Abstract
Mutasjoner av adenomatøs polypose coli (
APC
) genet er vanlig og sterkt assosiert med utvikling av kolorektal adenomer og karsinomer. Mens omfattende studert i moderne befolkninger, rapporter om visceral svulster i gamle befolkninger er knappe. Så langt vi kjenner til, genetisk karakterisering av mutasjoner assosiert med tykk- og endetarmskreft i gamle prøvene er ennå ikke beskrevet. I denne studien har vi sekvensert hotspots for mutasjoner i APC genet isolert fra 18
th århundre naturlig konservert menneskelige ungarske mumier. Mens villtype APC sekvenser ble funnet i to mumier, oppdaget vi E1317Q missense mutasjon, kjent for å være en tykktarmskreft predisponerende mutasjon, i en tykktarmen vev av en 18
århundre mumie. Våre data tyder på at dette genetisk predisposisjon for kreft allerede eksisterte i pre-industrialisering æra. Denne studien krever tilsvarende undersøkelser av gamle prøver fra ulike perioder og geografiske steder som skal utføres og delte i den hensikt å oppnå en større skala analyse som vil belyse tidligere kreftepidemiologi og på kreft evolusjon
Citation.: Feldman M, Hershkovitz jeg, Sklan EH, Kahila Bar-Gal G, Pap jeg, Szikossy jeg, et al. (2016) Påvisning av en tumorsuppressorgen Variant disponerer for tykktarmskreft i en 18th Century ungarsk Mummy. PLoS ONE 11 (2): e0147217. doi: 10,1371 /journal.pone.0147217
Redaktør: David Caramelli, Universitetet i Firenze, Italia
mottatt: 30 september 2015; Godkjent: 30 desember 2015; Publisert: 10 februar 2016
Copyright: © 2016 Feldman et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. All relevant data er innenfor papir
Finansiering: Dette arbeidet ble støttet av:. Dan David Foundation; Den Tassia og Dr. Joseph Meychan styreleder i historie og filosofi of Medicine. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
tykktarms~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP er en viktig årsak til sykelighet og dødelighet i vestlige land [1,2]. Forbedringer i tidlig oppdagelse og behandling har ført til nedgang i dødelighet, mens forekomsten er økende [3]. Vanligvis er forløpere for tykktarmskreft er adenomatøse polypper, som er godartede neoplastiske klumper av celler [4]. De fleste sporadiske adenomatøse polypper samt mest kolorektal kreft inneholde typiske genetiske endringer [5].
adenomatøs polyposis coli (APC)
er en viktig tumorsuppressorgen som er plassert på det humane kromosom 5q21. Mutasjoner i APC er sterkt forbundet med utviklingen av kolorektal adenomer og karsinomer [6]. Omtrent 50% av befolkningen vil utvikle kolorektale polypper initiert av slike mutasjoner under en normal levetid [7]. Somatiske mutasjoner av APC-genet ble påvist ikke bare i pasienter med kolorektal karsinom, men også hos pasienter med kreft i bukspyttkjertelen [8], magekreft [9], oral karsinomer [10], hepatoblastoma, brystkreft, hjernetumor og desmoid tumor [11]. Omtrent 80% av somatiske mutasjoner i APC genet forekommer i bestemte «hot spot» og er samlet innenfor en region fra kodon 764 til kodon 1596 kalt Mutation Cluster Region (MCR). Mer enn 95% er kjede-terminerende mutasjoner som resulterer i ekspresjon av avkortede protein. Inaktivering av begge alleler av APC er nødvendig for utvikling av de fleste svulster i tykktarmen og endetarmen [12].
Kreft har tidlige dokumentasjoner. Egyptisk medisinsk papyrus dateres så langt tilbake som 1500 f.Kr. har blitt funnet å beskrive svulster. Herodot og Hippokrates både nevne kreft [13-15]. De fleste paleopathological rapporter om svulster i siste populasjoner er basert på skjelett vev som er mer rik på arkeologiske steder. Imidlertid har enkelte svulster i bløtvev blitt rapportert [16-26]. Mens det er mange teorier om utbredelsen av kreft i våre dager, som assosierer kreft med livsstil, kosthold, fysisk inaktivitet og reproduktive mønstre, mer informasjon fra ulike tidspunkter i historien er nødvendig for å bedre forstå hvilken rolle disse faktorene i historiske populasjoner .
Natural mumifisering muliggjør bevaring av bløtvev. Prøver fra mumifiserte vev kan gi uvurderlig informasjon fra antropologiske, historiske og medisinske synspunkter. De kan lære oss noe viktig om utviklingen av sykdommer som kan være av verdi for å forutsi fremtidige evolusjonære endringer. I 1994 og 1995 enn 265 mumier ble gravd fra forseglede krypter i dominikanerkirken i Vác, Ungarn. Krypter ble brukt kontinuerlig i begravelser av flere middelklassefamilier og geistlige, 1731-1838. Temperaturen i krypter varierte mellom åtte til elleve grader Celsius, krypter var dårlig, men stadig ventilerte og restene ble beskyttet mot fuktighet av furuspon som fylte mange av kistene. Disse var ideelle forhold for naturlig bevaring forårsaker omtrent 70% av de døde for å være helt eller delvis mumifisert. Bevaring nivået av de mumifiserte vevsprøver og rikelig samtidige arkiv informasjon om enkeltpersoner i den ungarske mumien samling motivert en morfologisk og genetisk studie av menneskelige levninger [27]. Tidligere studier funnet genetiske bevis for
Mycobacterium tuberculosis product: (
M
.
tuberkulose
) nærvær i disse mumiene [28-34], noe som indikerer at denne gruppen kan brukes til genetisk studier. I tillegg omfatter denne kohort av individer som danner en bred aldersfordeling. Det er således kompatibel med studiet av cancerassosierte mutasjoner, ettersom risikoen for slike mutasjoner øker med alderen [3]. Her brukte vi VAC mumier å vurdere eksistensen av genetisk predisposisjon for tykktarmskreft i pre-industrialisering æra av sekvensering av «hot spots» i APC genet. Tre slike sekvenser ble forsterket og sekvensert fra 3 forskjellige mumier. APC variant E1317Q, kjent for å disponere for kolorektal kreft ble oppdaget i et kolon prøve av en mumie. Selv om bare noen få APC-sekvenser ble oppnådd i nærvær av E1317Q varianten i DNA av en 18
th individ tallet antyder at genetisk predisposisjon for cancer allerede eksisterte i industrialisering pre-era. Denne studien krever imidlertid en større skala analyse for epidemiologiske sammenligningsformål.
Materialer og metoder
Prøver og forholdsregler mot forurensning
Det 18. århundre «Vác Mummy Collection» ligger og kuratert i Department of Anthropology av den ungarske Natural History Museum i Budapest, Ungarn. Samlingen inneholder 265 naturlig mumifiserte, delvis mumifiserte og skjelett prøver (registrert under inventarnummer: 2009.19.1-2009.19.264). Totalt 51 prøver ble oppnådd fra 20 Vác mumier (tabell 1). Prøvene ble samlet i antropologi Institutt for det ungarske Natural History Museum i henhold til forskrift om behandling av arkeologiske menneskelige levninger i Ungarn [35]. Ingen gamle DNA arbeid forsterke menneskets gener ble gjort på stedet. Prøvetaking ble utført med tiltak for å hindre moderne forurensning av prøvene. Prøvene ble tatt ved hjelp av en no-touch teknikk med engangsskalpeller, fra indre organer. Disse anatomiske regioner ble ikke tidligere eksponert for det ytre miljøet, og derfor ble beskyttet mot kontakt med gravemaskiner eller andre som har håndtert mumiene. Prøvene ble plassert i sterile DNA gratis rør og lagres i romtemperatur.
DNA ble ekstrahert i en utpekt gamle DNA (aDNA) laboratorium. For å hindre forurensning av moderne DNA rørene ble åpnet bare i en utpekt UV eradiated hette hvor DNA-ekstraksjon ble gjennomført. Den aDNA laboratoriet var fysisk isolert fra laboratoriet hvor moderne DNA ble anvendt. Prosedyren ble utført i sterile UV kamre hver utstyrt med eget sett med pipetter, engangs sterile rør, filtrer tips, Molecular Biology Grade reagenser og løsninger. Engangs verneklær ble brukt og endres ofte. Separate UV-bestrålt hetter ble brukt til DNA forberedelse, DNA-ekstraksjon og PCR forberedelse. For ytterligere å redusere tids DNA-kontaminering alle reagenser, rør og instrumenter slik som engangsskalpellblader ble bestrålt med UV før bruk. Flere negative kontroller for utvinning og forsterkning ble tatt med for å sikre ektheten av Adna funnene. Adna protokoller fulgt de krav som stilles til feltet [36].
DNA-ekstraksjon
DNA ble ekstrahert fra mumifisert vev ved hjelp av en modifikasjon av guanidintiocyanat (GuSCN) metode utviklet av Boom R et al . [37] og det silisiumdioksyd-baserte rensemetode som er utviklet av Höss M eventuelle uklarheter ble visuelt løst. Sekvenser med dårlig kvalitet kromatogrammene ble ekskludert fra studien. En endelig contig av alle sekvensene ble generert ved hjelp av en publisert referanse. Delvis mitokondrie-profiler ble bestemt for mumiene, for alle ansatte som arbeider på aDNA laboratorium og for alle prøve samlere. For å kontrollere for forurensning under eller etter prøvetaking, ble delvis mitokondrielle profiler og delvis APC sekvenser hentet fra mumien prøvene i forhold til referansesekvenser og profiler av laboratoriepersonalet (tabell 3 og 4). Sekvenser oppnådd fra mamma prøvene ble også sammenlignet med hverandre for å kontrollere for kryss-kontaminering. Vi merker at de gamle partielle mitokondrie profiler og de gamle kromosom sekvensene kan bli påvirket av postmortem deaminering prosesser [42]. Dermed kan enkelte observerte overganger tilskrives DNA skade og ikke for mordyret arvet eller kromosom erstatninger hhv. Post mortem DNA-skader påvirker ikke vår analyse forsøkte å kontrollere for forurensning ved å teste om mumier har samme SNP mønster som forskere og påvirker ikke observert transvertions. Imidlertid bør konsekvensene av DNA-skader vurderes i tilfelle sekvensene brukes til andre formål.
Resultater
APC er en viktig tumor suppressor genet. Mutasjoner i APC er sterkt forbundet med utviklingen av kolorektal adenomer og karsinomer [6]. For å vurdere tilstedeværelsen av genetisk predisposisjon for kolorektal kreft i industrialisering pre-era vi forsøkte å forsterke MCR-regionen i APC-genet fra DNA oppnådd fra indre organer av VAC mumier. Delvis sekvenser av APC genet MCR-regionen ble vellykket hentet fra tre mumier. To villtype APC-sekvenser ble oppnådd fra to mumier tallene 51 og 63 (tabell 3, figur 1 og 2). Sekvensene til APC-genet MCR (stilling 4377-4484 og posisjon 3956-4068) ervervet fra et kolon vevsprøve av mamma 88 (tabell 3, figur 1 og 2) viste at dette individet var homozygotisk for en missense mutasjon i kodon 1317 ( GAA CAA) (figur 1 og 3). Dette er en kjent APC genetisk variasjon som erstatter glutamin en uladet hydrofil aminosyre med glutamat en sur hydrofil aminosyre (E1317Q). Denne mutasjonen har blitt koblet med en predisposisjon for utvikling av flere colorectal adenomer og kolorektal kreft [43]. Resten av APC MCR partielle sekvens for dette mamma var identisk med referanse (NM_000038.5) som koder for villtype-proteinet. Sekvensene til alle forskere som håndteres prøven eller utstyrs ble funnet å være identisk med referanse.
Partiell APC-sekvenser amplifisert med primere APC1309 sammenlignet med NCBI referansesekvensen NM_000038.5. Laboratorie ansatte, er angitt med initialer. Gamle prøvene er angitt med en mumie tall. Sekvenseringsprimeren er understreket i referansesekvensen. Mamma nummer 88 er den eneste bærer av E1317Q mutasjon.
Delvis APC sekvenser som ble forsterket med primere APC1450 er i forhold til NCBI referansesekvensen NM_000038.5. Sekvenseringsprimeren er understreket i referansesekvensen. Disse delvis APC sekvenser av de to mumier var identisk med referanse sekvens som koder for villtype protein.
Uthevet er homozygot G → C E1317Q missense mutasjon.
Mitokondriell aDNA ble bevart i 50% av mumier som ble testet (tabell 1). Delvis mitokondrie profiler (posisjoner 16004-16442) ble bestemt for de 3 mumier for hvem ble hentet de APC MCR sekvenser (Tabell 4). Mamma 51 og 63 viste en unik profil forskjellig fra Cambridge referansesekvensen (NC_012920.1), forskjellig fra hverandre og forskjellig fra profilene oppnådd fra alle behandlingsprogrammer. PCR-amplifikasjon detekterer mitokondrie DNA med større følsomhet sammenliknet med påvisning av kromosomalt DNA. Denne forskjellen i følsomhet er forklart i hovedsak ved et høyere kopitall pr celle i mitokondrie DNA [44,45]. Således, dersom prøven var blitt forurenset med moderne DNA er det sannsynlig moderne mitokondrie DNA ville ha blitt detektert. De unike profiler av mumiene indikerer at sekvensene som oppnås for de to mumier er ekte, og at det var ingen krysskontaminering mellom mumien prøvene.
Den delvise mitokondrie sekvensen av mumie 88 var identisk med Cambridge referansesekvensen . Blant forskerne, bare delvis mitokondrie sekvenser av Dr. Rosin-Arbesfeld (R.R.A) og professor Hershkovitz (I.H), som deltok i innsamlingen av prøvene, var identisk med Cambridge referansesekvensen som forventet på grunn av deres europeisk opprinnelse. Likevel, observasjon av E1317Q mutasjon kan ikke være på grunn av forurensning av mumien 88 av DNA fra Dr. Rosin-Arbesfeld eller Prof. Hershkovitz siden heller ikke de eller noen annen av forskerne, har APC E1317Q mutasjon (Fig 1).
Diskusjoner
Vi har funnet APC tull mutasjon E1317Q i en prøve fra tykktarmen vev utvinnes fra en 18
århundre mumie. Villtype APC sekvenser, på samme sted, ble hentet fra to andre mumier fra samme kolleksjon.
Evnen til å hente genetisk materiale fra gamle vev var en enorm skritt fremover i å forstå evolusjonære historien til sykdommer. Mens de fleste sykdoms Adna studier fokusert på den gamle patogen DNA [46-48], har genetisk forskning på kreft i historiske populasjoner blitt noe neglisjert. Det er rapporter om svulster eller godartede svulster i gamle eksemplarer; noen selv gå tilbake til dinosaurtiden [49]. Men, disse er hovedsakelig basert på tilstedeværelse av spesifikke benlesjoner eller histologiske studier og ikke genetisk informasjon. I Ungarn tilfeller av osteosarkom; myelom; og metastatisk karsinom ble rapportert i historiske prøver [50-53]. Så langt vi kjenner til, kreft eller mutasjoner assosiert med kreft har ikke blitt rapportert i gamle DNA-studier.
Mangelen på rapporter om svulster i gamle mykt vev forblir i forhold til det store antallet obduksjoner utført på mumier har ledet noen forskere til hypoteser som maligniteter var sjeldne i tidligere populasjoner i forhold til moderne tid på grunn av den korte levetiden for enkeltpersoner som utelukket utvikling av kreft [15,24]. Motsatt paleopathological rapporter basert på undersøkelse av skjelettrester foreslår tumor var lik mellom fortid og moderne befolkninger undersøkt [20,23]. Historiske beretninger viser at forventet levealder var statistisk senket med spedbarn og mødredødelighet og ennå mange mennesker lever til en tilstrekkelig høy alder for å utvikle andre mellomalderdommen sykdommer, som degenerative sykdommer [15]. En annen hypotese prøver å forklare sjeldenhet av svulster i det gamle bløtvev er at svulster ikke kan være godt bevart i mumifiserte vev post mortem. Men eksperimentelle studier viser at mumifisering bevarer funksjonene til malignitet [54]. Derfor, i et gammelt samfunn som mangler kirurgisk inngrep, bevis for kreft, hvis eksistert i vevet, bør forbli i alle bevart mumifiserte prøver. Fakta arkeologiske myke vevsprøver er knappe i forhold til skjelettrester [55] presenterer en utfordring for analyse av gamle kreftrelaterte genetiske data på grunn av den lille størrelsen på utvalget. Dette understreker viktigheten av opphopning av data fra studier som dette, slutt å skape et tilstrekkelig database for senere studier. De siste årene har bruken av neste generasjons sekvensering (NGS) blitt vanlig i det gamle DNA forskning [56]. Hagle sekvensering ble implementert av Kay et al. 2015 for å generere
M
.
tuberkulose
genomsekvenser fra skjelett og bløtvev av VAC mumier, viser at bakterie hele genomet data kan hentes fra mumifiserte vev generelt og fra Vác mumien samling spesielt [33]. Imidlertid, basert på de data som rapporteres av Kay et al. [33], er den gjennomsnittlige fold dekning for de menneskelige genom svært lav (ikke mer enn 0,09 ganger gjennomsnittlig dekning), noe som indikerer målrettet DNA berikelse ville være nødvendig for å analysere spesifikke kromosomale regioner som APC MCR-regionen. Videre humant helt genom data har hittil ikke blitt oppnådd fra mumifisert vev. Derfor valgte vi å ansette den klassiske tilnærmingen av PCR forsterkning og direkte sekvensering for å karakterisere APC genmutasjoner fra VAC mumier. Siden den klassiske tilnærming er mer begrenset i evnen til å adressere forurensning, ble strenge tiltak brukt for å hindre DNA-kontaminering under prøve behandling som er beskrevet i metode del; herunder sammenligning av APC-sekvenser av mumier med de av alle prøvebehandlingsprogrammer. Våre funn bekrefter at isoleringen av spesifikke kreftrelaterte kromosomale regioner fra mumifiserte vev er gjennomførbart og kan motivere fremtidige utviklingen av berikelse arrays som mål å fange opp DNA-områder relatert til malignitet. Slike tilnærminger kan øke DNA avkastning for disse områdene av interesse og kan kombineres med NGS teknikker for å gi ytterligere metode for godkjenning og et bredere syn på kreft evolusjon.
tykktarmskreft oppstår som den kumulative effekten av flere mutasjoner i mange gener som tillater cellen å flykte fra regulatoriske kontroller som fører til ukontrollert proliferasjon. Disse mutasjonene kan være arvelig eller somatisk og sistnevnte kan i stor grad påvirket av miljøfaktorer (f.eks røyking, luftforurensning og ernæring) [57].
Studier som undersøker forholdet mellom APC E1317Q mutasjon og endetarmskreft har vist forskjellige resultater. Mens noen studier tyder på at mutasjonen bidrar til en predisposisjon for tykktarms adenomer og karsinomer med lav og variabel pene [58,59], andre hevder at varianten er assosiert med bare en moderat økning i risikoen for tykktarmskreft [60-62]. Valget av kontrollgruppen i noen av studiene som ikke finner en betydelig høyere risiko for tykktarmskreft skyldes E1317Q har blitt kritisert og ble foreslått til å være årsaken til motsigelse om E1317Q effekt på tykktarmskreft [43]. Således kan en mulig rolle for E1317Q i kolorektal tumor genesis eksistere og bør studeres nærmere. Det har vært antydet E1317Q har subtile effekter på β-catenin håndtering eller degradering, men den nøyaktige molekylære mekanismen som forårsaker predisposisjon for tykktarmskreft er ukjent [59].
Våre data tyder på at enkelte 88 kan ha hatt en predisposisjon for utvikle kolorektal adenomer og karsinomer, men vi kan ikke si om disse forholdene faktisk manifestert i denne personen. Den morfologiske bevaring av mumifiserte tykktarmen vev var ikke tilstrekkelig til en visuell differensiering adenomer eller karsinomer fra normalt vev. Det faktum at mumien 88 var homozygot for APC E1317Q sekvensen øker noe sannsynligheten for manifestasjon som det er mulig å spekulere i at homozygousity ble forårsaket av et tap av heterozygousity hendelse som er vanlig i neoplasi og er ofte funnet i pasienter med kolorektal kreft som viser APC tap av funksjon [63]. Som E1317Q APC varianten er sjelden i den generelle moderne befolkning (0,3%, NCBI SNP database rs1801166) [40], er sjansene for å arve en mutert allel fra hver av foreldrene er svært lav som øker muligheten for at en somatisk mutasjon hadde faktisk skjedd. Likevel har vi ikke data på mumien 88 familie historie eller av allelet frekvens på 18
århundre Ungarn, derfor kan vi ikke utelukke arv homozygousity for E1317Q i dette tilfellet. Fravær av mutasjonen i vev tatt fra andre øvrige organer, ville ha bekreftet mutasjon være somatiske og ikke en arvelig bakterie-line mutasjon. Dessverre har det genomiske DNA bevaring nivå i de andre vev samplet fra mamma 88 (lever) var ikke tilstrekkelig for vellykket amplifikasjon av de genomiske sekvenser som APC. Generelt somatiske mutasjoner i denne delen av MCR av APC genet er mer vanlig i moderne befolkninger enn bakterie linje mutasjoner [64].
Overvekt, fysisk inaktivitet, en diett høy i rødt eller bearbeidet kjøtt, alkohol forbruk og langsiktig røyking er spesifikke risikofaktorer for tykktarmskreft [3]. Disse risikofaktorene var mindre hyppig til ikke-eksisterende i pre-industrialisert 18
århundre Ungarn [65,66]. Frekvenser av kreft i historiske populasjoner, for eksempel 18
århundre ungarske befolkning kan ha sammenheng med fravær av moderne livets miljøfaktorer som bruk av tobakk eller forurensning [57,67]. Selv om APC MCR er en genomisk region ofte mutert i dagens befolkning [68], den eneste mutasjon påvist i APC MCR sekvenser hentet fra de 3 mumier var E1317Q i mumie 88. Denne informasjonen kombineres med fremtidige data fra lignende studier som spenner over ulike tider og steder kan belyse sammenhengen mellom forekomst av kolorektal kreft disponerende mutasjoner og historisk livsstil. Menneskelige samfunn har gjennomgått enorme livsstil og miljøendringer i løpet av de siste århundrene. Muligheten til å sammenligne spekteret av historiske mutasjoner til moderne spekteret synes viktig for forståelsen av etiologi og molekylære patogenesen av neoplasi. Våre data, noe som indikerer tilstedeværelse av en kreftsykdom disponerende mutasjon og muligens kreft i en person fra 18
århundre kombinert med data som blir samlet fra fremtidige Adna studier kan gi et mer komplett bilde av kreft epidemiologi.
takk
Vi vil gjerne takke Nir Skalka og Hila mai for å hjelpe med laboratoriearbeid.
