Abstract
Om lag 30-40% av pasienter med tidlig stadium ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) vil presentere med tilbakevendende sykdom innen to år etter reseksjon. Her utførte vi omfattende galectin uttrykk profilering i en retrospektiv studie med frosne og parafin innebygd tumorvev fra 87 stadium I /II NSCLC pasienter. Våre data viser at galectin mRNA uttrykk i NSCLC er begrenset til galectin-1, -3, -4, -7, -8 og -9. Ved siden av scenen, univariable Cox regresjonsanalyse identifiserte galectin-en, galectin-9FL og galectin-9Δ5 som mulige prognostiske markører. Kaplan-Meier overlevelses estimater viste at total overlevelse var signifikant kortere hos pasienter som uttrykker galectin-en over mediannivået, dvs. 23,0 (2,9 til 43,1) vs. 59.9 (47.7-72.1) måneder (p = 0,020), samt hos pasienter som uttrykkelig galectin-9Δ5 eller galectin-9FL under medianen, resp. 59,9 (41,9 til 75,9) vs. 32,8 (8,7 til 56,9) måneder (p = 0,014) eller 23,2 (-0.4-46.8) vs. 58,9 (42,9 til 74,9) måneder (p = 0,042). Alle tre galectins var også prognostisk for sykdomsfri overlevelse. Multivariabel Cox regresjonsanalyse viste at for OS, det mest betydningsfulle prognostisk modell inkludert stadium, alder, gal-1 og gal-9Δ5 mens modellen for DFS inkludert scene, alder og gal-9Δ5. Konklusjonen er at denne studien bekrefter den prognostiske verdien av galectin-en og identifiserer galectin-9Δ5 som nye potensielle prognostiske markører i tidlig stadium NSCLC. Disse funnene kan bidra til å identifisere tidlige stadiet NSCLC pasienter som kan få størst utbytte av adjuvant kjemoterapi
Citation. Schulkens IA, Heusschen R, van den Boogaart V, van Suylen RJ, Dingemans A-MC, Griffioen AW, et al. (2014) Galectin Expression Profilering Identifiserer Galectin-en og Galectin-9Δ5 som prognostiske faktorer i fase I /II ikke-småcellet lungekreft. PLoS ONE ni (9): e107988. doi: 10,1371 /journal.pone.0107988
Redaktør: Pierre Busson, Gustave Roussy, Frankrike
mottatt: 07.04.2014; Godkjent: 21 august 2014; Publisert: 26.09.2014
Copyright: © 2014 Schulkens et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle relevante data er innenfor papir og tilhørende datafiler
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra den nederlandske Cancer Society (www.kwfkankerbestrijding.nl:UM2008-4101; VU2009-4358) til AWG og VLT. Den Funder hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
i ikke-småcellet lungekreft (NSCLC), clinicopathological staging henhold til TNM-klassifikasjon er fortsatt den viktigste skille å klassifisere pasienter med en tydelig utfall. Dessverre, av pasientene diagnostisert med tidlig stadium sykdommen nesten 30% til 40% vil presentere tumorresidiv innen to år etter kirurgisk reseksjon [1]. Siden det er blitt vist at hjelpekjemoterapi kan forbedre overlevelse av pasienter med resected stadium II-IIIa NSCLC, identifisering av tidlig stadium pasienter med dårlig overlevelse er klinisk relevant [1].
Galectins er en proteinfamilie av hvilken medlemmene er definert ved tilstedeværelsen av en konservert karbohydrat erkjennelse domene [2]. Hittil har femten galectins blitt identifisert, elleve av disse er også uttrykt i forskjellige humane celler og vev [3], [4]. De utøve mange forskjellige funksjoner, med regulering og finjustering av immunsystemet er best studert. Følgelig er deregulering av galectin uttrykk ofte forbundet med en inadekvat immunrespons som bidrar til forskjellige sykdommer, inkludert kreft [5], [6]. I tillegg har galectins blitt funnet å mediere tumorcellemetastase [7] – [9] og for å indusere og opprettholde tumor angiogenese [10] – [15], som ytterligere bidrar til progresjon av kreft. Alt dette har ført til anerkjennelse av galectins som diagnostiske og prognostiske markører i ulike krefttyper, inkludert lungekreft. For eksempel økte galectin-3 ekspresjon har blitt beskrevet som en indikator på dårlig prognose i NSCLC [16], [17]. Lignende observasjoner ble rapportert for galectin-1 uttrykk [16] – [18]. Videre er galectin-1-ekspresjon forhøyet i kreftvevet lunge, sammenlignet med normal lunge [19]. Mer nylig ble det forhøyede nivåer av galectin-1-ekspresjon funnet å fremme kreft progresjon og chemoresistance [20] lunge mens økt galectin-4-ekspresjon ble vist å forutsi lymfeknutemetastase i adenokarsinom av lungen [21]. Alle disse funnene illustrerer den prognostiske potensialet av galectins i lungekreft. Men om galectin uttrykk kan også benyttes for å skille mellom tidlige stadium NSCLC med god eller dårlig prognose er ikke blitt godt etablert. Derfor er målet med denne studien var å finne ut om måling av galectin mRNA uttrykk kan tjene som en prediktor for klinisk utfall hos pasienter med stadium I /II NSCLC ved hjelp av en multivariabel modell.
Materialer og Metoder
Etisk uttalelse
Denne studien ble godkjent av den lokale intern gjennomgang brett (Maastricht patologi Tissue Collection, https://www.pathologymumc.nl/research/external-projects/maastricht-pathology-tissue-collection- MPTC) og er i samsvar med anbefalingene guiding leger i biomedisinsk forskning som omfatter mennesker som er nedfelt i Helsinkideklarasjonen. I henhold til styrende etikk, gjorde bruk av anonymisert vev fra vev banken ikke krever spesifikk skriftlig samtykke.
Pasienter
Den aktuelle studien inkluderte kreftprøver av pasienter med stadium I /II NSCLC som gikk en anatomisk kurativ reseksjon ved universitetssykehuset Maastricht mellom 1994 og 2004 [22]. Eksklusjonskriterier var en) Forrige annen malignitet, 2) Utvikling av en urelatert malignitet i løpet av en oppfølging på minst 4 år, eller 3) Neo-adjuvant behandling.
Prøve egenskaper
resected materialet ble lagret ved -80 ° C som en del av Maastricht Pathology Tissue Collection. Bare vev fra pasienter med stadium I /II sykdom og med en svulst område 50% (gjennomsnitt 65,9%, 95% KI: 59,9 til 71,9), som evalueres i hematoxylin /eosin farget deler av en erfaren patolog (R-JVS), ble ansett som kvalifisert for videre undersøkelser.
Studiedesign
Vi har analysert retrospektivt svulstvev fra stadium i /II NSCLC pasienter som gjennomgikk kurativ reseksjon kirurgi mellom 1994 og 2004 på det akademiske sykehuset Maastricht. Totalt ble 87 pasienter inkludert. Pasientene fikk ingen tidligere behandling og ikke har en historie med eller utvikle urelaterte malignitet opp til 4 år etter operasjonen. Oppfølgingen var minst 5 år hvor pasientene ble undersøkt rutinemessig hver 3. måned de første 2 årene, og deretter hver 6. måned. Kliniske endepunkter inkluderte total overlevelse (OS) og sykdomsfri overlevelse (DFS). Total overlevelse var tiden i måneder fra operasjonsdagen inntil dagen for død av enhver årsak. Sykdomsfri overlevelse var tiden i måneder fra operasjonsdagen inntil dagen for svulst tilbakefall, enten lokoregionalt eller fjernt. Kandidat variabler som ble vurdert for inkludering i modellene inkluderte mRNA uttrykk nivåer av hver galectin (i 2∧-deltaCt), alder (i år), trinn (I eller II), kjønn, histologi (plateepitel eller andre), røykestatus ( tidligere eller andre). Antall pasienter inkludert ble bestemt av tilgjengeligheten av tumorprøver. Innenfor denne utvalgsstørrelse, ca 50 hendelser inntruffet som tillot inkludering av 5 variabler for multivariat analyse for å unngå risiko for oversittende
cellekulturer
Følgende cellelinjer ble brukt. A549 menneskelige alveolar karsinom (ATCC CCL-185), H460 human stor celle karsinom (ATCC HTB-177), H1650 menneskelig bronchoalveolar karsinom (ATCC CRL-5883), H1975 human ikke-småcellet lungekreft (ATCC CRL-5908), H3255 menneskelig ikke-småcellet lungekreft (ATCC CRL-2882, utgått). Alle cellelinjene ble dyrket i RPMI (Invitrogen) supplert med 10% føtalt kalveserum, penicillin (50 U /ml) og streptomycin (50 ug /ml). Celler ble opprettholdt ved 37 ° C og 5% CO
2 i en fuktet inkubator.
RNA isolering og cDNA-syntese
Total RNA ble isolert fra 10 x 10 mikrometer tykke frosne vevssnitt eller fra dyrkede celler ved bruk av RNeasy-sett (Qiagen) ifølge produsentens instruksjoner. I tilfelle av tumorvev ble en ytterligere snitt tatt før og etter serien av 10 for H /E farging og evaluering av prosentandelen av tumorområdet. Genomisk DNA-forurensning ble fjernet ved på kolonne DNase-behandling. Konsentrasjonen og renheten av RNA ble analysert ved hjelp av Nanodrop ND-1000 (Nanodrop Technologies). Deretter ble cDNA syntese utført med iScript cDNA Synthesis Kit (Biorad) med 0,5 til 1,0 mikrogram total RNA.
Sanntids qPCR
qPCR ble utført på en iQ5 Multi Real-Time PCR Detection System (BioRad) eller CFX96 (BioRad) ved hjelp av iQ SYBR grønn PCR masterblanding (BioRad) ved anvendelse av 400 nmol /L av de passende primerne som er blitt beskrevet før [23]. For å skille mellom de forskjellige galectin-9 spleise varianter følgende primere ble brukt: gal-9FL frem GCAGACAAAAACCTCCCG, gal-9FL reversere CCCAGAGCACAGGTTGATG, gal-9Δ5 frem ATCAGCTTCCAGCCTCCC, gal-9Δ5 reversere CCCAGAGCACAGGTTGATG, gal-9Δ5 /6 fremover CTACATCAGCTTCCAGACCCA, Gal- 9Δ5 /6 revers CCCAGAGCACAGGTTGATG. qPCR for disse spleisevarianter ble utført ved anvendelse av Sensimix (Quantace) ved Tm = 61 ° C. Alle primere ble syntetisert ved Eurogentec.
Western blot
Western blot ble utført i henhold til standard protokoller. I korte trekk, 5 til 10 10 um tykke crysections ble suspendert i 60 ul Laemlli prøvebuffer (Biorad) supplert med 01:20 β-merkapto-etanol. Prøvene ble kokt i 5 minutter og umiddelbart separert ved gelelektroforese på en 15% polyakrylamid-gel og overført til PVDF-membraner (Millipore). Membranene ble blokkert med Oddyssey blokkeringsbuffer (LI-COR Biosciences) i 1 time og inkubert over natten ved 4 ° C med enten kanin anti-galectin-1-antistoff (Peprotech) eller geite-anti-galectin-9-antistoffet (R Peprotech) og geite-anti-galectin-9 (1:500; R & D Systems) antistoffer av hvilke spesifisitet ble bestemt før [23]. Farging ble visualisert ved hjelp av StreptABComplex /HRP kit (Dako). Snittene ble motfarget med hematoksylin (Merck), dehydratisert og montert i Depex (BDH Prolabo). Blindet scoring av galectin-1 og galectin-9 ble utført på tre forskjellige avdelinger av tumoren, dvs. tumorceller, tumor stroma, og tumor endotelceller. For scoring av galectin-en og galectin-9 hyppigheten av farging ble bestemt ved hjelp av følgende skala: 0 = ingen eller knapt noen celler positiv, 1 = liten brøkdel av celler positiv, 2 = ca halvparten av cellene positive, 3 = mer enn halvparten av cellene positive, 4 = alle eller de fleste cellene positive. Alle stainings ble scoret av minst to uavhengige personer.
Statistisk analyse
Bivariable Pearson korrelasjonskoeffisienter ble beregnet til å studere forholdet mellom galectin mRNA uttrykk nivåer (2
-ΔCt), klinisk parametre, og /eller immunhistokjemisk farging score. For å identifisere de viktigste prediktorene for pasientenes utfall en to-trinns tilnærming ble brukt. Først ble univariable assosiasjoner mellom OS eller DFS med kliniske parametre eller hver galectin undersøkt ved hjelp av Cox regresjonsanalyse. Deretter ble multivariabel Cox regresjonsanalyse med fremover utvalg utført på de mest betydelige galectin prediktorer identifisert i univariable analyse, dvs. gal-en (kategorisk), gal-9FL (kategorisk), gal-9Δ5 (kategorisk), sammen med alder (kontinuerlig ) og trinn (kategorisk), med enten OS eller DFS som resultat. Analysen inkluderte Kaplan-Meier overlevelses estimater med Log rank test ble utført for å bestemme median OS eller DFS. Median mRNA-ekspresjonsnivåer ble anvendt som cut-off-verdi for å dele pasientene til en høy ekspresjon gruppe (ovenfor median) og lav ekspresjon gruppe (under median). Konfidensintervall for median overlevelse ble beregnet i henhold til Bonnet et al. [24]. Alle statistiske beregninger ble utført i SPSS20.0.0.
Resultater
Expression of galectin mRNA i tidlig stadium NSCLC og lungekreft cellelinjer
Vi utførte omfattende galectin genekspresjonsanalyse i en retrospektiv studie på resected tumorvev avledet fra 87 pasienter diagnostisert med tidlig stadium (stadium i /II) NSCLC. Median alder for pasientene var 65,5 år (fra 37,4 til 85,5) og oppfølging var minst 5 år hvor 47 pasienter (54,0%) presenteres tilbakevendende sykdom og 50 pasienter døde (57,5%). Median total overlevelse (OS), definert som tiden mellom operasjonsdagen før dødsdagen, var 48,7 måneder (95% KI 33.1-64.2 måneder). Sykdomsfri overlevelse (DFS), definert som tiden mellom operasjonsdagen inntil dagen lokoregionalt eller fjernmetastaser, var 33,3 måneder (95% KI 34.8-49.6 måneder). De generelle demografiske og standard prognostiske variabler av pasientgruppen er oppført i Tabell 1.
For å få innsikt i den prognostiske verdien av galectin uttrykk i fase I /II NSCLC vi først bestemt hvilke galectins er uttrykt i NSCLC tumorvev. qPCR-analyse med tidligere validerte primere målrettet mot alle kjente humane galectins [23] avslørte at seks galectins, dvs. galectin-1, -3, -4, -7, -8 og -9, mRNA-ekspresjon kunne påvises (Figur 1A ). Fordi omfattende skjøting er blitt rapportert for galectin-9 [23], [25], [26], vi også bestemt mRNA-ekspresjon av de mest vanlige galectin-9-spleisevarianter, dvs. galectin-9 i full lengde (FL), galectin- 9 med en sletting av ekson 5 (Δ5), og galectin-9 med en sletting av eksoner 5 og 6 (Δ5 /6). Alle tre variantene kunne påvises med gal-9Δ5 som den dominerende varianten (figur 1A, innfelt). Protein ekspresjon av de forskjellige galectin familiemedlemmer ble bekreftet ved screening av immunhistokjemiske stainings som er tilgjengelige i det humane proteinet atlas [27] (figur 1B). Protein ekspresjon av de forskjellige galectin-9 spleise isoformer ble ytterligere bekreftet ved Western blot-analyse (figur 1C). Videre expression profilering på ulike lungekreftcellelinjer bekreftet at uttrykket ble begrenset til galectin-1, -3, -4, -7, -8 og -9 (figur S1). Dette bekrefter en studie av Lahm et al. som analyserte ekspresjonen av multiple galectins i et bredt panel av cancercellelinjer [28]. Alle disse resultatene viser at galectin-1, galectin-3, og galectin-8 er de mest rikelig uttrykt galectins mens ekspresjonen av galectin-4, galectin-7, og galectin-9 er forholdsvis lav, både i tumorvev og i forskjellig lunge kreft cellelinjer.
det innfelte viser uttrykket av de tre galectin-9 spleisevarianter. (B) Bilder av immunhistokjemisk farging av galectins med påvisbare mRNA uttrykk i NSCLC [27]. (C) Western blot-analyse av galectin-9-isoformen ekspresjon i NSCLC tumorvev fra 5 forskjellige pasienter. Tre band på forventede molekylvekt på galectin-9FL, galectin-9Δ5 og galectin-9Δ5 /6 ble observert ved varierende intensiteter.
Forholdet mellom galectin mRNA uttrykk og kliniske parametre i tidlig stadium NSCLC
Analyse av forholdet mellom de forskjellige galectin mRNA-ekspresjonsnivåer viste en signifikant positiv korrelasjon mellom total galectin-9, og de spesifikke galectin-9-spleisevarianter, dvs. gal-9FL (r = 0,48), gal-9Δ5 (r = 0,85 ), og gal-9Δ5 /6 (r = 0,52). Innenfor disse spleisevarianter var der en signifikant korrelasjon mellom gal-9FL og gal-9Δ5 (r = 0,44), så vel som mellom gal-9Δ5 og gal-9Δ5 /6 (r = 0,53). Signifikante korrelasjoner ble også observert mellom galectin-3 og gal-9FL (r = 0,34) og mellom gal-4 og gal-9Δ5 /6 (r = 0,31). Ingen signifikante korrelasjoner ble funnet mellom mRNA-ekspresjonsnivåene av de andre galectins. Vedrørende forholdet mellom galectin mRNA uttrykk og de kliniske parametre, dvs. alder, stadium, kjønn, histologi, og røykestatus, observerte vi en svakt signifikant sammenheng mellom kjønn og gal-9Δ5 (r = 0,24) og mellom alder og henholdsvis gal-en (r = 0,26), gal-9 (r = -0,25) og gal-9Δ5 (r = -0,30). Ingen signifikant sammenheng mellom galectin mRNA uttrykk og de øvrige parametrene, dvs. histologi, scene, og røykestatus, ble funnet.
Association mellom galectin mRNA uttrykk og prognose i tidlig stadium NSCLC
Deretter univariable Cox regresjonsanalyser ble utført for å velge markører med sterkest tilknytning til OS (tabell 2) og DFS (tabell 3). Dette identifisert scenen, gal-en, gal-9FL og gal-9Δ5 som mulige prognostiske faktorer for både OS og DFS i tidlig stadium NSCLC pasienter. Senere analyser Kaplan-Meier ble brukt til å estimere median OS og DFS hos pasienter som uttrykte en spesifikk galectin under eller over median mRNA-ekspresjonsnivået. Pasienter som uttrykte galectin-1 ovenfor median nivåer hatt en betydelig kortere OS og DFS (figur 2A og tabell 4). Den univariable Cox modellen også identifisert to spleisevarianter av galectin-9, dvs. gal-9FL og gal-9Δ5, skal muligens assosiert med både OS og DFS. Faktisk pasienter med enten Gal-9FL eller gal-9Δ5 ekspresjonsnivåer under median hadde betydelig kortere OS samt kortere DFS (figur 2B + C og tabell 4). Ingen av de andre galectins var signifikant assosiert med OS eller DFS.
Til slutt ble multivariabel Cox regresjonsanalyse utført med fremover utvalg på de viktigste faktorene som er identifisert i univariable analyser, dvs. stadium, alder, galectin-en galctin-9FL og galectin-9Δ5. Disse analysene viste at for OS, det mest betydningsfulle prognostisk modell inkludert stadium, alder, gal-1 og gal-9Δ5 mens modellen for DFS inkludert scene, alder og gal-9Δ5 (tabell 5).
lokalisering og distribusjon av galectin-en og galectin-9 protein uttrykk i tidlig stadium NSCLC vev
for å få mer innsikt i lokalisering og fordeling av galectin-en og galectin-9 protein vi utført immunhistokjemiske stainings på et representativt undergruppe av tumorer (n = 45). Galectin-en ble allment uttrykt i de fleste tumorvev. Uttrykket i tumorcellene varierte mellom tumorer, så vel som i løpet av tumorer, med noen vev viser ingen positive tumorceller, mens i andre vev tumorcellene var sterkt positive. De fleste vev viste positiv farging i stroma, så vel som i de tumor endotelceller (figur 3A). Galectin-9-farging var mindre fremtredende i forhold til galectin-1. Faktisk positive tumorceller ble bare enkelte tilfeller observert, selv om noen vev så ut til å vise en gradient med økende galectin-9 nivåer i tumorcellene nærmere stromal vev (figur 3B). Både stroma og endotel-tumor celler farget positiv oftere (figur 3B).
farging ble observert i tumorcellerommet (T), stromal rommet (S), og i tumor endotelceller (piler). Den innfelt til venstre viser isotypekontrollantistoff farging. Scale bar = 50 mikrometer. De søylediagram som viser kvantifisering av IHC score for galectin-en og galectin-9 i ulike kreft avdelinger.
Senere Pearson korrelasjonsanalyse av de farge score viste at det var en signifikant invers korrelasjon mellom score på galectin-en og galectin-9 i tumorceller (korr. COEF. -0,36), mens det var en positiv korrelasjon mellom galectin-en og galectin-9 protein score i tumor endotelceller (korr. COEF. 0,44). Imidlertid ble verken galectin-en eller galectin-9 protein flekker score assosiert med OS eller DFS. Videre var det ingen sammenheng mellom IHC score og mRNA nivåer.
Diskusjoner
Vi har evaluert den prognostiske betydningen av galectin mRNA uttrykk hos pasienter med stadium I /II ikke-småcellet lungekreft. Univariable Cox regresjonsanalyser ble brukt til å velge et sett av de mest prognostiske kliniske parametre og galectins. Disse ble deretter anvendt i en multivariabel analyse for å generere en modell som kan tjene til å forutsi OS eller DFS i pasienter med stadium I /II NSCLC. Hovedfunnet i denne studien er at for å forutsi OS, den viktigste prognostiske modell inkludert stadium, alder, gal-en og gal-9Δ5 mens modellen for DFS inkludert stadium, alder og gal-9Δ5.
Galectins har tidligere vært forbundet med lungekreft progresjon [16], [17], [29]. Vår observasjon at pasienter som uttrykker galectin-en over median nivåer har en betydelig kortere samlet er i overensstemmelse med disse studiene [16], [17], samt med studier i andre typer kreft [30]. Den prognostiske verdien av galectin-en ble bekreftet i multivariat analyse. Galectin-3, som også er blitt assosiert med dårlig resultat sykdom i lungekreftpasienter [16], [17], nådde ikke statistisk signifikans i vår pasientgruppen. Dette bekrefter med to nyere studier [31], [32]. På den annen side har det blitt foreslått at cellulær lokalisering av galectin-3, dvs. atom vs. cytoplasma kunne være prognostisk verdi for tilbakefall [33]. Vi bare målt galectin-3 mRNA uttrykk nivåer, og ikke bestemme cellulær lokalisering av galectin-3 protein uttrykk i vår pasientgruppe. Dermed kan vi ikke utelukke at disse parametrene kan være av prognostisk verdi i fase I /II NSCLC pasienter.
Et nytt funn av denne studien var å identifisere en bestemt gal-9 spleisevariant, dvs. galectin-9Δ5 som en prognostisk markør i NSCLC. Ved hjelp av multivariabel Cox regresjonsanalyse vi nå observert at lav galectin-9Δ5 uttrykk var assosiert med dårlig OS og DFS i stadium NSCLC pasienter tidlig. Disse observasjonene er i linje med andre rapporter hvori galectin-9-ekspresjon ble inverst korrelert med progresjon av kreft og pasientoverlevelse i en rekke forskjellige krefttyper, inkludert hudkreft, leverkreft, brystkreft og [34] – [36]. Flere nylig, Jiang et al. identifisert galectin-ni uttrykk som en selvstendig prognostisk faktor i en retrospektiv studie på 305 pasienter med magekreft. Igjen, lav galectin-9-ekspresjon ble assosiert med dårlig overlevelse [37].
Galectin-9Δ5 er en av de tre mest vanlige identifisert galectin-9 varianter. Disse spleisevarianter koder for protein isoformene som varierer i lengden på linkerområde mellom de to domenene CRD som påvirker multimer dannelse og valens [38], [39]. Tidligere data tyder på at de forskjellige galectin-9-isoformer har en divergerende rolle i tumorceller, f.eks de på en annen måte påvirke adhesjonen av celler til ECM og til endotelet [40]. Generelt har endret galectin-9 uttrykk blitt forbundet med unormal celle adhesjon, vekst og migrasjon [39]. Andre har beskrevet at galectin-9 kan påvirke celleoverlevelse, samt homo- og heterotypic celle aggregering [9], [34], [40] – [43]. Tap av galectin-9 uttrykk kan kompromittere vev integritet slik at kreftceller til intravasate i sirkulasjon og metastaserer. Faktisk, i brystkreft lav galectin-9 uttrykk var en bedre prediktor for fjernmetastaser sammenlignet med lymfeknute status [42]. Lignende observasjoner ble gjort i melanom og livmorhals plateepitelkarsinom [34], [44]. Men disse effekter avhenger av flere parametere, inklusive den spesifikke galectin-9 variant, den type celle og adhesjonen matrisekomponent til hvilken cellene binder [45]. Om og hvordan alle disse parametrene påvirker lungekreft progresjon krever videre studier. Eventuelt kan galectin-9 fungere som en kjemoattraktant for lungekreftceller, på samme måte som beskrevet for eosinofiler [46], [47] eller endoteliale celler [26]. Sammen med vår observasjon at stromale galectin-9Δ5 uttrykk forblir forhøyet i lungesvulster dette chemoattracting aktivitet indikerer at galectin-9Δ5 kan fungere som en veiledning kø for metastatiske tumorceller til å migrere mot stedet intravasation, dvs. blodkar. Dette kan fremme tumormetastase, spesielt hvis tap av galectin-9 i tumorceller resulterer i tap av vev integritet [45]. Endelig er det blitt rapportert at i dyremodeller og kreftpasienter, kan tumorceller frigi galectin-9 inneholdende exosomes som kan indusere T-celle-apoptose [48], [49]. Enten svulst endotelceller også utskille galectin-9 som inneholder exosomes må undersøkes nærmere, men slik mekanisme kan bidra til tumorprogresjon ved å tilby en måte å unnslippe immun overvåking.
Immunhistokjemisk vurdering av galectin-en og galectin- 9 proteinekspresjon viste forskjeller i lokalisering og fordeling innen tumorvevet. Disse observasjoner er i overensstemmelse med tidligere funn på forskjellige tumorer hvor begge galectin-1 og galectin-9-proteiner kan påvises i forskjellige avdelinger av tumoren, inkludert tumorceller, tumor stroma og tumor endotelceller [17], [23], [ ,,,0],30], [42], [44]. Ikke desto mindre protein ekspresjon hadde ingen prognostisk verdi i vår pasientgruppen. Mest sannsynlig er dette relatert til det faktum at immunhistokjemisk farging representerer en mer kvalitativ vurdering i stedet for en kvantitativ analyse. Dermed faktiske protein uttrykk nivåer kan ikke være nøyaktig kvantifisert ved IHC farging. Videre ingen galectin-9 antistoffer er tilgjengelig som gjenkjenner spesifikke spleisevarianter. Dette tyder på at i tilfelle av scenen NSCLC pasienter tidlig, bestemme galectin mRNA nivåer er av mer verdi for prognoseanslag i forhold til immunhistokjemisk farging.
Den største begrensningen med denne studien er relativt lav utvalgsstørrelse på 87 i forhold til det store antall parametere som ble analysert. Prøven tillatt størrelse innlemmelse av bare 5 kovariabler i regresjonsmodellen for å minimere risikoen for over-montering. I tillegg har vi kun tatt tidlig stadium NSCLC pasienter. Dermed ytterligere studier med større pasientgrupper og også inkludert senere stadier av NSCLC, dvs. stadium III /IV, kan gi mer innsikt i den prognostiske verdien av galectin mRNA uttrykk profilering.
I sammendraget, profilering omfattende galectin uttrykk bekreftet den prognostiske verdien av galectin-en og identifisert gal-9Δ5 som et potensielt nye prognostiske markører i tidlig stadium NSCLC. Identifisering av slike markører er viktig å identifisere pasienter som vil ha nytte av adjuvant kjemoterapi. I tillegg er våre funn eksemplifisere relevansen av profilering individuelle spleisevarianter av galectin-9. Det gjenstår å fastslå hvorvidt spleise variant-spesifikke profilering har en lignende fordel i andre krefttyper, inkludert de i hvilke generelle galectin-9 uttrykk er en prognostisk markør.
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
Galectin mRNA uttrykk profil i forskjellige NSCLC linjer. Det innfelte viser uttrykket av de tre galectin-9 spleisevarianter
Doi:. 10.1371 /journal.pone.0107988.s001 plakater (TIF)
bekreftelser
Forfatterne ville takke Dr. F. Galindo Garre for statistisk rådgivning og E. Aanhane for teknisk assistanse.
