Abstract
Anti-mesothelin
Pseudo
eksotoksin A-baserte rekombinante immuntoksiner (RITS) presentere en potensiell behandlingsform for bukspyttkjertel duktalt adenokarsinom (PDAC). Å studere mekanismene for resistens, ble den sensitive PDAC cellelinje KLM-en midlertidig utsatt for anti-mesothelin SS1-LR-GGS RIT. Overlevende celler var resistente mot ulike anti-mesothelin RITS (IC
50s 1 mg /ml), inkludert den nye de-vaksinert RG7787. Disse resistente KLM-1-R-celler var like følsom for anti-CD71 HB21 (Fv) -PE40 RIT som KLM-en, noe som indikerer motstand var spesifikke for anti-mesothelin Rits. Mesothelin genekspresjon ble delvis nedregulert i KLM-1-R, noe som resulterer i 5-ganger lavere overflate protein nivå og redusert cellulært opptak av RG7787 forhold til KLM-1. Bisulfitt sekvensanalyse funnet at mesothelin promoter-regionen var signifikant mer metylert i KLM-1-R (59 ± 3,6%) sammenlignet med KLM-1 (41 ± 4,8%), noe som indikerer hypermethylation som en mekanisme for mesothelin nedregulering. DNA-metyltransferase-inhibitor 5-azacytidin gjengitte original mesothelin overflate-ekspresjon i mer enn halvparten i KLM-1-R og økt følsomhet for RG7787 (IC
50 = 722,4 ± 232,6 ng /ml), selv om cellene forble signifikant mindre følsomme enn foreldre KLM-1 celler (IC
50 = 4,41 ± 0,38 ng /ml). Mesothelin cDNA innføring i KLM-1-R førte til fem ganger høyere overflateproteinnivå og betydelig høyere RG7887 opptak sammenlignet med KLM-en. Som et resultat av dette ble den opprinnelige følsomheten til RG7787 fullt restaurert (IC
50 = 4,49 ± 1,11 ng /ml). En signifikant høyere RG7787 opptak ble dermed nødvendig for å nå det opprinnelige cytotoksisitet i resistente celler, antydet at intracellulær RIT menneskehandel er også en begrensende faktor. RNA dyp sekvensering analyse av KLM-en og KLM-1-R celler støttet våre eksperimentelle funn; sammenlignet med KLM-en, resistente celler vises differensial uttrykket av gener knyttet til intracellulær transport og et uttrykk mønster som matchet en mer generell hypermethylation status. I konklusjonen, motstand mot anti-mesothelin RITS i KLM-en er koblet til en metylering-forbundet nedregulering av mesothelin, mens avvik i RIT menneskehandel kan også spille en rolle
Citation. Hollevoet K, Mason- Osann E, Müller F, Pastan i (2015) Metylering-Associated Delvis nedregulering av Mesothelin Årsaker Motstand mot Anti-Mesothelin Immunotoxins i en kreft i bukspyttkjertelen cellelinje. PLoS ONE 10 (3): e0122462. doi: 10,1371 /journal.pone.0122462
mottatt: 23 desember 2014; Godkjent: 17 februar 2015; Publisert: 24 mars 2015
Dette er en åpen tilgang artikkel, fri for all opphavsrett, og kan bli fritt reproduseres, distribueres, overføres, endres, bygd på, eller brukes av alle for ethvert lovlig formål. Arbeidet er gjort tilgjengelig under Creative Commons CC0 public domain engasjement
Data Tilgjengelighet:. Alle relevante data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering: Denne forskningen ble støttet av egenutført Research Program av National Institutes of Health, National Cancer Institute, Senter for kreftforskning, og av en Cooperative Research and Development Agreement (# 2791) mellom National Cancer Institute og Roche Pharmaceuticals. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til PLoS ONE politikk på deling av data og materialer. K.H. ble støttet delvis av Fondet for Scientific Research Flandern (FWO, Belgia). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser. Denne forskningen ble delvis støttet av Roche Pharmaceuticals. I.P. er en oppfinner på flere patenter på immuntoksiner som har alle blitt tildelt NIH (inkludert US 8357783 «Menneske anti-mesothelin monoklonale antistoffer», amerikanske 20120263674 «Pseudomonas eksotoksin en med redusert immunogenisitet» og amerikanske 20140094417 «Pseudomonas eksotoksin en med mindre immunogen T-celle og /eller B-celle-epitoper «). Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Vårt laboratorium utvikler rekombinante immuntoksiner (RITS) for kreftbehandling. Nåværende Rits i kliniske forsøk er sammensatt av et antigen-bindende Fv kondensert til en 38-kDa parti av
Pseudo
eksotoksin A (PE) [1]. Etter reseptormediert endocytose, blir Rits proteolytisk prosessert, og PE er foreslått for trafikk til den trans-Golgi-nettverk og trekk ved en retrograd vei til endoplasmatiske retikulum, hvor det gjennomgår translokasjon til cytoplasma [2]. Ved ankomst i cytosol, rettet mot PE elongeringsfaktor-2 (EF-2). Moden EF-2 fremstilles ved posttranslasjonell modifikasjon av histidin 715 ved Diphthamide biosyntese proteiner (DPH) 1-5 og 7 [3, 4]. Denne modifiserte histidin ( «diphthamide») er ADP-ribosylert av PE, som inaktiverer EF-2 og stopper proteinsyntese, til slutt fører til programmert celledød [2].
Vi tidligere isolert og karakterisert en rekke leukemiske cellelinjer motstandsdyktig mot
Moxetumomab pasudotox product: [5-7], en anti-CD22 RIT nå i fase III klinisk studie (ClinicalTrials.gov Identifier: NCT01829711). Disse resistente cellelinjer viser forskjellige avvik i DPH uttrykk, som hindrer EF-2 ADP-ribosylering og beskytter cellene fra proteinsynteseinhibisjon [5-7]. SS1 (dsFv) -PE38 (SS1P), en annen RIT i kliniske studier, mål mesothelin, en 40-kDa celleoverflaten glycophosphatidylinositol (GPI) -anchored protein [8] som er sterkt uttrykt i flere maligniteter, inkludert mesothelioma og bukspyttkjertelen duktalt adenokarsinom ( PDAC) [9-11]. SS1P har begrenset klinisk aktivitet som monoterapi, først og fremst på grunn av dosebegrensende PE immunogenisitet hos pasienter [12, 13]. Som svar, har SS1P blitt kombinert med immunnedbrytende kjemoterapeutika, som resulterer i enestående respons hos pasienter med refraktær avansert mesothelioma [14], og lav-immunogene RITS er konstruert som mange B- eller T-celle epitoper og protease-sensitive områder av PE38 er fjernet. Den sistnevnte resulterte i en avkortet og de-immunisert 24-kDa toksindelen (PE24) som har mindre reaktivitet med humane anti-sera, er motstandsdyktig mot lysosomal degradering, og viser en redusert ikke-spesifikk toksisitet i gnagermodeller
in vivo product: [15-18]. I samarbeid med Roche Innovation Center Penzberg, Tyskland, har dette PE24 ryggrad blitt integrert i en roman anti-mesothelin RIT, heter RG7787, ved å koble den til en humanisert anti-mesothelin Fab, og dermed øke størrelse og sirkulasjonshalveringstiden [19].
Vi viste nylig at RG7787 har betydelig aktivitet i et PDAC xenograft modell, som ble etablert ved poding KLM-1 celler i immunmangelfull mus. RG7787 var også cytotoksiske mot flere andre PDAC cellelinjer, selv om
in vitro
celle drap var ikke absolutt [19]. Vi har tidligere rapportert at en ubalanse mellom pro- og anti-apoptotiske proteiner beskytter kreftceller, inkludert PDAC, fra PE-indusert celledød [20-22]. For å få innsikt i andre resistensmekanismer, er målet med denne studien var å isolere og karakterisere celler fra KLM-en som var resistente mot anti-mesothelin RITS.
Materiale og metode
Rekombinante immuntoksiner og reagenser
klinisk kvalitet anti-mesothelin SS1P og anti-CD25 LMB-2 [anti-Tac (Fv) -PE38] ble produsert og levert av Advanced BioScience Laboratories, Inc. (Kensington, MD). huSS1 (Fab) -LR-GGS-LO10-PE24 (RG7787) ble levert av Roche Innovation Center Penzberg, Tyskland under en Cooperative Research and Development Agreement (# 2791). Anti-mesothelin SS1 (dsFv) -LR-GGS-PE24 (SS1-LR-GGS) og anti-CD71 immunotoksin HB21 (Fv) -PE40 ble fremstilt i vårt laboratorium, i henhold til en standard protokoll [23]. Både SS1-LR-GGS og RG7787 er re-konstruert lav-immunogene versjoner av SS1P som består av en PE24 fragment. Spesifikke modifikasjoner inkluderer å fjerne mesteparten av PE domene II, og etterlater en Furin cleavage område, og legge en Gly-Gly-Ser (GGS) -basert peptidlinker etter Furin cleavage nettstedet. RG7787 er ytterligere optimalisert for klinisk bruk ved å erstatte til mus anti-mesothelin Fv (SS1) med en humaniserte Fab (huSS1), for å øke størrelsen og derfor sirkulatorisk halveringstid, og ved innføring av syv mutasjoner (R505A, R427A, R490A, R467A, D463A, R456A, og R538A) i det katalytiske domenet III av PE til taushet B-celle epitoper [19]. 5-azacytidin (AZA) (Sigma) er en DNA metyltransferase inhibitor, og ble oppløst i RPMI-1640 medium.
Cell kultur
PDAC cellelinje KLM-1 [24] ble opprettholdt i RPMI-1640 og levert i 2011 av Dr. Udo Rudloff (NCI, Bethesda, MD), som opprinnelig fått cellelinje fra Riken Cell Bank. Epidermoid kreft A431-cellelinjen ble opprettholdt i DMEM og gitt i 1982 av Dr. George Todaro (NCI, Bethesda, MD), som opprinnelig isolerte cellelinjen [25]. Media ble supplert med 10% FBS, 2 mM L-glutamin, 1 mM natriumpyruvat, 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin (Invitrogen). For å isolere resistente celler, 3 x 10
5 KLM-1-celler ble sådd i en 6-brønns plate og inkubert med 1 pg /ml SS1-LR-GGS i 72 timer, som drepte over 90% av cellene (S1 fig.). Gjenværende celler ble ekspandert i 5 uker i RIT-fritt cellemediet, hvoretter et andre seleksjonsrunde ble utført på samme måte med 1 ug /ml SS1-LR-GGS, noe som resulterer i KLM-1-R. Disse cellene ble utvidet i RIT fritt medium og lagret viably frosset i N
2 for videre studier. Cellelinje identiteter ble bekreftet ved hjelp kort tandem repeat analyse (NCI, Frederick, MD). Alle celler ble holdt ved 37 ° C i en fuktet inkubator med 5% CO
2.
celleproliferasjon, celledød og proteinsynteseinhibisjon analyser
KLM-en og KLM-en -R cellevekst ble sammenlignet ved å telle levedyktige celler med en Cellometer Vision (Nexcelom). Døde celler ble utelukket ved hjelp av Trypan blå flekker, og hvert tidspunkt ble tellet i tre eksemplarer. For å evaluere behandlingseffekt, ble Rits det tilsatt omtrent 16 timer etter utsåing av cellene i en 6- eller 96-brønns plate. Veksthemming ble evaluert ved å måle ATP nivåer med Cell Titer-Glo Lysende celleviabilitet analyse (Promega). Verdiene ble normalisert mellom kontrollene på en pM staurosporin (Sigma-Aldrich) og buffer (Dulbeccos fosfatbufret saltvann uten Ca og Mg (D-PBS), Quality Biological, Inc.) inneholdende 0,2% humant serum albumin (Division of Veterinary Resources, NIH , Bethesda, MD) eller medium. Bright-feltet bildene ble tatt på en Zeiss mikroskop med en 10X EC Plan-NeoFluar objektiv med AxioCam MRc kameraet og AxioVision 4.7.2 oppkjøpet programvare. Celledød ble evaluert ved bruk av Annexin V-PE apoptose Detection Kit I (BD Pharmingen), i henhold til produsentens instruksjoner. Apoptotiske celler ble ansett Annexin V-positive, som bestemt ved signalutvelgelse på ubehandlede celler. Proteinsynteseinhibisjon ble kvantifisert ved å måle [
3 H] leucine (Perkin Elmer) inkorporering som gjort tidligere [22]. Verdiene er presentert i forhold til kontroll av D-PBS 0,2% humant serum albumin og 100 mikrogram /ml cycloheximide- (Sigma-Aldrich) behandlet kontroller.
Real-time RT-qPCR
RNA var isolert og renset fra celler ved bruk av RNeasy-sett (Qiagen), revers transkripsjon ble utført med den QuantiTect Reverse Transcription kit (Qiagen), og amplifikasjon med QuantiFast SYBR grønn PCR-kit (Qiagen). Primer sekvenser for DPH1-5, DPH7, mesothelin, og β-aktin er vist i S1 tabell. Real-time RT-qPCR ble utført på en ABI HT 7900 RT-PCR maskin, analysert ved hjelp av komparative C
T-metoden (ΔΔ
C
T) metoden med SDS manager (Applied Biosystems) . og normalisert for den endogene β-aktin
Surface protein uttrykk ved flowcytometri
mus anti-human mesothelin (MN, Rock immunochemicals, Inc.) og R-PE anti-human CD71 ( Biolegend) ble anvendt for å vurdere overflateprotein uttrykk. En mus-IgG-R-PE isotypekontroll (BD Biosciences) ble anvendt som en negativ kontroll for mesothelin farging. Anti-mesothelin og isotypekontroll ble farget med et sekundært geite-anti-muse-IgG-R-PE (1: 250 fortynning, Jackson Immunoresearch Laboratories, Inc.). Fluorescensintensitet ble analysert ved flowcytometri på et FACSCalibur. QuantiBRITE R-PE perler (BD Pharmingen) ble anvendt til å kvantifisere antallet mesothelin-bindingsseter per celle.
skur mesothelin nivåer i cellemediet
Løselig mesothelin nivåer i cellelinje medium ble målt i to eksemplarer med en mesothelin Meso Scale analysen (Morphotek, Inc.), ved hjelp av elektrokjemiluminescens teknologi Meso Scale Discovery. Celler ble sådd i vanlig cellekulturmedium i en 12-brønns plate. Etter 20 timer ble mediene samlet opp, ble volumet målt og antall celler per brønn telles. Etter sentrifugering av mediet, ble supernatanter lagres ved -80 ° C inntil analyse. Celle Supernatanten ble fortynnet 50 ganger og tilsatt til brønner i en 96-brønns plate som tidligere er belagt med fangst-antistoff. Prosedyren ble utført som tidligere beskrevet [26], og signalene ble målt på et MSD Very Arbeidsbenk (Meso Scale Discovery). Mengden av mesothelin skur av KLM-1 og KLM-1-R ble beregnet ved å multiplisere den oppnådde mesothelin konsentrasjon med godt volum, og standardisert for antall telte celler per brønn.
RG7787 cellulært opptak
RITS ble merket med Alexa Fluor 647 Merking Kit (Invitrogen) i 3,5 timer og renset i henhold til produsentens instruksjoner. Høstede cellene ble inkubert i 30, 75 og 150 minutter ved 37 ° C med en mettende 2 ug /ml SS1P-Alexa647 eller RG7787-Alexa647 og behandlet som tidligere beskrevet [22]. Fluorescens intensitet ble analysert på en FACSCalibur. Opptaket ble uttrykt i antall internalisert RG7787 molekyler, som ble beregnet ved å anta at RG7787-Alexa647 GEOMEAN overflate uttrykk av KLM-en lik 60 x 10
3 RG7787 molekyler (= overflate mesothelin bindingsseter per KLM-en celle, som evaluert av flowcytometri og QuantiBRITE R-PE perler).
metylering analyse
Evaluering av metylering status for et område i mesothelin genet promoter området ble gjort av EpigenDx (Hopkinton, MA). Bisulfite endringen ble utført ved hjelp av Zymo Forskning EZ Metylering Gold kit. Genomisk DNA (500 ng) ble anvendt for modifisering bisulfitt, etterfulgt av PCR-amplifikasjon ved anvendelse av varm-Star Taq-polymerase (Qiagen). Pyrosekvensering ble utført ved hjelp av PSQ HS 96 pyrosekvensering System (Qiagen). Den analyserte regionen ble valgt basert på tilgjengelige primere (ADS2475-RS1 og ADS2475-RS2) på EpigenDx, som dekket et 147-bp region oppstrøms for mesothelin transkripsjon start hotellet (chr16: 808890-808742; ENST00000563941). Metylering kvantifisering ble utført med PyroQCpG programvare, som beregner for hvert enkelt CpG forholdet mellom dens metylert og ikke-denaturert form, noe som resulterer i den gjennomsnittlige prosentandelen av metylering grad.
Mesothelin transfeksjon i KLM-1-R
KLM-1-R-celler ble transfektert ved Lipofectamine (Invitrogen) med styre pcDNA3.1 (+) (Invitrogen) eller pMH107, en pcDNA3.1 (+) vektoren med full-lengde cDNA mesothelin og Geneticin som selekterbar markør [27]. -Celler ble transfektert i tre dager, valgt med 6 ug /ml Geneticin, og opprettholdes i regelmessig RPMI-medium med 3 ug /ml Geneticin. Enkeltcellesortering med en FACSVantage SE (BD Biosciences) og etterfølgende etterfølgende ekspansjon resulterte i det monoklonale cellelinje KLM-1-R-
Msln
som sterkt og homogent uttrykt mesothelin på overflaten.
toksin-indusert ADP-ribosylering av EF-2
Cellene ble lysert i RIPA-buffer med proteasehemmere (Roche Applied Science), og 3 ug av cellelysat ble inkubert med ADP-ribosylering-buffer [20 mM Tris-HCl (pH 7,4), 1 mM EDTA, og 50 mM DTT], 5 pM 6-biotin-17-NAD (Trevigen) og 10 ng av RG7787 til forskjellige tidspunkter ved 25 ° C. Prøvene ble underkastet SDS /PAGE etterfulgt av Western blotting med HRP-konjugat streptavidin (Invitrogen) for å påvise biotin ADP-ribosylert EF-2.
Western blot
Cellene ble høstet, vasket med D- PBS, og oppløste i RIPA buffer med proteasehemmere (Roche Applied Science). Proteinkonsentrasjoner ble bestemt ved anvendelse av en Coomassie Plus-kit (Pierce). Like mengder protein ble fylt på NuPAGE 4% -12% Bis-Tris-geler (Invitrogen) for SDS-PAGE og overført til nitrocellulosemembraner (Invitrogen). De følgende primære antistoffer ble brukt: mus-anti-MN (Rockland), kanin-anti-EF-2 # ab33208 (Abcam) og muse anti-β-aktin # 8226 (Abcam). HRP-konjugert mus sekundære antistoffer (Santa Cruz Biotechnology) ble visualisert med ECL eller ECL Plus substrater (GE Healthcare). EF-2 protein nivåer ble kvantifisert og justert for β-aktin med bilde J [28].
RNA dypt sekvensering og dataanalyse
Total RNA ble ekstrahert fra KLM-en og KLM-en R-celler ved hjelp av Qiagen RNeasy kit, og on-kolonne DNA fordøyelse (Qiagen) ble utført i henhold til produsentens instruksjoner. Etter RNA kvalitetskontroll med en Agilent Bioanalyzer, ble totalt RNA prøver sendt til biblioteket konstruksjon og dypt sekvensering til NCI kjernefasiliteten (Bethesda, MD). Den rå sekvensene ble kvalitetssikret og justert til RefSeq [29]. Rå tellinger ble normalisert og lastet inn Qlucore omics Explorer v_3.0 (35) for differensial uttrykk analyse. Bruk av Qlucore er variansen filter, ble en liste over de 989 mest vesentlig endret gener som genereres som vi delt inn i opp- og ned-regulerte gener.
Gene Set Enrichment Analyse plakater (GSEA) justering ble utført innenfra Qlucore. For justering til Gene Ontology- (GO), Kyoto Encyclopedia of gener og genomer (KEGG) – og Reactome-trasé, opp- og ned-regulert gen listen ble lastet inn string-db.org [30] og p-verdier for datasett med betydelige endringer ble hentet.
Statistisk analyse
Forsøk ble vanligvis utføres uavhengig minst to ganger, og representative eller gjennomsnittsdata vises. Data er presentert som gjennomsnitt ± standard feil av måling av gjentatte eksperimenter. Anvendt Statistikken omfatter Student t-test eller enveis ANOVA med Tukey er flere sammenligningstester. Statistisk analyse og figur utkast ble utført ved hjelp GraphPad PRISM 6 (GraphPad Software, Inc.). En
p
-verdi på mindre enn 0,05 ble ansett som statistisk signifikant, med mindre annet er oppgitt.
Resultater
KLM-1 celler isolert etter SS1-LR-GGS inkubasjon er resistente til anti-mesothelin Rits
Som beskrevet i metodedelen, ble KLM-1-celler periodisk eksponeres med SS1-LR-GGS og overlevende celler (KLM-1-R) ble ekspandert i RIT-fritt medium. KLM-en og KLM-1-R-celler ble utvisket av lyse felt mikroskopi (S2A fig.) Og på flowcytometri fremover og sidespredning, noe som indikerer en lignende cellestørrelse og detaljnivå (S2B fig.). Celleproliferasjon ble sammenlignet ved poding 1 x 10
5-celler på dag 0, og å telle levedyktige celler daglig i 6 dager. KLM-1-R cellene vokste betydelig raskere enn KLM-1 celler fra dag 2 på (
p
0,0001) (S2C fig.). For å vurdere graden av motstand, KLM-1 og KLM-1-R-celler ble inkubert i 72 timer med anti-mesothelin Rits. ATP-levedyktighet analyser viste at KLM-1 celler var følsomme for SS1-LR-GGS (IC
50 = 1,73 ± 0,01 ng /ml) og RG7787 (IC
50 = 4,41 ± 0,38 ng /ml), i overensstemmelse med tidligere funn [19]. I motsetning til dette, KLM-1-R-celler var meget motstandsdyktig mot begge Rits (IC
50- 1 pg /ml) (figur 1A.) Og SS1P (data ikke vist). I resistente celler, var det en liten nedgang i celleformering ved RIT konsentrasjoner over en 100 ng /ml. Som en kontroll ble testet vi aktiviteten av LMB-2, et anti-CD25 RIT [31] som ikke binder KLM-1-celler, og det observert en ikke-spesifikk reduksjon ved 1 ug /ml LMB-2. Dette indikerer at nedgangen på 1 ug /ml RG7787 i KLM-1-R kunne tilbakeføres til ikke-spesifikt opptak (fig. 1A). Den etablerte motstanden var stabil; Det ble ikke observert noen endring når KLM-1-R-celler ble i RIT fritt kultur i flere måneder (data ikke vist). Fordi ATP analyser ikke kan skille mellom cellevekst arrest og celledød [32], vi evaluert respons med Annexin V-PE apoptose Detection kit. I motsetning til KLM-1 (
p
0,0001), KLM-1-R-celler viste ingen eller begrenset apoptose når de ble behandlet i 72 timer med 100 ng /ml (
p = 0,33
) eller 1 pg /ml RG7787 (
p
= 0,02), sammenlignet med ubehandlede celler (fig. 1B). Disse data bekrefter at KLM-1-R-celler er svært motstandsdyktig mot den celledrepende aktivitet av anti-mesothelin Rits
A:. KLM-1 og motstandsdyktig KLM-1 (KLM-1-R) celler ble inkubert i 72 timer med anti-mesothelin SS1-LR-GGS, RG7787 eller anti-CD25 LMB-2 som en kontroll. Veksthemming ble evaluert med en ATP celleviabilitet analysen. Med IC
50-tallet under 10 ng /ml, KLM-en er følsom for anti-mesothelin RITS, som ikke er tilfelle for KLM-1-R (IC
50s 1 mg /ml). 1 ug /ml LMB-2 redusert cellelevedyktighet, noe som indikerer at denne RIT konsentrasjonen induserer ikke-spesifikt opptak. B: KLM-1 og KLM-1-R-celler ble inkubert i 72 timer med 100 eller 1000 ng /ml RG7787. Apoptose ble evaluert med den Annexin V-PE apoptose Detection Kit I. RG7787 induserer en signifikant økning i apoptotiske KLM-1-celler, mens KLM-1-R-celler viser ingen relevant økning i apoptose. C: KLM-1 og KLM-1-R-celler ble inkubert i 72 timer med HB21 (Fv) -PE40. Veksthemming ble evaluert med en ATP celleviabilitet analysen. Begge cellelinjer er svært følsomme for denne RIT.
Motstand i KLM-1-R-celler er spesifikke for anti-mesothelin RITS
For å vurdere om motstanden i KLM-1- R gjelder også for RITS målrettet mot andre reseptorer på KLM-1-R celler, testet vi HB21 (Fv) -PE40 som er rettet mot CD71 [33]. CD71 blir uttrykt på overflaten til et tilsvarende høyt nivå i KLM-1 og KLM-1-R (data ikke vist), og begge cellelinjene hadde en lignende følsomhet for HB21 (Fv) -PE40 etter en 72 timers inkubasjon (fig. 1C). For å evaluere følsomheten til andre terapeutika, ble cellene også behandlet i 72 timer med paclitaxel, en mitotisk inhibitor, og gemcitabin, en nukleosidanalog. Levedyktighets analyser viste ingen forskjell i følsomheten for paclitaxel mellom KLM-1 og KLM-1-R (IC
50 KLM-1 = 3,0 ± 1,6 ng /ml sammenlignet med IC
50 KLM-1-R = 3,7 ± 1,7 ng /ml) (
p
= 0,80). KLM-1-R (IC
50 = 44,2 ± 5,7 ng /ml) var 3 ganger mindre sensitiv for gemcitabin enn KLM-1 (IC
50 = 15,2 ± 1,9 ng /ml) (
p
= 0,04), som er mye mindre uttalt enn motstanden til RG7787. Disse resultater viser at motstanden i KLM-1-R ikke er generell og derfor spesifikk for anti-mesothelin Rits.
Mesothelin ekspresjon og RG7787 opptak blir redusert i KLM-1-R
første trinn i RIT virkningsmekanismen er bindende for den målrettede celleoverflateantigenet, etterfulgt av internalisering RIT. Mesothelin overflate uttrykk, som vurderes av flowcytometri, var 4,9 ± 0,5 ganger lavere i KLM-1-R (12 x 10
3 steder per celle) sammenlignet med KLM-en (60 x 10
3 sider per celle) (fig. 2A). Flow-cytometri viste en homogen KLM-1-R-cellepopulasjon, noe som tyder på en ensartet reduksjon i mesothelin overflate-ekspresjon. Analyse av mesothelin-negative A431-celler og bruk av en isotype kontroll-antistoff bekreftet at mesothelin signal i KLM-1-R-celler ble bestemt. Som forventet, vestlige blotter viste at KLM-1 celler inneholdt et stort band av modne mesothelin ved 37-kDa og en svakere forløper band på 72-kDa. De resistente celler hadde små mengder moden mesothelin, men forløperen ikke ble påvist, sannsynligvis på grunn av sin lave overflod (Fig. 2B). Overflødig Shedding av mesothelin i KLM-1-R kunne gjøre rede for lave mesothelin overflatenivå. Bruke Meso Scale analysen, fant vi at skur mesothelin var 4,8 ± 0,03 ganger lavere i media av KLM-1-R (40,7 ± 5,3 pg /10
5 celler) sammenlignet med KLM-en (149,0 ± 23,4 pg /10
5 celler). I mellom uten celler (negativ kontroll), ble det ikke mesothelin oppdaget. Disse data er i overensstemmelse med forskjellen i overflatenivå og indikerer at den lave mesothelin på KLM-1-R er ikke på grunn av økt avgivelse. For å avgjøre om redusert mesothelin skyldtes mindre mRNA, utførte vi RT-PCR og fant at mesothelin RNA var 7,3 ± 4,3 ganger lavere i KLM-1-R (C
T = 24,1 ± 0,09) sammenlignet med KLM-en (C
T = 21,54 ± 0,73). For å vurdere om de resterende mesothelin på KLM-1-R overflaten kan binde og internal anti-mesothelin RITS, vurderte vi det cellulære internalisering av RG7787-Alexa647. Opptaket i KLM-1-R økt over tid, men var betydelig lavere enn KLM-en ved hvert tidspunkt (4- til 5-ganger,
p
0,01). Etter 150 minutters inkubering, f.eks KLM-1 internalisert omtrent 40 x 10
3 RG7787 molekyler, sammenlignet med bare 8 x 10
3 i KLM-1-R (fig. 2C). Disse data viser at KLM-1-R-celler har et delvis ned-regulering i mesothelin og derfor internal betydelig mindre RG7787, noe som gir en potensiell forklaring på den observerte motstand
A.: Overflate mesothelin nivåer er 5 ganger lavere i motstandsdyktig KLM-en (KLM-1-R) sammenlignet med KLM-en. Mesothelin uttrykk for KLM-en, KLM-1-R og mesothelin-negative A431 celler (negativ kontroll) ble evaluert ved hjelp av flowcytometri. Fylt histogrammer er sekundære antistoffkontroll. B: Hele mesothelin proteinnivået er redusert i KLM-1-R. Precursor (72 kDa) og spaltet moden mesothelin (37 kDa) var til stede i KLM-en. I KLM-1-R, ble spaltet partiet påvist ved lave nivåer. Protein nivåer ble undersøkt i ubehandlet KLM-en og KLM-1-R cellelysat ved Western blot. p-aktin fungerer som lasting kontroll. C: På hvert tidspunkt, cellulært opptak av RG7787-Alexa647 i KLM-en er betydelig høyere enn i KLM-1-R, og betydelig lavere enn i KLM-en-R-
Msln plakater (transfektert med mesothelin ). Opptaket ble bedømt ved 30, 75 og 150 min. Gjennomsnittlig GEOMEAN fluorescensstyrkene omgjort til mengden av RG7787 molekyler.
AZA delvis gjenoppretter mesothelin overflate uttrykk i KLM-1-R med begrenset effekt på følsomhet for RG7787
Mesothelin uttrykk kan bli brakt til taushet av DNA metylering av CpG nettsteder i sin promoter region [34-37]. AZA, en DNA metyltransferase inhibitor kan reversere en slik hypermethylation. Vi ga celler 500 nM AZA daglig i 3 uker, og fant at mesothelin uttrykk ble økt i KLM-1-R (KLM-1-R-AZA) med om lag tre ganger, opp til 34 x 10
3 sider per celle, som fortsatt er mindre enn 60 x 10
3 seter pr celle i KLM-1 (fig. 3A). AZA forbedret følsomhet for RG7787 i KLM-1 og KLM-1-R, selv om den sistnevnte forble svært motstandsdyktig etter en 72 timers inkubering (IC
50 = 722,4 ± 232,6 ng /ml) (fig. 3B). Disse data knytte mesothelin nedregulering til hypermethylation
A:. AZA fører til en 2,8 ganger økning av mesothelin overflate uttrykk i motstandsdyktig KLM-en (KLM-1-R). Flowcytometri histogram av KLM-en, KLM-1-R, og KLM-1-R-AZA. Fylt histogrammet representerer sekundære antistoffkontroll. B: Tre uker inkubering med AZA, en DNA-metyltransferase-inhibitor, øker følsomheten til RG7787. KLM-1, KLM-1-R, og de AZA-behandlede celler (KLM-1-AZA og KLM-1-R-AZA) ble behandlet i 72 timer med RG7787. Veksthemming ble evaluert med en ATP celleviabilitet analysen. Stiplede linjene representerer AZA-behandlede celler. C: CPGs i en region oppstrøms for mesothelin transkripsjon start stedet er mer metylert i KLM-1-R enn i KLM-en. Tre uker med inkubasjon med AZA avtar metylering i KLM-1-R celler. Den analyserte regionen ligger på chr16: 808890-808742 og spenner over 147 bp og sju CPGs. D: Mesothelin transfeksjon i KLM-1-R resulterer i betydelig overekspresjon av mesothelin forhold til KLM-1 (5 ganger) og KLM-1-R (23 ganger). Flowcytometri overflaten mesothelin nivåer i KLM-en, KLM-1-R og mesothelin-transfektert resistente celler (KLM-en-R-
Msln
). E: Mesothelin overekspresjon i KLM-1-R gjenoppretter følsomhet for RG7787. KLM-en og KLM-en-R-
Msln
celler ble inkubert i 72 timer med RG7787. Veksthemming ble evaluert med en ATP celleviabilitet analysen.
CPGs i mesothelin promoter regionen hypermethylated i KLM-1-R
For å bekrefte at mesothelin genet er faktisk underlagt hypermethylation i KLM-1-R, utførte vi en eksplorativ analyse av metylering status for sju CPGs i mesothelin promoter region (chr16. 808890-808742, S3 figur) med bisulfite sekvensering. Denne 147-bp stedet regionen ble valgt basert på primere tilgjengelig på EpigenDx. Resultatene viste at disse CPGs hadde en signifikant høyere metylering i KLM-1-R (59 ± 3,6%) sammenlignet med KLM-1 (41 ± 4,8%) (
p
0,05) (Fig. 3C) . Behandling med AZA brakte metylering nivåer i KLM-1-R tilbake til de av KLM-1 (p 0,05). Disse dataene støtter videre at mesothelin downregulation i KLM-1-R er assosiert med hypermethylation av mesothelin genet.
Overuttrykte mesothelin i KLM-1-R gjenoppretter følsomhet for RG7787
Hvis du vil gjenopprette mesothelin uttrykk i KLM-1-R, introduserte vi full lengde mesothelin cDNA (KLM-en-R-
Msln
). Surface mesothelin uttrykk for KLM-en-R-
Msln
var 22,6 ± 5,3 ganger høyere enn for KLM-1-R, og overskredet den opprinnelige uttrykk i KLM-en med 5,3 ± 1,3 ganger, noe som resulterer i ca 300 x 10
3 steder per celle (fig. 3D). Som en konsekvens, opptaket av RG7787-Alexa647 i KLM-en-R-
Msln
på hvert tidspunkt var betydelig høyere enn i KLM-en (5- til 10-fold,
p
0,05) og KLM-1-R (24- til 46-fold,
p
. 0,001) (figur 2C). Etter en 72 timers inkubering, RG7787 hadde en lignende IC
50 i KLM-1-R-
Msln product: (4,49 ± 1,11 ng /ml) som i KLM-en (4,41 ± 0,38 ng /ml) (
p
= 0,80). Imidlertid KLM-1-R-
Msln
var mer følsomme enn KLM-1 ved høyere konsentrasjoner RG7787, med cellenes levedyktighet reduseres til null ved 100 ng /ml (fig. 3E). Innføring av styre pcDNA3.1 (+) hadde ingen effekt på mesothelin nivåer eller resistens mot RG7787 (data ikke vist). Disse data bekrefter at motstanden i KLM-1-R er knyttet til en reduksjon i mesothelin. For å oppnå et tilsvarende nivå av følsomhet overfor RG7787 sett i KLM-1, KLM-1-R krever betydelig høyere nivåer enn mesothelin KLM-1. Dette funnet antyder at motstanden kan også være knyttet til ineffektiv smugling av RG7787 til cytosol, eller at proteinsynteseinhibisjon påvirkes i KLM-1-R.
proteinsynteseinhibisjon av RG7787 er begrenset i KLM-1- R, er EF-2-ADP-ribosylering intakte
proteinsyntese-inhibering blir initiert etter at toksinet traffics fra celleoverflaten til cytosol og inaktiverer EF-2 ved ADP-ribosylering. KLM-1-celler ble inkubert med RG7787 i 16 timer, og KLM-1-R-celler i 16 og 48 timer, hvoretter proteinsyntese ble undersøkt ved å måle [
3H] leucin inkorporering (Fig. 4A). Etter 16 timer, RG7787 induserte en nedgang doseavhengig i proteinsyntese i KLM-1, men ikke i KLM-1-R.
