Abstract
Thyroid kreft er den vanligste endokrine ondartet sykdom og forekomsten er økende.
DACT2
ble funnet ofte metylert i menneskelig lungekreft og leverkreft. For å utforske epigenetisk endring og rollen til
DACT2
i skjoldbruskkjertelen, ble syv skjoldbrusk kreft cellelinjer, 10 tilfeller av ikke-kreft i skjoldbruskkjertelen vevsprøver og 99 tilfeller av primær skjoldbrusk kreft prøver involvert i denne studien. DACT2 ble uttrykt og unmethylated i K1, SW579, FTC-133, TT, W3 og 8505C cellelinjer. Tap av ekspresjon og fullstendig metylering ble funnet i TPC-1-celler. Restaurering av DACT2 ekspresjon ble indusert ved 5-aza-2’deoxycytidine behandling. Det viser at uttrykket av
DACT2
ble regulert av promoter region metylering. I menneskets primære papillær skjoldbruskkjertelkreft, ble 64,6% (64/99) metylert og metylering av DACT2 var relatert til lymfeknutemetastase (p 0,01). Re-uttrykk for
DACT2
undertrykker celleproliferasjon, invasjon og migrasjon i TPC-1 celler. Aktiviteten av TCF /LEF ble inhibert med DACT2 i villtype eller mutant-p-catenin celler. Aktiviteten av TCF /LEF ble økt med co-transfeksjon DACT2 og Dvl2 i villtype eller mutant beta-catenin celler. Overekspresjon av vill type β-catenin fremmer celle migrasjon og invasjon i DACT2 stabilt uttrykt celler. Ekspresjonen av β-catenin, c-myc, cyclinD1 og MMP-9 ble redusert og nivået av fosforylert β-catenin (p-β-catenin) ble øket etter gjenopprettelse av DACT2 ekspresjon i TPC-1-celler. Ekspresjonen av β-catenin, c-myc, cyclinD1 og MMP-9 ble øket og nivået av p-β-catenin ble redusert etter knockdown av DACT2 i W3 og SW579-celler. Disse resultatene tyder på at DACT2 undertrykker human papillær skjoldbruskkjertelkreft vekst og metastase ved å hemme Wnt signalering. I konklusjonen,
DACT2
ofte metylert i papillær skjoldbruskkjertelkreft. DACT2 uttrykk ble regulert av promoter region metylering.
DACT2
undertrykker papillær skjoldbruskkjertelkreft spredning og metastase ved å hemme Wnt signal
Citation. Zhao Z, Herman JG, Brock MV, Sheng J, Zhang M, Liu B, et al. (2014) metylering av
DACT2
Fremmer papillær skjoldbrusk kreft metastase ved å aktivere Wnt signalnettverk. PLoS ONE 9 (11): e112336. doi: 10,1371 /journal.pone.0112336
Redaktør: Javier S. Castresana, Universitetet i Navarra, Spania
mottatt: 25 april 2014; Godkjent: 08.10.2014; Publisert: 06.11.2014
Copyright: © 2014 Zhao et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle relevante data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra National Basic Research Program (973 Program No. 2012CB934002, 2010CB912802), National Key Scientific instrument for spesielle program av Kina (Grant No. 2011YQ03013405), National High-tech R D Program (863 Program No. SS2012AA020314, SS2012AA020821, SS2012AA020303) og Science Foundation National of China (Grant No. 81121004, 81071953, 81161120432). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Thyroid kreft er den vanligste endokrine malignitet, og forekomsten er økende veldig fort globalt [1]. Follikulær epitelial celle-avledet i skjoldbruskkjertelen ble kategorisert i tre histologiske typer, inkludert papillær skjoldbruskkjertelkreft (PTC, 80%), follikulær kreft i skjoldbruskkjertelen (FTC, 15%), og anaplastisk tyreoideakreft (ATC, 2-5%). Mens medullær thyroid karsinom (MTC), som er utviklet fra parafollicular C-celler, er meget sjelden [2] – [4]. Selv om prognosen av skjoldbruskkjertelen carcinoma er mye bedre, er det fortsatt svært vanskelig å velge terapeutisk metode. Strategien med PTC behandling omfatter i hovedsak kirurgisk reseksjon, tilleggs radiojod ablasjon og tyreotropin undertrykkelse. Omfanget av thyroidectomy og lymphadenectomy fortsatt kontroversielt [5]. Epigenetiske endringene kan tjene som detektiv, prognostisk og terapeutisk markør i skjoldbruskkjertelen.
Dapper, en Dishevelled-forbundet antagonist av β-catenin (DACT), ble isolert ved en skjerm for proteiner i samspill med Dishevelled, en nøkkelfaktor i Wnt signalering. Dapper og Dishevelled var samlokalisert intracellulært og dannet et kompleks med Axin, gsk3 og β-catenin [6]. Menneskelig DACT2 ble identifisert ved Katoh et al. og befinner seg på det humane kromosom 6q27 [7]. Waxman JS og Li Xiao et al. funnet at DACT2 fremmer Wnt signalering under utvikling i sebrafisk og mus tenner [8], [9]. Våre tidligere studier har funnet at DACT2 er en Wnt /β-catenin signal inhibitor i lunge og leverkreft [10], [11]. I denne studien har vi analysert epigenetisk endring og funksjon DACT2 i papillær skjoldbruskkjertelkreft.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
Undersøkelsen ble utført i samsvar med retningslinjene fra 1975 Helsinkideklarasjonen og i samsvar med lokale regelverk og gode kliniske retningslinjer. Alle prøver ble samlet inn under de vedtatte retningslinjene i Beijing Cancer Hospital institusjonelle Review Board. Alle thyroid kreft-cellelinjer ble tidligere beskrevet [12] – [14]. De eksperimentelle metoder ble godkjent av etikkomiteen i den kinesiske PLA General Hospital (Permit Number: 20090701-015 og 20140423-001).
Primær menneskelig papillær skjoldbruskkreftprøver og cellelinjer
En totalt 99 tilfeller av primær papillær skjoldbruskkjertelkreft og 10 tilfeller av normal tyroideavev ble samlet som Dypfryst vev fra Beijing Cancer Hospital. Alle prøver ble samlet inn under de vedtatte retningslinjene i Beijing Cancer Hospital institusjonelle Review Board. 7 skjoldbrusk kreft cellelinjer (K1, TPC-en, SW579, FTC-133, TT, W3 og 8505C) ble inkludert i denne studien. Alle skjoldbrusk kreft cellelinjer ble tidligere etablert fra primær skjoldbruskkjertelkreft. K1, TPC-1, SW579, FTC-133 og TT-cellelinjer ble holdt i 90% RPMI 1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) supplere med 10% føtalt bovint serum (FBS) ved 37 ° C med 5% CO2. W3 og 8505C cellelinjer ble opprettholdt i 90% DMEM (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) supplere med 10% føtalt bovint serum ved 37 ° C med 5% CO2. Celler ble passert 01:03 når 80% samløpet ble nådd på en 75 cm2 kultur kolbe (NEST Biotechnology, Shanghai, Kina). Alle skjoldbrusk kreft cellelinjer brukt i denne studien ble rapportert tidligere [12] – [14]
5-aza-2′-Deoxycytidine behandlinger
Thyroid kreftcellelinjer ble delt til lav tetthet. 12 timer før behandling. Celler ble behandlet med 5-aza-2′-deoksycytidin (5-Aza) (Sigma, St. Louis, MO, USA) ved en konsentrasjon på 2 uM i vekstmediet, som ble byttet hver 24. time i totalt 96 timer behandlings . På slutten av behandlingsforløpet, ble RNA ekstrahert.
RNA isolering og vanlig PCR
Total RNA ble isolert ved hjelp Trizol reagens (Life Technologies, Gaithersburg, MD, USA). Agarosegelelektroforese og spektrofotometrisk analyse ble brukt for å evaluere RNA kvalitet og kvantitet. Først cDNA ble syntetisert i henhold til produsentens instruksjoner. En total på 5 pg total RNA ble benyttet for å syntetisere førstetråds-cDNA ved hjelp av Superscript III-revers transkriptase-sett (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Reaksjonsblandingen ble deretter fortynnet til 100 pl med vann. 2,5 ul fortynnet cDNA Blandingen ble anvendt for 25-pl PCR-reaksjon. PCR-primere er som følger: 5′-GGC TGA GAC AAC AGG ACA TCG-3 «(F) og 5′-GAC CGT CGC TCA TCT CGT AAAA-3′ (R). Den sykle tilstand er 95 ° C 5 min, (95 ° C 30 s, 64 ° C 30 s, 72 ° C 40 s x 3 sykluser (95 ° C 30 s, 61 ° C 30 s, 72 ° C 40 s ) x 3 sykluser (95 ° C 30 s, 58 ° C 30 s, 72 ° C 40 s) x 3 sykluser (95 ° C 30 s, 55 ° C 30 s, 72 ° C 40 s) x 24cycles, . 72 ° C 7 min GAPDH ble anvendt som en intern kontroll prim~~POS=TRUNC sekvensen er som følger:. 5»-GAC CAC AGT CCA TGC CAT CAC-3 «(F), og 5»-GTC CAC CAC CCT GTT GCT GTA- 3 «(R). Den sykle betingelsen er 95 ° C 5 min, (95 ° C 30 s, 63 ° C 30 s, 72 ° C 40 s) x 25cycles, 72 ° C 7 min.
bisulfitt modifikasjon, metylering spesifikk PCR (MSP) og bisulfitt sekvensering (BSSQ)
Genomisk DNA ble fremstilt ved hjelp av proteinase-K-metoden. Genomisk DNA ble bisulfitt-modifisert som beskrevet tidligere. MSP-primere ble utformet i henhold til genomiske sekvenser rundt transkripsjonell starte nettsteder (TSS) og syntetisert (BGI, Beijing, Kina) for å oppdage unmethylated (U) og denaturert (M) alleler MSP primere er som følger:. 5′-GCG CGT GTA GAT TTC GTT TTT CGC-3 «( MF), 5»-AAC CCC ACG AAC GAC GCCG-3 «(MR), 5′-TTG GGG TGT GTG Tags ATT TTG TTT TTTGT-3 (UF) og 5»-CCC AAA CCC CAC AAA CAA CAC CA-3 «(UR). Størrelsen på unmethylation PCR-produktet er 161 bp og metylering PCR produktet er 152 bp. Bisulfite behandlet DNA ble forsterket ved hjelp BSSQ primere flankerer de målrettede regioner, inkludert MSP primere nettsteder og transkripsjon start stedet. Sekvenseringsprimere var som følger: 5»-GGG GGA GGT YGY GGT GAT TT-3 «(F) og 5′-ACC TAC RAC RAT CCC AAC CC-3» (R). Bisulfite sekvensering ble utført som tidligere beskrevet [11].
Immunohistochemistry (IHC)
Immunohistochemistry (IHC) ble utført på 5 mikrometer tykke seriesnitt som stammer fra formaldehyd fiksert parafin blokker av papillær skjoldbruskkjertelkreft og paret nærliggende vev. Etter deparaffinization og rehydratisering, ble endogen peroksidaseaktivitet blokkert i 30 minutter i metanol inneholdende 0,3% hydrogenperoksyd. Etter antigen henting, en angrefrist på 20 minutter forut for inkubasjon med det primære antistoff. DACT2 antistoff (OriGene Tech, MD, USA) ble anvendt ved en 1/1000 fortynning over natten ved 4 ° C. Fargeintensitet, og utstrekningen av de fargede området ble gradert i henhold til den NIS-ELEMENTS bildebehandling (Nikon, Tokyo, Japan) fargeintensitet av cytoplasma (svak farging = 1; moderat farving = 2; sterk farging = 3); Graden av fargede celler (0% = 0, 0-5% = 1, 5-10% = 2, 10-15% = 3, 15-20% = 4). Den endelige immunreaktive score (0-12) ble bestemt ved å multiplisere intensitet poengsum til omfanget av fargede celler score.
Bygging av Lentiviral DACT2 ekspresjonsvektorer
Menneske full lengde
DACT2
cDNA (GenBank tilgangsnummer NM_214 462) ble amplifisert fra pCMV-DACT2 vektor [11]. Primere var som følger: 5′-TGA TCA ATG TGG ACG CCG GGC-3 «(F) og 5′-GTC GAC TCA CAC CAT GGT CAT GAC-3» (R). PCR-produktet ble deretter subklonet inn i pLenti6-GFP vektor. Innleggene ble verifisert ved restriksjons fordøyelsen og DNA-sekvensering.
Lentiviral infeksjoner og stabile uttrykk celler utvalg
293T cellelinjen ble opprettholdt i 90% DMEM (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) supplere med 10% føtalt bovint serum ved 37 ° C med 5% CO2. DACT2 uttrykt Lentivirus vektor ble transfektert inn HEK293T celler (5 × 10
6 per 100 mm skål) bruker Polyethyleneimine (P.E.I.) løsning på en 3:01 ratio (P.E.I. masse: DNA masse). Etter 48 timer ble virale supernatanten oppsamlet og filtrert. Deretter viral supernatant ble tilsatt til den voksende medium av TPC-1-celler og stabilt uttrykte celler ble selektert ved Blasticidin (Life Technologies, Gaithersburg, MD, USA) ved 0.2 ug /ml i 2 uker.
Celleviabilitet assay
Cellelevedyktigheten ble målt daglig i 72 timer under anvendelse av MTT (3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5-difenyltetrazoliumbromid) Kit (keygen Biotech, Jiangsu, Kina) ifølge produsentens anvisninger. Resultatene ble plottet som betyr ± SD.
Colony formasjon analysen
DACT2 stabilt uttrykt TPC-1 celler og DACT2 uuttalte TPC-1 celler ble fortynnet og reseeded 200 celler per brønn i 6- vel kultur plater i tre paralleller. Vekstmedium, kondisjonert med Blasticidin ved 0,2 pg /ml, ble byttet ut hver 24 time. Etter 14 d ble cellene fiksert med 75% etanol i 30 min og farget med 0,2% krystallfiolett for visualisering og telling.
Flowcytometri analyse
Etter 12 timer med synkronisering av serum sult, DACT2 stabilt uttrykte TPC-1-celler og DACT2 unexpressed TPC-1-celler ble dyrket med 10% føtalt bovint serum (FBS) i 24 timer. Cellene ble fiksert med 70% etanol og farget med 50 mikrogram /ml propidiumjodid (keygen Biotech, Jiangsu, Kina). Cellene ble deretter sortert etter FACS Caliber (BD Biosciences, San Jose, California) og analysert ved Modfit programvare.
Sårtilheling analysen
TPC-1 celler ble dyrket til sammenflytende monolag på 6- godt plater og en pipette ble brukt til å lage lineære skrape sår. Medium uten føtalt bovint serum ble anvendt for å inhibere celleproliferasjon. Wound bildene ble tatt med et digitalt kamera montert på lysmikroskop på 0, 36 og 72 timer. Såret gap bredder ble målt ved hjelp av Image J programvare
Transwell assay
Migrasjon.: TPC-1-celler ble tilsatt til det øvre kammer på 8,0 um porestørrelse Transwell apparat (Corning, NY, USA ) ved en tetthet på 4 x 10
4-celler (100 ul) pr kammeret og inkubert i 13 timer etterfulgt av fjerning av cellene som forble i den øverste kammer med bomullspinner. Invasion: Det øvre kammeret ble belagt med Matrigel (BD Biosciences, San Jose, California). TPC-1-celler ble tilsatt til det øvre kammer med en tetthet på 6 x 10
4-celler (100 ul) pr kammeret og inkubert i 36 timer etterfulgt av fjerning av cellene som forble i den øverste kammer med bomullspinner. Celler som penetrerte den nedre membranoverflaten ble fiksert i 4% paraformaldehyde, farget med 0,2% krystallfiolett, og telles i høy drevet felt (100 ×) med lysmikroskop.
Dual-luciferase reporter analysen
TPC-1-celler ble sådd ut ved 8 x 10
4 celler per brønn i 24-brønners kulturskåler 24 timer før transfeksjon. For å undersøke transkripsjonen aktivitet drevet av TCF /LSF, TPC-1 celler ble transfektert med 100 ng /brønn TOP flash reporter vektor (TCF /LSF-responsive reporter), 10 ng /brønn PRL-TK og PCI-neo-β-catenin uttrykke vektor (150 ng /brønn) ble brukt for å aktivere reportergenet; Som en negativ kontroll ble en annen gruppe av TPC-1-celler transfektert med 100 ng /brønn Fopflash reporter vektor, 10 ng /brønn PRL-TK styrevektor og β-catenin uttrykkende vektor (150 ng /brønn). Deretter, økende mengder av 150 ng /brønn DACT2 vektor og 150 ng /brønn Dvl2 vektor ble transfektert inn i cellene sammen med Topflash reporter vektor, PRL-TK styrevektor og pCI-neo-β-catenin for å evaluere den regulerende funksjon av DACT2 i Wnt signalveien.
48 timer etter transfeksjon ble relative luciferase aktiviteter målt med Dual luciferaserapportørplasmid analyse system (Promega, Shanghai, Kina) i henhold til produsentens protokoll. For hvert forsøk ble luciferase reporter analysen utført tre ganger [35].
DACT2 banket ned av siRNA
En valgt siRNA (siRNA618) [11] målretting DACT2 og RNAi negativ kontroll Duplex var anvendt i denne studien. Sekvensene var som følger: siRNA duplex (følelse: 5-HiG GGU UGA UGA GAC UAC UTT-3, anti: 5-AGU AGU CUC AUC AAC CGA CTT-3); RNAi negativ kontroll duplex (følelse: 5-UUC UCC GAA CGU HiG ACG UTT-3, anti: 5-ACG UGA CAC Guu CGG AGA ATT-3). RNAi oligonukleotid eller RNAi negativ kontroll duplex (Gene Pharma Co, Shanghai, Kina) ble transfektert inn W3 celler i henhold til produsentens instruksjoner.
Protein forberedelse og western blotting
Transfekterte celler ble lysert i RIPA lysis Buffer (Beyotime Biotech, Jiangsu, Kina). Protein lysater ble deretter separert ved SDS-PAGE og elektro-blottet på PVDF-membraner. Etter blokkering med 5% fettfri melk og 0,1% Tween-20 i TBS ble membranene inkubert med antistoffer. Antistoffene var som følger: DACT2 (OriGene Tech, MD, USA), cyclinD1 (BioWorld Tech, MN, USA), c-myc (BioWorld Tech, MN, USA), MMP-9 (BioWorld Tech, MN, USA), β-catenin (BioWorld Tech, MN, USA), fosfor-β-catenin (BioWorld Tech, MN, USA) og β-aktin (Beyotime Biotech, Jiangsu, Kina) .De blotter ble visualisert ved hjelp av forbedret chemiluminescence (Beyotime Biotech, Jiangsu , Kina).
Statistical Analysis
foreningen av DNA metylering og klinikk-patologisk faktorer i menneske papillær skjoldbruskkjertelkreft ble analysert av
χ
2
test for uavhengighet dikotome variabler og Students t-test for kontinuerlige variabler. Resultatene ble vurdert til å være statistisk signifikant på p 0,05 (*), p 0,01 (**), p 0,001 (***). Alle analyser ble utført ved hjelp av SPSS 19.0 programvare.
Resultater
DACT2
er brakt til taushet av promoter region hypermethylation i skjoldbruskkjertelen kreftceller
For å utforske uttrykk av
DACT2
i skjoldbruskkjertelen, ble vanlig PCR ansatt.
DACT2
uttrykk ble oppdaget i menneskeskjoldbruskkjertelkreft cellelinje K1, SW579, FTC-133, TT, W3 og 8505C ved vanlig PCR. Tap av
DACT2
ekspresjon ble påvist i TPC-1-cellelinje (Fig. 1A). Vi neste undersøkte
DACT2
metylering ved hjelp Metylering Spesifikke PCR (MSP) i disse cellelinjene. Fullstendig metylering ble funnet i TPC-1-celler og unmethylation ble funnet i K1, SW579, FTC-133, TT, W3 og 8505C cellelinjer (Fig. 1B). Tap av
DACT2
uttrykk ble korrelert med promoter region hypermethylation. For ytterligere å validere
DACT2
uttrykk ble regulert av promoter region metylering, ble skjoldbrusk kreft cellelinjer behandlet av 5-aza-2′-deoksycytidin (5-Aza). Re-uttrykk for
DACT2
ble funnet i TPC-en cellelinje og ingen uttrykk endringer ble avslørt i K1, SW579, FTC-133, TT, W3 og 8505C cellelinjer etter 5-Aza behandling (Fig. 1A ). Disse resultatene indikerer at
DACT2
uttrykk ble regulert av promoter region metylering. For å se effektiviteten av metylering spesifikke PCR (MSP) primere og metylering tetthet i
DACT2
promoter-regionen, utførte vi bisulfite sekvensering (BSSQ Fig. 1C). MSP resultater er konsistente med bisulfitt sekvense resultatene svært godt og
DACT2
promoter-regionen ble tett metylert i TPC-1 celler. Reserve metylering steder i promoter-regionen ble funnet i K1, W3 og SW579 celler
A:.
DACT2
uttrykk ble analysert ved vanlig PCR før (-) og etter (+) 5-Aza behandling. K1, TPC-en, SW579, FTC-133, TT, W3 og 8505C er skjoldbrusk kreft cellelinjer. H2O: double-destillert vann. GAPDH: internkontroll. B: MSP Resultatene viser
DACT2
metylering status. IVD (in vitro metylert DNA) tjente som metylering kontroll. NL (normal lymfocytt DNA) tjente som unmethylation kontroll. M: metylert lene; U: unmethylated alleler. C: Representative bisulfitt sekvense resultatene i
DACT2
promoter-regionen. Tohodet pil representerer MSP forsterkning regionen. Fylte sirklene representerer denaturert CpG nettsider og åpne sirkler betegne unmethylated CpG nettsteder. TSS. Transkripsjonen startwebstedet
DACT2
ofte metylert i primær papillær skjoldbruskkjertelkreft og metylering av DACT2 er assosiert med lymfeknutemetastase
For å utforske metylering endringer i
DACT2
i skjoldbruskkjertelen kreftutvikling, 99 tilfeller av primær papillær skjoldbruskkjertelkreft ble oppdaget av MSP. 64 tilfeller av avansert skjoldbruskkjertelkreft (64,6%) ble metylert (Fig. 2A). Ingen metylering ble funnet i 10 tilfeller av ikke-kreft i skjoldbruskkjertelen vevsprøver (Fig. 2B). Som vist i tabell 1, ble metylering av
DACT2
forbundet med lymfeknutemetastase signifikant (p 0,01). Ingen sammenheng ble funnet mellom
DACT2
metylering og alder, kjønn, røyking, drikking, familiehistorie og stråling historie. Resultatene tyder på at metylering av
DACT2
er assosiert med skjoldbrusk kreft metastasering. Over resultater indikerer at metylering av
DACT2
kan tjene som detektiv og metastatisk markør av papillær skjoldbruskkjertelkreft
A:. Representant MSP resultatene av
DACT2
i menneskets primære papillær skjoldbruskkjertelkreft . B: Representant MSP resultatene av
DACT2
i normal skjoldbrusk vev fra noncancerous pasienter. C: Representative DACT2 fargings resultater i papillær skjoldbruskkjertelkreft og tilstøtende vev bestemmes av IHC. (A, b, 200 x; c, d, 400 x). D: DACT2 uttrykk score er vist som boksplott, horisontale linjer representerer medianen poengsum; bunnen og toppen av boksene som representerer den 25. og 75. percentil, henholdsvis; vertikale linjene representerer spekter av uttrykk. DACT2 uttrykk er vesentlig forskjellig i 50 tilfeller av matchet svulsten og prøver tilstøtende vev, p 0,001. E: Foreningen for tap /reduksjon av DACT2 uttrykk og formidler hypermethylation ble analysert
x
2
test i 50 tilfeller av matchet primær skjoldbruskkjertelen papillær kreft og prøver tilstøtende vev. (P 0,05)
For å utforske foreningen av DACT2 uttrykk og promoter region hypermethylation i primær papillær skjoldbruskkjertelkreft, ble DACT2 uttrykk evaluert ved immunhistokjemi (IHC) i 50 tilfeller av. tilgjengelig matchet papillær skjoldbruskkjertelkreft og prøver tilstøtende vev. DACT2 farging ble observert hovedsakelig i cytoplasma som rapportert i andre kreftformer. Vi fant at DACT2 uttrykk ble redusert i papillær skjoldbrusk kreft vev sammenlignet med de tilstøtende vevsprøver (p 0,001, figur 2C og d.). Og redusert uttrykk var assosiert med DACT2 promoter region hypermethylation signifikant (p 0,05, Fig. 2E). Disse resultatene tyder på at DACT2 uttrykk er regulert av promoter region hypermethylation i primær papillær skjoldbruskkjertelkreft.
Restaurering av DACT2 uttrykk undertrykker cellevekst og induserer G1 arrest i skjoldbruskkjertelen kreftceller
For å evaluere effekten av DACT2 på skjoldbruskkjertelen carcinogenesis, ble cellenes levedyktighet og kolonidannelse evalueres før og etter gjenopprettelse av DACT2 ekspresjon i TPC-1-celler (fig. 3A). Celleviabilitet og kolonidannelse ble undertrykt etter re-uttrykk for DACT2 i TPC-1 celler (figur 3B og C, p. 0,01). Resultatene indikerer at DACT2 inhiberer tyreoideacancer celleproliferasjon. For ytterligere å forstå mekanismen, strømningscytometri-analyse ble benyttet. Fordelingen av celle faser i DACT2 unexpressed og re-uttrykt TPC-1cells var som følger: G0 /1 fase:. 32,24 ± 1,61%
vs
55,49 ± 3,09% (p 0,001); S-fasen: 38.06 ± 2.34%
vs
25,23 ± 1,15% (p 0,05);. G2 /M fase: 29,70 ± 3,38%
vs
. 19.27 ± 2.32% (p 0,05). Resultatene tyder på at G0 /1 fase ble øket, S-fasen og G2 /M fase ble redusert etter gjenopprettelse av DACT2 ekspresjon i TPC-1cells (Fig. 3D). Som vist i fig S1, ble det ikke apoptose indusert ved DACT2 i TPC-1 celler (p 0,05)
A.: Re-ekspresjon av DACT2 ble funnet etter transfeksjon av DACT2 ekspresjonsvektor i TPC-1-celler. B: MTT resultater: DACT2 undertrykker levedyktigheten til TPC-1 celler (p 0,001). C: Colony dannelse resultatene før og etter re-uttrykk DACT2 i TPC-1 celler. Hvert eksperiment ble gjentatt tre ganger (p 0,01). Hvit bar: tom vektor; svart strek: DACT2 uttrykk vektor. D: G1 arrest ble indusert ved DACT2 i TPC-1 celler. Hvert eksperiment ble gjentatt tre ganger (p 0,001). Hvit bar: tom vektor; svart strek. DACT2 ekspresjonsvektor
Restaurering av DACT2 uttrykk hemmer cellemigrasjon og invasjon i papillær skjoldbruskkjertelkreft
Som DACT2 metylering er assosiert med papillær skjoldbrusk kreft metastase, effekten av DACT2 på celle invasjon og migrering ble analysert i papillær thyroid kreft celler. Sårheling og transwell-analyse ble anvendt i denne studien. Som vist på fig. 4A og 4B, ble cellemigrering hemmet tilsynelatende etter re-ekspresjon av DACT2 i TPC-1-celler (p 0,001). I transwell analysen uten ECM belegg, antallet migrerte celler av hver enkelt høy drevet felt var 354,50 ± 47,44
vs
64,83 ± 4,48 før og etter re-ekspresjon av DACT2 i TPC-1-celler (fig.. 4C , p 0,001). Under invasjonen deteksjon, invasiv celle nummer til hver høy drevet feltet var 1091,40 ± 119,55
vs
31,58 ± 16,36 før og etter restaurering av DACT2 uttrykk (fig 4C, p. 0,001).. Det indikerer at DACT2 hemmer celle invasjon og migrasjon i skjoldbruskkjertelen. Over resultater antyde at DACT2 undertrykker skjoldbrusk kreft metastase
A:. Cell migrasjon ble undertrykt av DACT2 betydelig i TPC-1 celler under sårtilheling gjenkjenning. B: blå linje representerer den til sårheling resultat av tom vektor gruppe og den røde linje representerer den til sårheling resultat av DACT2 re-uttrykkes gruppe i TPC-1-celler i 72 timer (p 0,001). C:. Cell migrasjon og invasjon ble undertrykt av DACT2 i TPC-1 celler under transwell studien (p 0,001)
DACT2 hemmer Wnt /β-catenin signalisering i skjoldbruskkjertelkreft
i det kanoniske Wnt /β-catenin signalveien, blir økt β-catenin i cytoplasma fremmer translokasjon av β-catenin inn i kjernen. β-catenin i kjerner binder til TCF /LEF i flere typer kreft for transkripsjonen aktivering av gener nedstrøms, slik som cyclinD1, c-myc og MMP’er [15] – [21], som spiller viktige roller i kreftutvikling og metastasering. For å utforske effekten av DACT2 på Wnt signal i menneskelig skjoldbruskkjertelkreft, ble Topflash og (TCF /LSF) reporter system benyttes. Som vist i figur 5A, ble aktiviteten av TCF /LEF signifikant inhibert av DACT2. Det er lignende med vår tidligere rapport i human lungekreft [11], ble aktiviteten av TCF /LEF øket ved ko-transfeksjon av DACT2 og Dvl2 med villtype eller mutant-type β-catenin. For ytterligere å validere effekten av DACT2 på celle migrasjon og invasjon, ble β-catenin overexpressed i DACT2 stabilt uttrykt TPC-1 celler. Antallet migrerte celler på hver høy drevet feltet var 646 ± 158
vs
867 ± 118 før og etter overekspresjon av β-catenin i DACT2 stabilt uttrykt TPC-1 celler (figur 5B, p. 0,05). . Antallet invasiv celle for hver høy drevet felt var 35 ± 32
vs
100 ± 50 før og etter overekspresjon av β-catenin i DACT2 stabilt uttrykt TPC-1 celler (figur 5B, p. 0,05). . Resultatene videre foreslå at DACT2 undertrykker celle migrasjon og invasjon ved å hemme Wnt signal i menneskelig skjoldbruskkjertelkreft. Fosforylert β-catenin (p-β-catenin) er en hovedkomponent som representerer β-catenin degradering. I vår studie ble ekspresjonen av c-myc, cyclinD1 og MMP-9 reduseres, og nivået av p-β-catenin ble øket etter re-ekspresjon av DACT2 i TPC-1-celler (fig. 5C). For ytterligere å validere effekten av DACT2 på Wnt signal, ble siRNA knockdown teknikk ansatt. Ekspresjonen av c-myc, cyclinD1 og MMP-9 ble økt, og nivået av p-β-catenin ble redusert i DACT2 uttrykt W3 og SW579-celler (fig. 5C). Over resultater tyder på at DACT2 undertrykker skjoldbruskkjertelkreft celleproliferasjon og metastase ved å hemme Wnt signal
A:. Resultater av TCF /LSF luciferase reporter analysen. β-catenin ekspresjonsvektor var co-transfektert med TCF /LSF Topflash reporter eller sin mutant, Fopflash i TPC-1 celler. Luciferase aktiviteten ble normalisert til Renilla luciferase aktivitet. Relativ luciferaseaktivitet (forholdet mellom ildflueluciferase til Renilla luciferase) ble undertrykket ved DACT2. Forsøket ble gjentatt tre ganger (* p & 0,05). Økt luciferase aktivitet ble indusert ved co-transfeksjon DACT2 og Dvl2. Forsøket ble gjentatt tre ganger (* p & 0,05). B: Cell migrasjon og invasjon ble økt med β-catenin i DACT2 stabilt uttrykt TPC-1 celler under transwell studien. Forsøket ble gjentatt tre ganger (p 0,05). C: Ekspresjon av β-catenin, c-myc, cyclinD1 og MMP-9 ble redusert og nivået av fosforylert β-catenin (p-β-catenin) ble øket etter gjenopprettelse av DACT2 ekspresjon i TPC-1-celler. Ekspresjonen av β-catenin, c-myc, cyclinD1 og MMP-9 ble øket og nivået av p-β-catenin ble redusert etter at slå ned DACT2 i W3 og SW579-celler.
diskusjon
Det er ønskelig å administrere skjoldbruskkjertelkreft personlig basert på biomarkører. Så langt ingen pålitelig biomarkør ble funnet for å forutsi prognose og radio eller chemo-følsomhet i skjoldbruskkjertelkreft [22], [23]. Epigenetiske forandringer ble funnet ofte i humane kreftformer, inkludert skjoldbruskkjertelkreft [24] – [29]. DNA metylering kan tjene som diagnostiske, prognostiske, chemo-sensitive og radio-sensitive markører [30] – [35]. Silenced uttrykk for den viktigste komponenten av DNA metylering i kreftrelaterte signalveien kan bli den terapeutiske mål [34] – [37]
Xenopus Dapper og Xenopus Frodo er Dishevelled bindende proteiner, som viser 89% total-amino. -syre identitet [38]. Xenopus Dapper hevdes å inhibere β-catenin veien, så vel som JNK-reaksjonsveien, mens Xenopus Frodo er hevdet å aktivere β-catenin veien [6], [39]. DACT1 og DACT2 er menneskelige homologer av Xenopus Dapper og Frodo, som er Dishevelled bindende proteiner. DACT1 og DACT2 gener, bestående av fire eksoner, ble funnet å kode for DACT1 protein (799-amino-syrer) og DACT2 protein (774-aminosyrer), respektivt. DACT1 og DACT2 viste 28,8% total-amino-syre identitet. Syv Daph domener, inkludert DAPH2 (leucine glidelås), DAPH3 (serin rik) og DAPH7 (PDZ bindende), ble konservert mellom DACT1 og DACT2. DACT1 og DACT2 gener ble kartlagt til menneskelig kromosom 14q22.3 og menneskelig kromosom 6q27, henholdsvis [7]. Menneskelig kromosom 14q22.3-32.1 slettes i astrocytom [40]. Humant kromosom 6q27 er en region med hyppig tap av heterozygositet i humane cancere [41] – [47]. Basert på Evolutionary og funksjonell bevaring av Wnt signalmolekyler samt menneskelige kromosom lokalisering, ble DACT1 og DACT2 gener spådd å være potente kreft-assosiert gener. Fersk studie antydet at DACT2 hemmer Pitx2 aktivere Wnt signal i fosterutviklingen tann [8]. Våre tidligere undersøkelser funnet at DACT2 ofte metylert i lunge og leverkreft, og metylering av DACT2 aktiverer Wnt signalering [10], [11]. For ytterligere å forstå hvilken rolle DACT2 i skjoldbruskkjertelen, vi har oppdaget arrangøren regionen metylering i papillær skjoldbruskkjertelkreft først. DACT2 blir ofte denaturert i human papillær kreft i skjoldbruskkjertelen og metylering av DACT2 er forbundet med lymfeknutemetastase. Disse funnene tyder på at DACT2 metylering kan tjene som detektiv og prognostisk markør for papillær skjoldbruskkjertelkreft. Den sårheling og transwell-analyse ble benyttet for å evaluere effekten av DACT2 thyroid kreft metastasering. Som forventet, re-uttrykk for DACT2 hemmer celle migrasjon og invasjon i TPC-1cells. Uttrykket av MMP-9 ble redusert etter restaurering av DACT2 uttrykk i TPC-1cells og økt etter knockdown av DACT2 i W3 og SW579 celler. Som DACT2 uttrykk ble regulert av promoter region hypermethylation i papillær skjoldbruskkjertelkreft, kan DACT2 metylering involvere i skjoldbruskkjertelen kreftutvikling. For å svare på disse spørsmålene, ble funksjonen til DACT2 videre undersøkt. Celleproliferasjon og kolonidannelse ble hemmet, og G1 fase arrest ble indusert ved DACT2 i skjoldbruskkjertelen kreftceller.
