Abstract
Prostatakreft (PCA) er den vanligste typen kreft hos menn i USA, som uforholdsmessig påvirker afroamerikanske utforkjøringer. Mens metastaser er den vanligste dødsårsaken blant PCA pasienter, har ingen spesifikke markører blitt tildelt alvorlighetsgrad og etnisk biasness av sykdommen. MicroRNAs representerer en lovende ny klasse av biomarkører på grunn av deres iboende stabilitet og elastisitet. I denne studien undersøkte vi potensielle mirnas som kan brukes som biomarkører og /eller terapeutiske mål og kan gi innsikt i alvorlighetsgraden og etniske biasness av PCa. PCR utvalg ble utført i FFPE PCA vev (5 kaukasisk amerikanske og fem afrikanske amerikansk) og utvalgte forskjellig uttrykt mirnas ble validert ved QRT-PCR, i 40 (15 CA og 25 AA) sammen PCa og tilstøtende normalt vev. Betydelig deregulerte mirnas ble også analysert i urinprøver for å utforske sitt potensial som ikke-invasiv biomarkør for PCa. Ut av 8 mirnas valgt for validering av PCR-array-data, MIR-205 (
p
0,0001), mir-214 (
p
0,0001), MIR-221 (
p
0,001) og Mir-99b (
p
0,0001) signifikant nedregulert i PCA vev. ROC-kurven viser at alle fire mirnas hell diskriminert mellom PCa og tilstøtende normale vev. MiR-99b viste signifikant nedregulering (
p
0,01) i AA PCA vev i forhold til CA PCA vev og kan være relatert til aggressivitet forbundet med AA befolkningen. I urin, MIR-205 (
p
0,05) og Mir-214 (
p
0,05) var signifikant nedregulert i PCA pasienter og kan diskriminere PCA pasienter fra friske individer med 89 % sensitivitet og 80% spesifisitet. I konklusjonen, denne studien viste at MIR-205 og MIR-214 er nedregulert ved PCA og kan tjene som potensielt ikke-invasiv molekylær biomarkør for PCa
Citation. Srivastava A, Goldberger H, Dimtchev A, Ramalinga M , Chijioke J, Marian C, et al. (2013) mikroRNA Profilering i Prostate Cancer – Diagnose potensialet i urin MIR-205 og MIR-214. PLoS ONE 8 (10): e76994. doi: 10,1371 /journal.pone.0076994
Redaktør: Rakesh K. Srivastava, The University of Kansas Medical Center, USA
mottatt: 5 juli 2013; Godkjent: 04.09.2013; Publisert: 22 oktober 2013
Dette er en åpen-tilgang artikkelen, fri for all opphavsrett, og kan bli fritt reproduseres, distribueres, overføres, endres, bygd på, eller brukes av alle for ethvert lovlig formål. Arbeidet er gjort tilgjengelig under Creative Commons CC0 public domain engasjement
Finansiering:. Denne studien ble støttet med tilskudd fra NIH (CA162264 og CA141935) og PCRP program av CDMRP (PC111314). JC er støttet av supplement på CA162264-02S1. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Prostatakreft (PCA) er den hyppigst diagnostisert mannlige kreft og den nest største årsaken til onkologisk dødelighet hos menn i USA [1]. I 2013 er ~238,590 nye tilfeller av PCa anslås å bli diagnostisert i USA som kan kreve ~29,720 dødsfall [1]. African American (AA) menn er uforholdsmessig berørt med PCa med en insidensrate to tredjedel høyere og dødeligheten dobbelt så høy sammenlignet med kaukasiske amerikanere (CA) [2]. På grunn av sin ikke-spesifikke symptomer og gradvis progresjon, er PCa vanligvis diagnostisert på et avansert stadium. Men hvis diagnosen på et tidlig stadium PCa kan behandles med hell.
rutinemessig utført tester for tidlig deteksjon av PCa inkluderer digital rektal undersøkelse (Dres) og prostataspesifikt antigen (PSA) testing. PSA-testing er ikke-spesifikk, da forhøyede PSA-nivå på grunn av benign prostatahyperplasi (BPH), infeksjon, og /eller kronisk betennelse kan føre til utfall ledsagende [3] – [4]. Lav spesifisitet (PSA-testing) og lav følsomhet (DRE) av disse testene begrenser deres diagnostisk betydning [5]. Selv om kliniske studier inn for at PSA-screening i stor grad forenkler tidlig diagnose av PCa, om dette screeningprosedyre i betydelig grad senker PCA dødelighet forblir et spørsmål om debatt [6] – [7]. En fersk metaanalyse konkluderte med at rutinemessig screening med enten en DRE eller PSA tilbyr ingen nytte og ikke påvirker PCa dødelighet [8]. For å overvinne disse ulempene, har flere biomarkører blitt foreslått inkludert PSA derivater som total PSA hastighet (total PSAV) og ulike molekylære former for PSA som gratis PSA, BPSA, pro-PSA, og intakt PSA [9]. Andre blodbaserte biomarkører så som humant kallikrein kjertel 2 (hK2), urokinase-plasminogen-aktivator (uPA) og dens reseptor (uPAR), transformerende vekstfaktor-beta-1 (TGF-β1); interleukin-6 (IL-6) og dens reseptor (IL-6R), har blitt studert alene eller i kombinasjon med PSA og foreslått for diagnose, oppsamling, prognostics, og overvåking av prostatakreft [10]. Men på grunn av den heterogene natur av denne sykdommen, flere prognostiske biomarkører sterkt behov for bedre prediksjon av sykdomsutvikling som kan hjelpe i klinisk beslutnings om tidspunktet for biopsi og nødvendigheten av behandling.
microRNAs (miRNAs) er små (18 til 24 nukleotider), sterkt konserverte, ikke-kodende RNA-molekyler som regulerer genekspresjon post-transkripsjonelt [11] – [12]. Beregnings studier tyder på at over 60% av pattedyr-gentranskriptene blir regulert av mirnas [13] – [14]. Mirnas spille nøkkel regulerende rolle i avvikende cellulære prosesser, herunder cellesyklus, spredning, differensiering og apoptose [15]. Nyere studier har innblandet ulike mirnas i utviklingen og progresjon av flere kreft hos mennesker, og også som potensiell biomarkør i kreft diagnose og prognose [16] -. [19]
Med tanke på heterogene natur kreft vev, laser capture micro disseksjon (LCM) tilbyr en attraktiv måte å isolere definerte cellepopulasjoner fra FFPE eksemplarer [20]. LCM i kombinasjon med QRT-PCR-teknologi har blitt brukt for nøyaktig måling av genekspresjon fra FFPE-prøver. I den foreliggende undersøkelse, benyttet vi LCM og utført miRNA profilering i prostata cancer og tilsvarende tilstøtende normalt vev for å identifisere mirnas assosiert med utvikling av PCa. De mirnas identifisert ble ytterligere validert i større prøvesettene. For å teste sine ikke-invasiv diagnostisk potensial, vurderte vi også uttrykk for kandidat miRNAs i et uavhengig sett med urinprøver fra PCA pasienter.
Materialer og metoder
Pasientprøver
Alle pasientprøver som ble oppnådd var avidentifisert å beskytte pasientens konfidensialitet og hadde Georgetown University IRB-godkjenning og samtykke. Alle vevsprøver de ble innhentet fra GU /LCCC Histopatologi Tissue Shared Resource (https://lombardi.georgetown.edu/research/sharedresources/htsr/) og skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle deltakerne for urinprøve. Kort, 40 formalinfiksert, parafininnstøpte (FFPE) vev prøve kvartaler fra radikal prostatektomi bestående 15 kaukasisk Amerikansk (CA) og 25 Afroamerikaner (AA) ble hentet fra Lombardi Histopatologi og Tissue delt ressurs (HTSR) mellom 1997-2002. Urinprøver fra 36 PCA pasienter (18 CA og 18 AA) og 12 alder og etnisitet matchet friske donorer (6 CA og 6 AA) ble hentet fra Georgetown University Hospital Cyberknife Prostate Cancer Program mellom 2009 til 2012.
Laser Capture mikrodisseksjon (LCM)
Hematoxylin og eosin (H E) beiset lysbilder fra arkiv FFPE- blokker ble gjennomgått av et styre sertifisert patolog, for identifisering av PCa foci samt tilstøtende normalt vev. LCM ble utført på Arcturus laser capture mikroskop system med 5000 til 6000 laserpulser for hver prøve å fange 30 000 til 50 000 celler av PCa foci og tilstøtende normalt vev. Captured celler ble umiddelbart frosset ved -80 ° C inntil videre bruk.
RNA Utvinning og miRNA expression profilering
RNA ekstraksjon fra microdissected celler og urinprøver ble utført ved hjelp Recover All ™ Totalt nukleinsyreisolering og Mirvana ™ miRNA isolasjon kits henholdsvis (Ambion, Austin, TX) som per produsentens protokoll. RNA ble kvantifisert ved hjelp av Nanodrop ND-1000 spektrofotometer (Thermo Scientific, Waltham, MA) og Agilent 2100 Bioanalyzer (Santa Clara, California).
RNA ble konvertert til cDNA ved hjelp Megaplex ™ Primer bassenger og Taqman miRNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, Grand Island, New York). En omfattende miRNA uttrykk profilering ble gjennomført ved bruk av TaqMan Array Menneskelig mikroRNA En kort v2.0 følge produsentens anbefalinger (Applied Biosystems, Grand Island, NY). Kvantitativ real-time PCR (QRT-PCR) ble utført for å skjerme totalt 377 unike menneskelige mirnas av Applied Biosystems 7900 HT Fast real-time PCR sekvens deteksjonssystem. Data ble analysert på sekvens deteksjonssystem (SDS) programvare (versjon 2.3, Applied Biosystems, Grand Island, New York). Relative miRNA uttrykket nivåer ble normalisert mot endogen kontroll U6 snRNA.
Validering av QRT-PCR
Expression nivåer av utvalgte mirnas ble målt i 40 PCA pasienter som bruker inventoried TaqMan miRNA Analyser (Applied Biosystems, Hotel Island, NY) etter produsentens anbefalinger, om 7300 real-Time PCR System (Applied Biosystems, Grand Island, New York). I korthet ble 10 ng av RNA ble revers transkribert ved hjelp av bestemte stammesløyfe primere. Vevsprøver ble normalisert til intern standard kontroll U6 snRNA mens, RNU48 ble anvendt som kontroll for å normalisere urinprøver. Ikke-revers transkriptase (RT) kontroller ble brukt for å utelukke muligheten for potensiell genomisk DNA-forurensning. MicroRNAs med terskel syklus (CT) verdier av ≥38 ble ekskludert fra analysen. Alle prøver gikk revers transkripsjon og QRT-PCR samtidig for å minimere feil introdusert av variasjoner i reaksjon effektivitet.
Data Mining, Target Identifisering og Pathway Analysis
Uttrykk for utvalgte miRNAs ble analysert i Gene Expression Omnibus (GEO) database i «R» ved GEO2R [21]. De mRNA mål for forskjellig uttrykt mirnas ble identifisert ved hjelp av online programvare og databaser som TargetScan [22], PicTar [23] og miRDB [24] etterfulgt av ytterligere eksperimentelt verifisert mål fra miRTarBase [25]. Mulige gen-gen-interaksjoner og funksjonell gruppering blant målene for mirnas, ble utført ved hjelp av Ariadne Pathway Studio 9.0.
Statistical Analysis
Den rå menneske mikroRNA-A-kort v2.0 array-data ble statistisk analysert av Integromics Realtime StatMinier programvareversjon 4.0, og R /Bioconductor programvareversjon 2.9.2. De 2
-ΔΔCt metoden [26] ble ansatt for pre-prosessering og brett endrings beregninger. Forskjellig uttrykt mirnas mellom PCA vev og tilstøtende normalt vev ble identifisert ved hjelp av Limma pakke [27] som benytter den empiriske bayesianske modellen for å håndtere lite utvalg størrelse i forhold til den relativt mye større antall miRNAs.
p-
verdier ble justert med Benjamin-Hochberg falske funnrate (FDR) korreksjon [28].
Alle QRT-PCR eksperimenter ble utført i henhold til MIQE (minimum informasjon for publisering av kvantitative realtime PCR eksperimenter) retningslinjer [29]. Hver amplifikasjonsreaksjonen ble utført in triplo, og middelverdien av de tre-syklusen terskel ble anvendt for videre analyse. Data er presentert som gjennomsnitt ± SE og P value≤0.05 ble betraktet som statistisk signifikant. Den parametriske t-test ble brukt for å sammenligne to grupper (kreft vs ikke-kreft), og alle statistikker ble justert ved hjelp av Holm-Bonferonni korreksjon for multiple sammenligninger. Alle boksplottene representerer miRNA nivåer i forhold til U6 snRNA, forvandlet til mengder ved hjelp av formel 2
-ΔCt [30].
Receiver Operating Characteristic (ROC) kurver ble konstruert og arealet under kurven (AUC) ble beregnet å undersøke muligheten for å bruke de spesielle miRNA for å diskriminere PCA pasienter fra friske kontroller. Logistisk regresjon ble brukt til å konstruere ROC-kurver ved hjelp av miRNA uttrykket nivåer. All den statistiske analysen ble utført med GraphPad Prism v6 (La Jolla, California).
Resultater
Expression Profilering av miRNAs i Prostate Cancer Vev
Vurdere endringer i miRNA uttrykket i PCA vev og bio-væsker tilbyr et lovende verktøy for å identifisere spesifikke biomarkører som kan hjelpe i diagnose og prognose av PCa. I første omgang har vi brukt laser-fanget mikrodisseksjon (LCM) for å fange region av kreft vev og tilsvarende tilstøtende normale kolleger fra FFPE prøver av radikal prostatektomi pasienter. MikroRNA uttrykk profilering ble utført i 10 PCA pasienter med Gleason (GS) 6-7 (5 AA og fem CA). Kreften og tilstøtende normale områder ble identifisert av patologen BVSK. Captured celler fra ulike kreft regioner fra hver pasient ble slått sammen for å gjenspeile mangfoldet i PCa og pasientgruppen; tilstøtende normale vev motstykker tjente som ikke-cancer kontroll. Vi utførte miRNA profileringsanalyse og funnet at mesteparten av mirnas ble nedregulert i kreftvev, med unntak av MIR-367, MIR-758 og MIR-190 som ble funnet å være oppregulert (tabell 1). For validering, valgte vi de 3 oppregulert mirnas (MIR-367, MIR-758 og MIR-190) og 5 downregulated mirnas (MIR-205, MIR-214, MIR-212, MIR-221 og Mir-99B) basert på deres publisert rolle i kreft biologi. Profilering data for alle de 10 pasientene (5 CA og 5 AA) har blitt sendt til GEO databasen (tiltredelse antall GSE48430).
Validering av miRNAs ved kvantitativ RT-PCR
utvalgte 8 mirnas ble validert i LCM-dissekert svulsten og tilstøtende normalt vev fra 40 pasienter inkludert de 10 pasientene som brukes for miRNA profilering. Tabell 2 viser klinisk-patologiske kjennetegn ved pasientene. QRT-PCR resultatene fra 40 pasientprøve (15 CA og 25 AA) eksemplarer åpenbart redusert uttrykk av MIR-205 (
p
0,0001), MIR-214 (
p
0,0001), MIR-221 (
p
0,001) og Mir-99b (
p
. 0,0001) i kreftvev i forhold til tilstøtende ikke-kreft vev (fig 1A) . Selv MIR-212 viste en trend mot downregulation ved PCA i forhold til tilstøtende normalt vev, forskjellen var ikke statistisk signifikant (
p
= 0,061). Det var ingen signifikant forskjell i den relative uttrykk for MIR-758, og MIR-190 i svulstvev i forhold til sine tilstøtende normale kolleger og nivåene av MIR-367 kunne ikke påvises etter 38 sykluser (data ikke vist). Derfor MIR-212, MIR-758, MIR-190 og MIR-367 ble ekskludert fra videre studier
(A) Validering av miRNAs ved QRT-PCR. Boksplott som representerer vev uttrykk nivået av fire miRNAs i 40 FFPE PCA vev og deres sammenkoblede tilstøtende normalt vev. Expression nivåer av mirnas er normalisert til U6 snRNA som endogen kontroll. Statistisk signifikante forskjeller ble bestemt ved anvendelse av uparede Students t-test. Vi oppdaget betydelig reduksjon i uttrykket av MIR-205 (
p
0,0001), MIR-214 (
p
0,0001), MIR-221 (
p
0,001) og Mir-99b (
p
0,0001) i PCA vev i forhold til tilstøtende normalt vev. * angir
p
0,0001 og ** betegner
p
0,001. (B) Mottaker opererer karakteristikk (ROC) kurve analyse: ROC-kurve for fire mirnas ble gjort for å skille PCa fra friskt vev. Arealet under ROC-kurven (AUC) for hver miRNA formidler sin nøyaktighet for differensiering av PCA vev og normalt vev i form av sensitivitet og spesifisitet.
Bilder
Mottaker operasjonelle egenskaper (ROC) kurver var konstruert for å utforske sensitivitet og spesifisitet av MIR-205, MIR-214, MIR-221 og MIR-99b og vurdere deres potensial til å bli brukt som biomarkør for å diskriminere mellom PCA og sykdom frie individer (fig. 1B). Resultatene tyder på at de fire mirnas kan diskriminere mellom de to gruppene med høy presisjon; MIR-205, AUC = 0,83 (95% CI = 0,74 til 0,91); MIR-214 AUC = 0,92 (95% CI = 0,86 til 0,99); MIR-221 AUC = 0,75 (95% CI = 0,63 til 0,84) Mir-99b AUC = 0,86 (95% CI = 0,78 til 0,95) (Fig. 1B).
Uttrykk av miRNAs i GEO datasett
data mining ble utført ved hjelp GEO2R å sjekke status på forskjellig uttrykt miRNAs i offentlig tilgjengelige GEO datasett. Microarray datasett GSE21036 (Taylor et al.) [31] og GSE36802 (Lin et al.) [32] ble spørres for uttrykk av utvalgte fire mirnas (MIR-205, MIR-214, MIR-221 og MIR-99B) av renter. Støtte til våre vev data, i GSE21036 ble alle de fire mirnas også nedregulert i grunnskolen prostatakreft (n = 99) sammenlignet med normale prostata vev (n = 28) (MIR-221,
p
0,0001 ; MIR-205,
p
0,0001, Mir-99b,
p
0,0001, MIR-214,
p
0,05). Tilsvarende, i GSE36802, observerte vi nedregulering av alle fire mirnas i klinisk lokalisert primær tumor (n = 21) sammenlignet med benigne PCa (n = 21) (MIR-221,
p
0,0001; mir -205,
p
0,0001, Mir-99b,
p
0,0001, MIR-214,
p
. 0,05) (figur 2).
mikroRNA valideringsdata for (A) 99 primær PCA pasienter og 28 friske kontrollpersoner og (B) 21 pasienter hver med klinisk lokalisert primær PCa og godartet PCa ble hentet fra NCBI GEO database (GEO tiltredelse no. GSE21036 og henholdsvis GSE36802,). Vist er spredningsplott uttrykksnivået MIR-205, MIR-214, MIR-221 og Mir-99b i datasett hentet fra GEO database.
Pathway Network Analysis of Forskjellig Modulert miRNAs
for å få funksjonelle innsikt i rollen som miRNA ved PCA og å undersøke mulige gen-gen-interaksjoner mellom målene for de fire mirnas, bygget vi et samspill nettverk ved hjelp av Pathway Studio 9.0. Totalt 98 mRNA mål ble identifisert ved (a) felles mål hentet fra tre programvare (TargetScan, PicTar og miRDB) for alle de 4 mirnas og (b) validerte mål for de 4 mirnas ble oppnådd ved miRTarBase. Vi har lagt til vanlige regulatorer sammen med direkte interaksjoner-direkte regulering av genekspresjon, protein-protein binding, eller promoter bindende. En signal kompleks utviklet seg fra 62 av de 98 målene avslørt VEGFA, ICAM1, p53, ESR1, SELE og FOS som felles noder /huber av flere interaksjoner som tyder vanligvis drevet trasé av den tilkoblede gener og kandidat for fremtidig eksperimentell verifikasjon og funksjonelle studier (Fig. 3). Resten 36 målene ble ekskludert av programvare på grunn av mangel på felles kontakter. En annen vei, konstruert for å identifisere miRNA mål med direkte samhandling, foreslo lignende noder /huber (Fig. 3).
Pathway Nettverket ble bygget for vanlig spådd målet mRNA av forskjellig modulert mirnas (MIR-205, speil 214, MIR-221 og miR99b), ved hjelp av Pathway Studio 9.0 (A) Vanligvis spådd miRNA mål med felles regulatorer. (B) Direkte samspill mål.
Etnisk Variasjon i miRNA Expression
Afroamerikaner (AA) menn har en høyere forekomst av PCa sammenlignet med kaukasisk Amerikansk (CA) menn. Vi spurte om uttrykk nivåer av MIR-205, MIR-214, MIR-221 og Mir-99b var forskjellig mellom de to populasjoner (n = 15 CA; n = 25 AA). For å teste dette har vi sammenlignet ganger forskjellen i hver miRNA i kreftvev i forhold til deres tilstøtende normalt vev i AA og CA prøver. Som vist på fig. 4, var det ingen signifikant forskjell i uttrykk mønstre av MIR-205, MIR-214, og MIR-221 mellom CA og AA befolkningen. Men en betydelig redusert uttrykk (
p
0,01) (Fig. 4). Mir-99b ble observert i kreftvev fra AA PCA pasienter sammenlignet med CA PCA pasienter
Box tomter representerer ganger forskjell i uttrykk nivåer av fire mirnas i PCA vev i forhold til sin normale grenser motstykke. Data for 15 kaukasisk Amerikansk (CA) og 25 Afroamerikaner (AA) pasienter som vurderes av QRT-PCR er vist. Expression nivåer av miRNAs ble normalisert til U6 snRNA som endogen kontroll. Statistisk signifikante forskjeller ble bestemt med uparet t-test.
Påvisning av miRNAs i Urinprøver
Tissue biopsier er invasiv og ikke den foretrukne kilde for biomarkører. Vi neste utforsket mulighetene, enten MIR-205, MIR-214, MIR-221, og Mir-99b kunne påvises ikke-invasiv ved å analysere urinprøver fra PCA pasienter. Fra en pågående studie, valgte vi 36 PCA pasienter og 12 alder og etnisitet matchet friske donorer som et ikke-kreft kontrollgruppen. Tabell 3 viser kjennetegn ved PCA pasienter og friske personer rekruttert i studien for urinprøver. Siden for miRNA profilering vi brukte vevsprøver med GS6 og GS7, fikk vi urinprøver fra pasienter med GS6 og GS7 som en refleksjon av vevsprøver. Alle fire mirnas (MIR-205, MIR-214, MIR-221 og Mir-99B) var tilstede i påvisbare konsentrasjon i urinprøver. Vi fant at urin MIR-205 (
p
0,05) og Mir-214 (
p
0,05) nivåene var signifikant lavere i kreftgruppen sammenlignet med friske kontrollgruppen ( fig. 5A). Det ble ikke observert noen signifikant forskjell i uttrykket nivåer av MIR-221 og MIR-99b. For å evaluere den diagnostiske potensial, ble ROC-kurver for alle 4 mirnas analysert i urinprøver konstruert. ROC kurve viste at MIR-205 og MIR-214 kan diskriminere PCA pasienter fra normal kontroll med AUC: 0,7083 (95% CI = 0,54 til 0,86) og 0,7431 (95% CI = 0,58 til 0,90), henholdsvis (Fig. 5B) . Også MIR-205 og MIR-214 hvis ansatt sammen kan diskriminere PCA pasienter fra friske personer med 89% sensitivitet og 80% spesifisitet (Fig. 6). Til sammen våre resultater viser at MIR-205 og MIR-214 er til stede i både vev og urin fra PCA pasienter, noe som tyder på at urin kan brukes til å oppdage endringer i uttrykket nivåer av mirnas.
(A) boks~~POS=TRUNC plott~~POS=HEADCOMP som representerer urinen uttrykk nivået av fire mirnas (MIR-205, MIR-214, MIR-221 og Mir-99B) i urinen fra 36 PCA pasienter og 12 friske personer som vurderes av QRT-PCR. Expression nivåer av mirnas er normalisert til RNU48 som endogen kontroll. Statistisk signifikante forskjeller ble bestemt ved hjelp av t-test. Vi oppdaget betydelig redusert uttrykk av MIR-205 (
p
0,05), MIR-214 (
p
0,05) i urinen til PCA pasienter sammenliknet med friske kontroller. ble ikke observert noen signifikant forskjell i uttrykk nivåer av MIR-221 og MIR-99b. * Angir
p
0,05. (B) Mottaker opererer karakteristikk (ROC) kurve analyse av fire miRNAs ble brukt til å skille PCA pasienter fra friske individer. Arealet under ROC-kurven (AUC) for hver miRNA formidler sin nøyaktighet for differensiering av PCA pasienter og friske forsøkspersoner i form av sensitivitet og spesifisitet.
Kvantifisering av MIR-205 og MIR-214 sammen kan forbedre den diagnostiske verdi og kan brukes til å diskriminere PCA pasienter fra friske personer med 89% sensitivitet og 80% spesifisitet.
Diskusjoner
Endringer i miRNA uttrykk nivåer, resulterer i modulering av flere signalveier, har vært knyttet til initiering og progresjon av PCa. I denne studien, ved hjelp av global miRNA profilering fulgt av valideringsstudier viste vi at MIR-205, MIR-214, MIR-221 og Mir-99b ble signifikant nedregulert i PCA vev i forhold til tilstøtende normale vev kolleger.
en av de mest studerte mikroRNA, MIR-205 som er vist å være nedregulert i ulike krefttyper, inkludert PCa [33] – [34], ble også identifisert som downregulated miRNA ved PCA i vår studie. MIR-205 har vist seg å være epigenetiske fortrengte tumor suppressor i PCa [35] som utøver sin tumorundertrykkende funksjoner i den humane prostata gjennom nedregulering av flere mål som BCL2 [36], protein kinase C-epsilon [34] og androgenreseptoren (AR) [37]. Tapet av MIR-205 har også vært assosiert med dårlig prognose, apoptose motstand ved PCA og er foreslått å være et kjennetegn på epitelial-mesenchymale overgang [37] – [41]. Andre uttrykk array-studier har også identifisert MIR-205 blir undertrykt ved PCA [33] – [34], [42] – [43]. Low-level uttrykk for MIR-205 er også en prognostisk markør for menneskelig hode og hals plateepitelkarsinom [44] og locus har blitt rapportert å bli brakt til taushet av arrangøren hypermethylation i invasive svulster i blæren [45]. Studien samt tidligere litteratur bekrefter en viktig rolle MIR-205.
Den neste abnormt uttrykt miRNA i vår studie var MIR-214 som har vist seg å være ofte nedregulert i livmorhalskreft [46], eggstokkreft kreft [47] – [48], hepatocellulært karsinom [49] – [51] og kolangiokarsinom [52]. I motsetning til dette, har høy ekspresjon av MIR-214 vært assosiert med kreft i bukspyttkjertelen [53] og med ugunstig resultat i total overlevelse i gastrisk karsinom [54]. MiR-214 deregulering har ikke tidligere blitt rapportert i prostatakreft. Dette er den første studien som viser at MIR-214 er abnormt uttrykt ved PCA. Den betydelige ned- regulering i vev biopsi samt urinprøver fra PCA pasienter introduserer MIR-214 som en roman spiller i PCA som trenger videre leting.
En annen downregulated miRNA i vår studie var MIR-221. Viktigere var MIR-221 identifisert som den mest betydelig modulert miRNA i de to PCa GEO datasett. MiR-221 er de-regulert i rekke kreftformer, først og fremst som en over-uttrykt miRNA [55] – [59]
I PCA nedregulering av MIR-221 har blitt rapportert i TMPRSS2. ERG fusion- positiv PCa og er signifikant assosiert med metastase og biokjemiske gjentakelse [58], [60]. Få studier har også rapportert en onkogen rolle MIR-221 ved PCA [61] – [62] og utvikling og vedlikehold av kastrering motstand fenotype [63] – [64]. Vårt resultat er en av de få rapportering nedregulering av MIR-221 i PCA vev og garanterer videre studier.
En annen meget viktig miRNA identifisert i vår studie var Mir-99b. Mir-99 familien inkludert Mir-99b har vært forbundet med PCa undertrykkelse og prognose [63]. Nedregulering av MIR-99b har også blitt observert hos pasienter med lungekreft [65]. Mir-99b har også vist seg å være overuttrykt i synovial sarcom [66] og assosiert med tilstedeværelse av lymfeknutemetastase i spiserørskreft [67]. Våre resultater tyder på at nedregulering av MIR-99b er mer uttalt i AA-PCA vev sammenlignet CA PCA vev (Fig. 4). Funksjonelle studier på Mir-99b er begrenset, og disse nye observasjonene kreve ytterligere undersøkelser i rollen som MIR-99B mål. Til sammen indikerer nåværende data som, sammen med en rekke andre faktorer, kan uttrykk variant av miRNAs som Mir-99b forklare etniske aggressivitet av sykdommen.
Å utforske signalnettverk regulert av disse fire miRNAs, vi konstruert en sti av deres felles spådd mål å bruke tilgjengelig bioinformatikk og validerte mål fra litteraturen. Legge vanlige regulatorer, identifiserte vi sentrale signal huber som har blitt rapportert å spille en viktig rolle i kreftcellesignalisering tyder på en viktig rolle i disse fire mirnas ved PCA (Fig. 3). Deretter konstruerte vi et direkte samspill nettverk av miRNA mål uten felles regulatorer. VEGFA, p53, ESR1, FOS og ICAM1 forble som sentrale knutepunkter [68] – [72]. Den mTOR var den eneste Mir-99b mål som ble inkludert i felles nettverk. Vi identifiserte MIR-99b som forskjellig modulert miRNA i AA PCa. mTOR reaksjonsvei spiller en viktig rolle i PCa, og har vært forbundet med en aggressiv sykdom, resistens overfor terapi og utvikling av kastrering motstandsdyktig PCa [73]. mTOR-inhibitorer har også blitt evaluert som behandling for CRPC [74]. Association of Mir-99b med AA PCa har stor betydning og videre studier i vår lab er rettet mot å karakter Mir-99b og sine mål i rende aggressiv PCa fenotype.
Konseptet med å bruke urin for påvisning av forskjellig uttrykt mirnas som biomarkør er relativt ny. Med tanke på ideen om at vevet stammer uttrykk mønstre av mirnas kan hjelpe oss til å vurdere sirkulerende mirnas som biomarkører for ulike typer kreft, ble mest lovende mirnas observert i vår studie studert i urinen til PCA pasienter for å vurdere deres diagnostiske eller prognostisk potensial. I samsvar med våre funn i vevsprøver, var vi også i stand til å påvise MIR-205, MIR-214, MIR-99b og MIR-221 i urinprøver av PCA pasienter. Nivåene av MIR-205 og MIR-214 var betydelig lav i PCA pasienter og kan utforskes som en ikke-invasiv diagnostisk biomarkør for PCa. Selv om sensitivitet og spesifisitet er større i vev, urin MIR-205 og MIR-214 nivåer sammen kan diskriminere pasienter fra friske personer med høy presisjon. Så vidt vi vet, avslører vår studie for første gang at MIR-205 og MIR-214 kan gi en alternativ ikke-invasiv modalitet å skille mellom PCa og friske individer og kan tjene som et pålitelig biomarkør for PCa.
bruken av urin som en prøve for tumor markør fortsatt vanskelige i lys av det faktum at urinen inneholder et bredt spekter av biomolekyler inkludert høy mengde av nukleaser og RNaser. Men på grunn av den lille størrelsen, mirnas er mer stabile mot RNase-nedbrytning som går inn for deres fortrinn som biomarkører [75]. Få studier har undersøkt mulighetene for urin mirnas som diagnostiske og prognostiske markører for blærekreft, nyresykdommer, urothelial kreft, leverkreft og nyrecellekreft [76] – [80]. Selv om miRNA nivåer er blitt studert i forskjellige sykdommer har ikke bred behandling for sirkulering miRNA i urin for PCa blitt rapportert hittil, med unntak av Bryant et al [81] – [82]. Betydelig høyere konsentrasjon av MIR-107 og MIR-574-3p ble kvantifisert i urinen til menn med PCa sammenlignet med kontroller [82]. Så langt vi kjenner til, demonstrerer vi for første gang, at MIR-205 og MIR-214 er nedregulert ved PCA vev samt i urin fra PCA pasienter. Vi erkjenner begrensning av vår studie at vev og urin oppnådde ikke var fra de samme pasientene og vår lille utvalgsstørrelse. Likevel, vår studie gir bevis på konseptet at deregulert mirnas i vev kan utforskes som ikke-invasive urin biomarkører ved PCA. ROC-kurven viser at MIR-205 og MIR-214 sammen har en evne til å skille mellom friske personer og PCA pasienter med 89% sensitivitet og 80% spesifisitet.
