløsninger ble holdt ved -80 ° C. Butyrat ble oppløst i vann og lagret som 1,0 M stam ved 4 ° C. Uekte behandling inkludert dimetylsulfoksid i et volum som tilsvarer denne av behandlinger med midler oppløst i dimetylsulfoksyd.
2. Western blot analyser og antistoffer
Western blot analyser ble utført som rapportert tidligere [25]. Følgende antistoffer ble brukt: et antistoff til fosfor-P44 /42 MAPK (ERK1 /2) (Thr202 /Tyr204) (# 4370, Cell Signaling Technology), et antistoff som gjenkjenner fosfor-Stat3 (Tyr705) (# 9145, Cell Signaling Technology ), anti-Ser473-fosforylert AKT (sc-7985, Santa Cruz Biotechnology), anti-AKT (sc-8312, Santa Cruz Biotechnology), anti-beta ACTIN (A5441, Sigma-Aldrich), anti- ERK (# 9102, Cell Signaling Technology), anti- STAT3 (# 9139, Cell Signaling Technology), anti-pcJUN og c-juni (sc-16312-R og sc-45, Santa Cruz Biotechnology). Alle antistoffer ble benyttet til å jobbe fortynning av 1:1,000, bortsett fra anti-Actin antistoff som ble benyttet ved 1:5,000 fortynning. Lysater ble oppnådd ved hjelp av to forskjellige metoder: ved å benytte en natriumdodekylsulfat-holdig lyseringsbuffer og kvantifisere proteinkonsentrasjonen [25], eller ved lysering av like antall celler (10
6) direkte i Laemmli-buffer. Rutinemessig ble cellene sådd ut en dag før behandlingen, og eksponert i 17 eller 20 timer med LBH589 (50 nM), MK2206 (1 uM), AZD6244 (0,5 uM), pyridon 6 (1 uM), kaffeekstrakt (1 mg /ml), propolis (100 ug /ml), eller butyrat (5 mM). Kvantifisering av de vestlige blot bildene ble utført med ImageJ programvare (public domain programvare utviklet av forskningstjenester grenen av National Institute of Mental Health, Bethesda, MD, USA).
3. Apoptotiske og klonal vekst analyser
CRC celler ble belagt 24 timer før analyser i 24-brønners plater på 70 000 per brønn, og som utsettes for behandlinger i 24 timer (f.eks LT97 og HCT-116 celler) eller 48 timer (HCT-R-celler). Alle celler (flytende og vedlagt) ble høstet og farget for apoptotiske og nekrotiske markører med PE Annexin V apoptose Detection Kit I (BD Biosciences, # 559763). Flowcytometri analyser ble utført med FACS Aria II og DiVa programvare; vi analysert totalt 50.000 hendelser per prøve. Prosent apoptose ble beregnet ved å dividere antall av apoptotiske celler ved det totale antall celler som ble analysert og multiplisere forholdet med 100. For klonal vekstanalyser, enkeltceller ble platet ved 100-200 celler pr brønn i en seks-brønns plate og behandlet med agenten (e) i 24 timer. Kolonier ble tellet ved 14 til 20 dager etter fjerning av løsningsmiddel (e). Alle forsøkene ble utført fire til seks ganger med tredoble prøver per eksperiment.
4. Statistikker og
Alle data ble presentert som gjennomsnitt ± standardavvik fra minst tre sett av uavhengige eksperimenter. Uparet student t-test-analyse ble brukt for å bestemme betydningen av statistiske forskjeller. Forskjeller ble betraktet som signifikant ved P 0,05. For klonale vekst og apoptotiske analysene ble statistiske forskjeller mellom konsern midler bestemmes av enveis-of-varians (ANOVA) med GraphPad Prism 6 programvare, og post-test beregninger som brukte Bonferronikorreksjon å justere for multiple sammenligninger med 95 % sikkerhet.
Resultater
1. Utvikling av inhibitor cocktail av apoptose-indusert spredning (ICAP)
Vi har vist at HDACis indusere apoptose av CRC celler med mutasjoner i Wnt /catenin sti [7], og nivåene av celledød er utvidet ved å undertrykke induksjon av AKT signalering [22], [26]. For å analysere alle overlevelsesveier indusert i apoptotiske CRC cellepopulasjoner, benyttet vi HCT-R celler som er relativt HDACi motstandsdyktig i forhold til foreldre HCT-116 celler [8]. Vi bestemte muligheten av en inhibitor cocktail av apoptose-assosiert spredning (ICAP) for å forsterke apoptose i CRC cellepopulasjoner som utsettes for LBH589, en HDACi som er i kliniske studier. For å finne den kliniske relevansen av tidligere funn [22], [26], ansatt vi farmakologisk relevante konsentrasjoner av LBH589 (50 nM) og hemmere av overlevelses trasé [27], [28]. HCT-R celler eksponert for LBH589 utstilt økte nivåer av tre overlevelses trasé formidlet av fosforylert AKT, STAT3 og ERK1 /2 signalmolekyler (Fig.1A). LBH589-behandlede celler viste 15,5 ± 2,8% apoptose, og tillegg av MK2206, en pakt inhibitor, nesten tredoblet nivåene av apoptose til 42,5 ± 8,6%, p = 0,007 (Fig.1B). Dette funnet er i samsvar med observasjoner som undertrykke Pakt nivåer av MK2206 eller koffeinsyre phenethyl ester forsterker apoptose i CRC celler [22]. Tilsetning av pyridon 6, et JAK /STAT-inhibitor, og AZD6244, en adenosin trifosfat-ikke-konkurrerende inhibitor av MEK1 /2 [29], [30] økt apoptose ytterligere. Eksponering for den ICAP alene resulterte i apoptose på 14,0 ± 4,0%, sammenlignet med 7,1 ± 2,0% apoptose indusert ved uekte behandling. Ordinær enveis ANOVA viste statistisk signifikante forskjeller mellom gruppen betyr, F (5,12) = 38,56, P 0,0001. Post-test beregninger med Bonferroni korreksjon for å justere for multiple sammenligninger med 95% sikkerhet indikerte statistisk signifikante forskjeller (P 0,05) i den apoptotiske nivåer mellom uekte behandling og alle tre kombinasjonsbehandling med LBH589, så vel som mellom LBH589 behandling og alle tre kombinasjoner behandlinger med LBH589. Det var ingen statistisk signifikante forskjeller mellom de apoptotiske nivåer av mock-, LBH589-, og ICAP – behandlede celler. Det var ingen statistisk signifikante forskjeller i apoptose indusert av LBH589 + MK2206 og de andre to kombinasjon LBH589 behandlinger, samt mellom LBH589 + MK2206 + pyridone6 og LBH589 + ICAP.
A. Western blot analyser av HCT-R CRC-celler eksponert for håne (C) behandling, 50 nM LBH589 (L), 1 uM MK2206 (M), 0,5 uM AZD6244 (A), eller 1 uM pyridon 6 (P) i 20 timer. Samme antall celler ble lysert direkte i Laemmli-buffer og analysert for ekspresjonsnivåene av fosforylerte og totale nivåer av AKT, ERK1 /2, og STAT3. B. apoptotisk analyser av HCT-R-celler eksponert i 48 timer til behandlingene som er beskrevet i (A). Stjerne indikerer statistisk signifikante forskjeller (P 0,05) mellom de apoptotiske nivåer. Andre statistisk signifikante forskjeller er angitt i teksten.
2. Propolis forsterker apoptose indusert av LBH589 eller 5-fluorouracil i CRC celler
Propolis, en honningbie produkt, forsterker apoptose indusert av diett-avledet HDACi butyrate via delvis undertrykkelse av AKT og JAK /STAT signalering [26]. Derfor tenkte vi at propolis kan forsterke LBH589-indusert apoptose via den samme mekanismen. Å sammenligne evnen til propolis og ICAP å undertrykke apoptose-indusert overlevelse trasé, utsettes vi HDACi-resistente HCT-R celler til å spotte behandling, LBH589, LBH589 + propolis, eller LBH589 + ICAP. Tilsetning av propolis forsterket LBH589-indusert apoptose fra 16,5 ± 2,0% til 30,1 ± 4,5%, P = 0,013 (Fig.2A); mens, tilsetning av ICAP forbedrede LBH589-indusert apoptose fra 16,5 ± 2,0% og 60,0 ± 10,6%, P = 0,004 (Fig.2A). Ordinær enveis ANOVA viste statistisk signifikante forskjeller mellom alle gruppe betyr, F (5,12) = 39,35, P 0,0001. Post-test beregninger med Bonferroni korreksjon for å justere for multiple sammenligninger med 95% sikkerhet avdekket statistisk signifikante forskjeller (P 0,05) i apoptotiske nivåer mellom uekte behandling og de to LBH589 kombinasjonsbehandlinger, men ikke LBH589 alene. Signifikante forskjeller ble også notert for de apoptotiske nivået indusert av LBH589 og LBH589 + ICAP, samt av LBH589 + propolis og LBH589 + ICAP. Det var ingen statistisk signifikant forskjell mellom apoptose av celler eksponert for håne, propolis, eller ICAP behandling. Western blot analyser avslørte at i LBH589 behandlet HCT-R celler, co-behandling med propolis redusert pSTAT3 nivåer ved seks-fold og Pakt nivåer med 1,7 ganger; mens, samtidig behandling med ICAP resulterte i ikke målbare nivåer av både pSTAT3 og Pakt (Fig.2B). Den mest påfallende forskjell mellom de to kombinasjonsbehandlingene med LBH589 var at i forhold til eksponeringen for LBH589 alene, tilsetning av propolis økte pErk1 /2 nivåer med 20%; mens redusert ICAP pErk1 /2 plan med åtte ganger (Fig.2B).
A. HCT-R eller HCT-116 celler ble eksponert i 48 timer eller 24 timer henholdsvis, for å håne (M), 50 nM LBH589 (L), LBH589 og 100 ug /ml propolis (LP), LBH589 og ICAP (LC), 100 ug /ml propolis (P), eller ICAP alene (C). B. HCT-R-celler ble utsatt for de behandlinger som er beskrevet i A i 17 timer. og totale cellelysatene ble analysert ved western blotting. C. HCT-R og HCT-116 celler ble eksponert i 48 timer eller 24 timer henholdsvis, for å håne (M), 10 uM 5-fluorouracil (F), 5-fluoruracil og 100 ug /ml propolis (FP), 5- fluorouracil og ICAP (FC), propolis (p), eller den ICAP alene (C).
HCT-R cellene er relativt motstandsdyktig mot apoptotiske virkninger av HDACis delvis på grunn av deres oppregulert overlevelse signalering til og med i fravær av behandling [8], [22]. For å vurdere betydningen av overlevelse trasé i HDACi-sensitive CRC celler, benyttet vi HCT-116 celler, hvorfra HCT-R-celler ble avledet [8]. I HCT-116 celler, behandling med LBH589 alene resulterte i en seks-dobling av apoptose (mock behandling resulterte i 10,4 ± 1,8% apoptose, og LBH589 eksponering på 50 nM førte til 64,2 ± 10,0% apoptose, P = 0, fig. 2A). Tilsetting av propolis eller ICAP utvidet ytterligere apoptotisk effekt av LBH589: eksponering for LBH589 + propolis resulterte i 81,3 ± 6,3% apoptose (P = 0,072), og LBH589 + ICAP førte til 96,0 ± 1,5% apoptose (P = 0,006), Fig.2A. Enveis ANOVA viste statistisk signifikante forskjeller mellom gruppen betyr, F (5,12) = 162,1, P 0,0001. Post-test beregninger med Bonferroni indikerte statistisk signifikante forskjeller (P 0,05) i apoptotiske nivåer mellom uekte behandling og alle tre behandlinger som inkluderte LBH589. De samme signifikante forskjeller ble kjent for de apoptotiske nivåer indusert av propolis eller ICAP, og alle tre behandlinger som inkluderte LBH589. Det var ingen statistisk signifikant forskjell mellom de apoptotiske nivåer av celler eksponert for narr, propolis, eller ICAP behandling
LBH589 er svært effektiv i å indusere apoptose av CRC celler med mutasjoner i Wnt /catenin vei.; imidlertid, er det midlet fremdeles i kliniske forsøk. Derfor spurte vi om propolis og ICAP augment apoptose indusert av 5-fluorouracil, en stor del av dagens anti-CRC terapeutiske regimer. 5-fluorouracil (5-FU) induserer lave nivåer av apoptose i HCT-116-celler ved uoppnåelig
in vivo
konsentrasjon på 10 uM (mock-celler utviser 10,4 ± 1,8% apoptose, og 5-FU-behandlede celler . – 33,1 ± 3,2% apoptose, P = 0, Fig.2C på samme konsentrasjon agenten ikke induserer signifikante apoptose i HCT-R-celler: mock-behandlede celler utviser 7,1 ± 1,8% apoptose, og 5-FU-behandlede cellene – 9,5 ± 1,3% apoptose, p = 0,14, Fig.2C det kombinerte påvirkning av HCT-116-celler til 5-FU + propolis eller 5-FU + ICAP økte ikke signifikant de apoptotiske nivåene sammenlignet med behandling med 5-FU. alene: 5-FU eksponering førte til 33,1 ± 3,2% apoptose, 5-FU + propolis behandling førte til 33,2 ± 3,8% apoptose, og 5-FU + ICAP – til 35,5 ± 9,0% apoptose (Fig.2C) Ordinær en-. veis ANOVA viste statistisk signifikante forskjeller mellom gruppen betyr, F (5,12) = 18,31, P . 0,0001 Post-test beregninger med Bonferroni korreksjon for å justere for multiple sammenligninger med 95% sikkerhet indikerte statistisk signifikante forskjeller (P 0,05) i apoptotiske nivåer mellom uekte behandling og alle tre behandlinger som inkluderte 5-FU. Den samme signifikant forskjell ble observert for de apoptotiske nivået indusert av propolis eller ICAP sammenlignet med de tre behandlinger som inkluderte 5-FU
Både propolis og ICAP doblet apoptotisk respons av HCT-R-celler til 5-FU.: sammenlignet med 5-FU alene, 5-FU + propolis behandling førte til 23,1 ± 3,6% apoptose, P = 0,003 og 5-FU + ICAP – 22,3 ± 2,2% apoptose, p = 0,001, Fig.2C. Enveis ANOVA av apoptotiske nivåer av HCT-R celler eksponert for kombinasjonsbehandling med 5-FU og ICAP eller propolis avdekket statistisk signifikante forskjeller mellom gruppen betyr: F (5,12) = 28,81, P 0,0001. Post-test beregninger med Bonferronikorreksjon indikerte statistisk signifikante forskjeller (P 0,05) i apoptotiske nivåer mellom uekte behandling og 5-FU + propolis, mellom mock behandling og 5-FU + ICAP, og mellom 5-FU behandling og kombinasjonsbehandlinger av 5-FU + propolis og 5-FU + ICAP. Det var ingen statistisk signifikant forskjell mellom de apoptotiske nivåer av mock og 5-FU-behandling.
3. Målrette apoptose-forbundet spredning som tykktarmskreft forebyggende tilnærming
Mens den kliniske anvendelsen av ICAP og propolis supplement for å styrke anti-kreft terapi vil kreve validering gjennom randomiserte kliniske studier, bruk av en diett-baserte supplement i CRC forebygging er mer håndgripelig. Butyrat, et fermenteringsprodukt av fiber i tykktarmen og en HDACi, induserer apoptose i de fleste CRC-cellelinjer, og denne effekten kan delvis forklare den beskyttende rollen av fiber mot CRC [31]. I likhet med apoptose indusert av LBH589, blir apoptose initiert av butyrat motvirket av overlevelse signalering. Derfor kan en CRC forebyggende tilnærming kombinere smørsyre med hemmere av overlevelse trasé. Propolis forsterker smørsyre-indusert apoptose ved å undertrykke to overlevelse veier: AKT og JAK /STAT [26]; men i våre analyser av LBH589 behandlet CRC celler, propolis ikke bare ikke undertrykke, men i virkeligheten, utvidet pErk1 /2 plan. Siden undertrykkelse av ERK signal av MEK1 /2-hemmer AZD6244 forbedret apoptotisk effekt av LBH589 (Fig.1B), begrunnet vi at smørsyre /propolis-indusert apoptose kan være like forsterket ved å målrette ERK signal med diett-avledet forbindelser. Basert på et litteratursøk, fokuserte vi på flere rapporterte diett-avledet ERK1 /2-hemmere, blant disse var ursolic syre, curcumin, sulforaphane og kaffe. Fra skjermet forbindelser ingen trykkes pErk1 /2 plan i smørsyre /propolis-behandlede CRC celler; Men tilsetningen av kaffeekstrakt økt apoptose av HCT-R-celler (Fig.3A). Enveis ANOVA viste statistisk signifikante forskjeller mellom gruppen betyr: F (7,25) = 50,96, P 0,0001, (Fig.3A). Post-analyser med Bonferroni korreksjon ble utført for alle åtte grupper av behandlinger; Men vi fokusert på om du legger kaffe ekstrakt som tidligere karakteriserte og rapportert av oss kosttilskudd agenter påvirket apoptotiske nivåer av HCT-R celler. Derfor fant vi ut at det var statistisk signifikante forskjeller (P 0,05) i apoptotiske nivåer mellom følgende behandlinger: butyrate versus butyrate + kaffe, smørsyre + propolis versus butyrate + propolis + kaffe, og propolis versus propolis + kaffe. De to regimer som forårsaket de høyeste nivåene av apoptose i HCT-R celler, propolis + kaffe og smørsyre + propolis + kaffe, redusert pSTAT3 til undetectable nivåer og Pakt nivåer av tre ganger (Figs.3A og 3D).
A-C. Celler ble utsatt for håne (M), 5 mM butyrat (B), 1 mg /ml brente kaffeekstrakt (R), 100 ug /ml propolis (P), butyrat og kaffeekstrakt (BR), butyrat og propolis (BP) , propolis og kaffe ekstrakt (PR), eller smørsyre, propolis og kaffe ekstrakt (BPR). Apoptose ble målt ved strømningscytometri, som beskrevet i Materialer og Metoder. D-F. Celler ble utsatt for behandlinger som beskrevet ovenfor i 17 timer, og de totale cellelysatene ble analysert ved western blotting.
HCT-R-celler som sannsynligvis representerer de sene stadier av neoplastisk utvikling, når medikamentresistens er etablert. Men det er mer relevant å teste CRC forebyggende strategi i celler som representerer tidligere neoplastiske stadier. Derfor, analyserte vi effektene av diett-avledede midler i LT97 cellelinje etablert fra en human colonic microadnoma [23], [24], og HCT-116 colon carcinoma-celler som er følsomme overfor kjemoterapeutiske medikamenter. I forhold til HCT-R-celler, både LT97 og HCT-116 cellelinjer er mer følsomme for butyrat-indusert apoptose; Derfor har vi målt apoptose etter 24 timer etter administrering av forskjellige regimer. I HCT-116 celler, smørsyre behandling resulterte i 36,8 ± 3,4% apoptose i forhold til mock celler som viste 8,8 ± 0,4% apoptose (Fig.3B). De høyeste nivåene av apoptose ble oppnådd ved kombinasjoner av smørsyre + propolis (46,0 ± 2,0%), smørsyre + kaffe (65,8 ± 3,5%), og smørsyre + propolis + kaffe (73,9 ± 3,7%); de samme kombinasjonene av midler også undertrykt nivåene av pSTAT3 (Fig.3E). Enveis ANOVA for nivåene av apoptose av HCT-116 celler eksponert for diettmidler avdekket statistisk signifikante forskjeller mellom gruppen betyr: F (7,23) = 168,7, P 0,0001. Post-test beregninger med Bonferroni korreksjon for å justere for multiple sammenligninger med 95% sikkerhet indikerte statistisk signifikante forskjeller (P 0,05) i apoptotiske nivåer mellom alle behandlinger unntatt butyrate behandling i forhold til smørsyre + propolis, smørsyre behandling sammenlignet med propolis + kaffe, og smørsyre + kaffe behandling i forhold til smørsyre + kaffe + propolis
Vi har tidligere slått fast at LT97 celler er svært følsomme for wnt signalehyperaktive og cellevekst arrest i nærvær av smørsyre [32].; i disse cellene, mock behandling fører til 12,2 ± 0,7% apoptose, og smørsyre eksponering i 27,8 ± 5,0% apoptose. Eksponering av LT97 celler til propolis + kaffe eller propolis + butyrate resulterte i statistisk sammenlignbare nivåer av apoptose: 22,1 ± 4,7% og 25,6 ± 2,1%, henholdsvis. De høyeste nivåene av apoptose ble oppnådd ved kombinasjonsbehandlingene butyrat + kaffe (34,7 ± 5,7%) og butyrat + kaffe + propolis (47,9 ± 8,2%), og det var ingen statistisk signifikant forskjell i den apoptotiske nivåene oppnådd ved de to behandlinger ( P = 0,08). One-Way ANOVA for nivåene av apoptose av LT97 celler eksponert for diettmidler avdekket statistisk signifikante forskjeller mellom gruppen betyr: F (7,16) = 22,57, P 0,0001. Post-test analyser av behandlinger som inkluderte kaffe ekstrakt indikerte at det var ingen statistisk signifikante forskjeller mellom de apoptotiske nivåer av celler eksponert for smørsyre versus butyrate + kaffe, og propolis versus propolis + kaffe; Det var imidlertid en statistisk signifikant forskjell mellom apoptose indusert ved butyrat + propolis og butyrat + propolis + kaffe (P 0,05). Under betingelsene som brukes, har vi ikke kunnet påvise pSTAT3 nivåer i LT97 celler; imidlertid eksponering for smørsyre + propolis + kaffe ekstrakt økte Perk til detekterbare nivåer sammenlignet med mock-behandlede celler (Fig.3F). Tilsvarende eksponering av HCT-116 celler til smørsyre + propolis + kaffe ekstrakt økte Perk nivåer av todelt; imidlertid, slik effekt ble ikke observert i HCT-R-celler (Figs.3A, B). Vi har også analysert nivåene av pc-juni, da denne veien kan påvirke apoptose og celleoverlevelse. I alle celler, totalt c-Jun nivåene økte med behandlinger, og pc-JUN nivåer reflektert tett denne økningen (Figs.3D, E, F).
For å teste effekten av kaffe på ulike nivåer, vi utsatt HCT-116-celler til 0,25, 0,5 og 1 mg av kaffeekstrakt per milliliter medium. Den høye dosen av en milligram per milliliter var basert på kaffe inntak studier med ileostomi frivillige [33], og den gjennomsnittlige samlede volum av fluider i mage, tynntarm, tykktarm og [34]. Ved 1 mg /ml, kaffe-ekstrakt resulterte i 23,7 ± 4,6% apoptose sammenlignet med uekte behandling, 8,4 ± 0,4% apoptose (P = 0,001), Fig.4A. Behandling av cellene med butyrat + propolis resulterte i 39,3 ± 5,1% apoptose, og tilsetning av 0,25, 0,5 eller 1,0 mg /ml kaffeekstrakt økt apoptose til 51,8 ± 5,7% (p = 0,017), 64,8 ± 3,2% (P = 0), eller 77,4 ± 4,1% (P = 0), respektivt, Fig.4A.
A. HCT116-celler ble eksponert i 24 timer for å håne (M), 1 mg /ml brente kaffeekstrakt (R), 5 mM butyrat og 100 ug /ml propolis (BP), eller butyrat /propolis og økende konsentrasjoner av kaffeekstrakt: 0,25, 0,5 eller 1,0 mg /ml. Apoptose ble målt ved strømningscytometri, som beskrevet i Materialer og Metoder. B. HCT-116 celler ble behandlet som i (A) i 17 timer og de totale cellelysatene ble analysert ved western blotting. C. HCT-116 og LT 97 celler ble eksponert i 20 timer, og HCT-R-celler ble eksponert i 42 timer for å håne (M), 0,5 uM AZD6244 (A), kombinasjonen; 5 mM butyrat, 100 ug /ml propolis, 1 mg /ml brente kaffeekstrakt (BPR), eller BPR og 0,5 uM AZD6244 (BPR-A). Apoptose ble målt ved strømningscytometri, som beskrevet i Materialer og Metoder. Statistisk signifikante forskjeller i apoptotiske nivåer er registrert med stjerner (P 0,05). D. Klonal vekst analyser. Prosent klonal vekst ble beregnet ved å dividere antall cellekolonier med antall belagte celler, og multiplisere med 100. Forholdet mellom klonal vekst ble beregnet ved å dividere prosent klonal vekst i mock-behandlede sampler med det prosentvise klonal vekst i agent- behandlede prøver. Forsøkene ble gjentatt fire til seks ganger med tredoble prøver per eksperiment. Statistisk signifikante forskjeller mellom cellelinjer i deres midlere forhold ble bestemt ved en-veis ANOVA. For celler utsatt for smørsyre, F (6,31) = 10,26, P 0,0001; for celler eksponert for propolis og kaffe ekstrakt, F (6,28) = 5,493, P = 0,0007, og for celler eksponert for smørsyre, propolis og kaffe ekstrakt, F (6,26) = 10,56, P 0,0001. Den post-test beregninger brukt Bonferronikorreksjon å justere for multiple sammenligninger med 95% sikkerhet. Blant de cellene eksponert for smørsyre, statistisk signifikante forskjeller (P 0,05, KI 95%) ble påvist i HCT116 vs. CCL92, HCT116 vs. HEK293, HCT116 vs. SW13, HCT116 vs. LA1-5s, HCT116 vs. HCT-R
