Abstract
I diabetespasienter komplisert med tykk- og endetarmskreft (CRC), metformin behandling ble rapportert å ha variert sammenheng med CRC spesifikk dødelighet. I laboratoriestudier, ble metformin rapportert å påvirke overlevelsen av kreft stamceller (cscs) i bryst og bukspyttkjertel kreft og glioblastom. Selv om cscs spiller en kritisk rolle i resistens til 5-fluorouracil (5-FU) kjemoterapi i CRC pasienter, effekten av metformin på cscs i CRC-pasienter, og den synergistiske effekten av metformin i kombinasjon med 5-FU på cscs blir ikke rapportert. I den foreliggende undersøkelse patologiske undersøkelser ble utført på 86 pasienter CRC komplisert med type 2 dm som var blitt delt inn i en metformin gruppe og en ikke-metformin gruppe. Sammenligninger av patologisk type, forekomst av metastaser, uttrykk for CD133 og β-catenin ble gjennomført mellom de to gruppene. Vi utforsket de synergieffekter av metformin i kombinasjon med 5-FU på spredning, cellesyklus, apoptose og andelen CD133 + cscs av SW620 human kolorektal kreft cellelinjer. Resultatene viser at metformin behandling hadde omvendt korrelasjon med andelen pasienter med dårlig differensiert adenokarsinom, andelen av CD133 + cscs i CRC pasienter med type 2 DM. Metformin forbedret antiproliferative effekter av 5-FU på CD133 + cscs i SW620 celler. Disse funnene gir et viktig supplement til forrige undersøkelse. Hemming av spredning av CD133 + cscs kan være en mulig mekanisme ansvarlig for foreningen av metformin bruk med forbedrede CRC utfall i CRC pasienter med type 2-diabetes
Citation. Zhang Y, Guan M, Zheng Z, Zhang Q Gao F, Xue Y (2013) Effekter av Metformin på CD133 + kolorektal kreft celler hos diabetespasienter. PLoS ONE 8 (11): e81264. doi: 10,1371 /journal.pone.0081264
Redaktør: Chunming Liu, University of Kentucky, USA
mottatt: 19 juli 2013; Godkjent: 02.10.2013; Publisert: 21.11.2013
Copyright: © 2013 Zhang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne forskningen ble støttet av en bevilgning fra provinsen Industrial Technology Research ogutviklingen Projects, nei. (2010) 207 og Forskningsfondet Guangdong Pharmaceutical Association for medisinering av type 2 diabetes, NO. 2012C07, Guangdong, Kina. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Ledelse av diabetespasienter komplisert med tykktarmskreft (CRC) er en stor utfordring for klinikere. Epidemiologiske studier har vist at diabetes mellitus (DM) er nært knyttet til forekomst av kreft, spesielt gastrointestinal kreft [1,2]. En meta-analyse av 15 studier med til sammen over 2,5 millioner mennesker, viste at diabetes var assosiert med en 30% økt risiko for CRC [3]. Videre er diabetes signifikant assosiert med øket samlet og CRC-spesifikk dødelighet [4,5] mens metformin (1,1-dimetyl-biguanid-hydroklorid), de mest foreskrevne oralt antidiabetisk medikament for type 2 DM [6,7], kan redusert kreftrisiko og CRC spesifikk dødelighet hos diabetespasienter [8]. Akkumulert bevis tyder på at metformin kan være en potensiell stoffet for chemoprevention av CRC hos diabetespasienter. I vår tidligere studie, hemmer metformin veksten av SW-480 celler inkubert med eller uten avanserte glycation end produkter (alder) og ned-regulerer uttrykket av cyclin D1 og telomerase aktivitet [9,10]. Den antineoplastiske effekter av metformin har blitt rapportert å være assosiert med aktivering av AMP-aktivert proteinkinase (AMPK) signalveien, forbedring av insulinresistens og hyperinsulinemi [11,12].
nylig, en annen fordel med antineoplastisk metformin ble rapportert. Det kan hindre overlevelse av kreft stamceller (cscs, tumor-stamceller initiere-lignende celler: TISCs) i bryst, og bukspyttkjertel kreft og glioblastom in vitro [13,14]. Som cscs har potensial til å initiere og opprettholde tumorvekst og metastase, er de ansvarlige for resistens mot kjemoterapi og tilbakefall av kreft, hvori Wnt /β-catenin signalveien kan være involvert [15,16]. CD133-positive (CD133 +) celler separert fra CRC utstillings egenskapene til cscs, som selvfornyelse og høy tumorigent potensial. I brystkreft, har CD133 blitt rapportert som en nyttig markør for å forutsi effekten av kjemoterapi og tilbakefall [17]. Lignende roller CD133 har også blitt identifisert i CRC. Den høye andelen CD133 + celler ble sterkt korrelert med dårlig total overlevelse (OS) i CRC pasienter [18]. Det er imidlertid ikke noe forskning på korrelasjonen mellom metformin behandling og andelen av CD133 + cscs i CRC-pasienter.
Hva mer er, er det ingen undersøkelser, enten på korrelasjonen mellom metformin behandling og 5-fluorouracil (5-FU) kjemoterapi. Metformin er nylig blitt rapportert å ha en synergistisk effekt i kombinasjon med noen kjemoterapi [19,20]. 5-FU, et første-linje kjemoterapeutisk middel for CRC pasienter, er vanligvis brukt i kombinasjon med andre kjemoterapeutiske midler for å forbedre den terapeutiske effekt, ettersom motstand mot 5-FU sannsynlig forekommer i avanserte CRC-pasienter, og ofte fører til svikt av kjemoterapi [ ,,,0],21]. Derfor må det bli undersøkt hvorvidt metformin kan benyttes i kombinasjon med 5-FU for å forbedre den antiproliferative virkningen av 5-FU på CRC. Tatt i betraktning den viktige rollen cscs i tumorprogresjon vi en hypotese om at den positive rollen av metformin hos CRC kan være delvis bidratt til dens antiproliferativ effekt på kolorektal cscs.
For å avklare hvordan metformin påvirker patogenesen og patologisk progresjon av CRC med type 2 DM, undersøkte vi de sammenslutninger av metformin med patologisk type og forekomst av metastasering av CRC hos diabetespasienter komplisert med CRC og antiproliferative effekt av metformin på kolorektal cscs (CD133 +) også. For å forstå hvordan metformin synergi med 5-FU å påvirker celle oppførselen til CRC, undersøkte vi synergieffekter av metformin på uttrykk for CD133 + celler i kombinasjon med 5-FU in vitro.
Materialer og Metoder
Denne studien ble godkjent av etisk komité av Nanfang Hospital, Southern Medical University.
den etiske komiteen av Nanfang Hospital fravikes behovet for pasientenes samtykke siden prøvene ble anskaffet fra vevet bank av avdeling for patologi, Nanfang Hospital, Southern Medical University.
1.1.1 pasienter og studiedesign
Det er totalt 187 type 2 diabetikere gjennomgikk reseksjon av CRC ved Nanfang Hospital, Southern Medical University i Guangzhou, Kina mellom januar 2010 og juni 2012. De medisinske poster av disse pasientene ble hentet for epidemiologisk undersøkelse av deres demografi og kliniske kjennetegn. Bruk av andre diabetiker medisiner (sulfonylurea, tiazolidindioner, alfa-glukosidasehemmere, insulin, og så videre) ble også undersøkt. Median alder var 64 år gammel (varierer fra 29 til 87 år gamle) og 119 (63,64%) av pasientene var over 60 år gammel. 88 (47,06%) av pasientene hadde nylig diagnostisert type 2 DM. Varigheten av DM mindre enn 5 år og mer enn 5 år utgjorde 26,74% (50/187) og henholdsvis 22,99% (43/187). De andre (6/187, 3,21%) hadde ingen klar informasjon om varigheten av DM. Til slutt ble 86 pasienter med komplette medisinske poster inkludert i studien, og ble delt inn i to grupper i henhold til bruken av metformin. I metformingruppen var det 36 pasienter som hadde brukt konsekvent metformin før CRC diagnose og i den ikke-metformingruppen var der 50 pasienter. Patologiske eksemplarer av 37 pasienter som hadde gjennomgått verken får kjemoterapi eller strålebehandling før reseksjon av CRC ble hentet for immunhistokjemisk undersøkelse av uttrykk for CD133 og β-catenin.
De to gruppene ble sammenlignet i forhold til demografi, kliniske kjennetegn og laboratoriefunn. Pasient demografi og kliniske karakteristika inkludert alder ved diagnose, kjønn, varighet av diabetes, body mass index (BMI), systolisk /diastolisk blodtrykk (SBP /DBP). Laboratoriefunn inkludert fastende plasmaglukose (FPG), hemoglobin A1c (HbA1c), blod urin-nitrogen (BUN), kreatinin (CR), triglycerider (TG), total kolesterol (T-Chol), low-density lipoprotein kolesterol (LDL), meget low-density lipoprotein kolesterol (VLDL) og high-density lipoprotein kolesterol (HDL), samt informasjon knyttet til CRC diagnose, inkludert histologi, differensiering og metastasering. Datoen for CRC diagnosen ble definert som dagen for sikker patologisk diagnose.
1.1.2 Immunohistokjemiske Eksamen
Vevsprøver fra hver pasient av de 37 pasientene ble fiksert i formalin og innstøpt i parafin. Neste parafin delene ble deparaffinized før, ble de varmet opp i 20 min ved 105 ° C i antigen gjenfinning buffer (Jinqiao Zhongshan BioTech, Beijing, Kina). Etter blokkering med 10% geiteserum, ble platene inkubert med primære monoklonale antistoffer henholdsvis mot CD133 (BIOS, Kina, fortynning 1: 150) og β-catenin (Cell Signaling Technology, USA, fortynning 1: 200) over natten ved 4 ° C etterfulgt av pepperrot peroksidase-merket sekundære antistoffer i 1 time ved romtemperatur. Og så, lysbildene ble utviklet med diaminoben-Zidine -tetrahydroklorid (DAB) og kontra med hematoksylin.
1.1.3 Immunhistokjemisk Assessment
For hvert bilde, minst 5 felt (inne i tumor) og 500 celler ble analysert med høy effekt (× 400 forstørrelse) mikroskopi av to patologer. Prøvene ble definert som positiv for CD133 uttrykk hvis kreftcellene ble tydelig farget av anti-CD133 antistoffer. Resultatene ble klassifisert i to nivåer: 10% og ≥10% CD133-positive celler.
uttrykk for β-catenin på cellemembranen og i cytoplasma og kjerner ble registrert. A 70% ekspresjon av β-catenin på cellemembranen ble ansett som normalt, registreres som negativ (-), mens en 10% ekspresjon av β-catenin i cytoplasma og kjerner ble ansett unormal, registrert som positive (+ ).
1.2.1 celle~~POS=TRUNC linjer~~POS=HEADCOMP og cellekultur-betingelser
human kolorektal kreft cellelinje SW620 ble oppnådd fra ATCC (USA) og holdt i RPMI-1640 medium supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS; PPA, Østerrike) i en fuktet atmosfære med 5% CO2 ved 37 ° C. 5-FU og metformin ble kjøpt fra Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA. For å vurdere virkningene av metformin i kombinasjon med 5-FU, ble cellene behandlet med eller uten metformin (5 mM) i 24 timer, og deretter vasket med PBS, deretter behandlet med 5-FU (5μΜ) for en annen 48 timer.
1.2.2 Celle proliferasjonsanalyser
SW620-celler ble sådd ut i 96-brønners plater før behandling med eller uten metformin, fulgt av 5-FU i 24, 48 og 72 timer henholdsvis. Celleproliferasjon ble målt med 3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5-difenyltetrazoliumbromid (MTT; 5 mg /ml; Sigma, MO, USA) assay. Etter passende behandling tidsrom ble MTT tilsatt til en sluttkonsentrasjon på 1 mg /ml, og reaksjonsblandingen ble inkubert i 3 timer ved 37 ° C. De resulterende krystaller ble oppløst i 0,04% HCI i isopropanol og absorbansen ble avlest ved 562 nm. Hver behandling ble utført i triplikat, og hvert eksperiment ble gjentatt to ganger.
1.2.3 cellesyklus analyser
SW620 celler ble forbehandlet med metformin i 24 timer eller ikke, og deretter behandlet med 5-FU i 48 timer. Cellene ble høstet på en eksponentiell vekstfase, og enkeltcellesuspensjoner inneholdende 1×106 celler ble fiksert med 70% alkohol. Cellesyklusen ble overvåket ved bruk av propidiumjodid (PI) farging av kjerner. Fluorescensen av DNA-bundet PI i cellene målt med en flow-cytometri (BD Biosciences). Resultatene ble analysert med ModFit 3.0 programvare (Verity Software House, Topsham, ME). Eksperimentet ble gjennomført tre ganger. Forholdet mellom celler i G0 /G1, intra-S, og G2 /M-fasene ble uttrykt som gjennomsnitt ± SD.
1.2.4 Vurdering av apoptose
Apoptose ble detektert ved strømningscytometri via undersøkelse av den endrede plasma membranfosfolipid pakking av lipofilt fargestoff Annexin V. i korthet behandlede celler ble høstet og vasket to ganger med PBS før resuspendert ved en konsentrasjon på 1 x 106 celler /ml i bindingsbuffer i henhold til produsentens instruksjoner (AnnexinV: FITC apoptose Detection Kit, BD Pharmingen, CA, USA). Deretter ble 5 ul av Annexin V-FITC og 5 ul av propidiumjodid (PI) tilsatt til 100 ul av cellesuspensjonen og inkubert i 15 minutter ved romtemperatur i mørke. Etter å legge 400 mL av bindingsbuffer, ble merkede celler telles innen 30 min med FACS Calibur flowcytometer (Becton Dickinson, Mountain View, California). Tidlig apoptose celler (Annexin V-positive, PI-negativ), nekrotiske /sen apoptose celler (dobbel positiv), så vel som levende celler (dobbel negativ) ble målt før påfølgende analyse av Cell quest software (Becton Dickinson).
1.2.5 Påvisning av CD133-positive celler
Etter SW620 celler ble utarbeidet og behandlet som beskrevet, ble kreftceller innsamlet og farget med anti-CD133 antistoff (mus monoklonalt IgG, 1: 10 , Milteny Biotec) eller lgG1 isotype kontroll-antistoff (Milteny Biotec) i 30 minutter i mørke ved 2-8 ° C. CD133 farging ble analysert ved flowcytometri (Becton Dickinson, San Jose, California). Forsøkene ble utført in triplo. Forholdet mellom CD133 + celler ble uttrykt som gjennomsnitt ± SD.
1.3 Statistisk analyse
Data ble presentert som gjennomsnitts + Standardavvik (SD) og analysert ved hjelp av SPSS v.16.0 statistisk programvare (Abbott Laboratories, North Chicago, IL). Én-veis analyse av varians (ANOVA) og deretter uparede Students
t
-test ble anvendt for å bestemme effekten av forskjellige variabler. Assosiasjonene mellom uttrykk av CD133 og β-catenin og clinicopathological parametre ble analysert ved bruk av Pearsons kji-kvadrat (χ
2) test og Fishers eksakte test.
P
verdi mindre enn 0,05 ble ansett for å være statistisk signifikant.
Resultater
2.1.1 Pasient demografi og kliniske kjennetegn
Pasient demografi og kliniske karakteristika er oppsummert i tabell 1. Det var ingen signifikante forskjeller mellom metformin og ikke-metformin gruppene vedrørende alder ved diagnose, blodtrykk, BMI, varighet av diabetes, FPG, HbA1c, BUN, CR, ALB, TG, T-Chol, HDL eller VLDL nivåer ved baseline, men LDL nivået var betydelig lavere i metformingruppen enn i den ikke-metformingruppen (p = 0,024). Som for patologiske egenskaper mellom de to gruppene, var andelen pasienter med dårlig differensiert adenokarsinom i metformingruppen var betydelig lavere enn i den ikke-metformingruppen (2,78% vs 16,0%, p = 0,048). Videre, de fjerne metastaser satsen i metformin gruppe var betydelig lavere enn i den ikke-metformin-gruppen (5,60% vs. 21,6%, p = 0,035). Imidlertid ble det observert noen signifikant forskjell mellom de to gruppene i lymfeknutemetastase (tabell 2).
Metformin gruppe (n = 36)
Non-metformingruppen (n = 50)
p
Alder ved diagnose (år) 66,19 ± 9.8863.22 ± 9.940.725DM varighet (år) 4,99 ± 3.685.75 ± 4.700.334BMI (kg /m
2) 22,39 ± 3.4125.09 ± 3.450.894SBP ( mmHg) 144,72 ± 21.82137.66 ± 19.230.199DBP (mmHg) 80,11 ± 9.7277.98 ± 17.720.306BUN (mmol /L) 6,92 ± 9.836.42 ± 3.780.430CR (mmol /L) 92,61 ± 69.2197.94 ± 108,490. 253ALB (g /L) 34.96 ± 6.9333.71 ± 5.760.063FBG (mmol /L) 8,63 ± 2.099.27 ± 2.950.080HbA1c (%) 6,78 ± 1.067.61 ± 1.990.083TG (mmol /L) 1,75 ± 1,282. 51 ± 3.070.132T-Chol (mmol /L) 4,44 ± 0.835.42 ± 4.260.173HDL (mmol /L) 1,25 ± 0.251.27 ± 0.850.203LDL (mmol /L) 2,27 ± 0.522.41 ± 1.070.024VLDL ( mmol /L) 0,88 ± 0.490.95 ± 0.540.741Table 1. Pasient demografi og kliniske karakteristika ved baseline.
CSV ned CSV
metformin gruppe (n = 36)
Non-metformingruppen ( n = 50)
p
Pathologic characteristicsWell differensiert adenocarcinoma12 (33,33%) 13 (26,0%) 0.460moderately differensiert adenocarcinoma21 (58.33%) 22 (44,0%) 0.190poorly differensiert adenocarcinoma1 (2,78%) 8 (16,0%) 0.048mucinous adenocarcinoma2 (5,56%) 6 (12,0%) 0.310signet ring celle carcinoma01 (2,0%) Metastasislymph node7 (19,44%) 14 (28,0%) 0.257distant2 (5,60%) 11 (21,6%) 0.035Table 2. patologiske egenskaper og metastaser i to grupper.
CSV ned CSV
2.1.2 uttrykk for CD133 og β-catenin i CRC prøver
Immunohistokjemiske mønstre av CD133 og β-catenin uttrykk ble analysert i CRC prøver . CD133 brunlige signaler ble observert på cellemembranen, særlig på dens luminal og basale overflate. Generelt er høyere fargeintensitet av CD133 indikerer høyere prosentandel av CD133 + tumorceller (figur 1, panel 1). I metformin gruppe, 15 av de 19 CRC-prøver (78,9%) inneholdt mindre enn 10% CD133-positive tumorceller, mens den andre 4 (21.1%) inneholdt mer enn 10% CD133-positive tumorceller. Selv om halvparten av CRC-prøver (9/18, 50,0%) i den ikke-metformin gruppe inneholdt mer enn 10% CD133-positive tumorceller,
forskjellen mellom de to gruppene ikke nådde et betydelig nivå plakater (
p = 0,065
). (Tabell 3)
(A): svakt positiv eller fokalt positiv farging i 10% av celler; (B): moderat eller sterkt positiv-farging som omfatter 10% eller mer av cellene; (C) og (D): farging av CD133 på den luminale overflaten og den basale overflaten av kreftceller. Panel 2: (A): cytoplasmisk eller kjerne ekspresjon av β-catenin var fraværende; (B): atom ekspresjon av β-catenin var mindre enn 10% av kreftceller; (C) og (D). Utbredt atom akkumulering av β-catenin
Positive uttrykk
*
Metformin gruppe (n = 19)
Non-metformingruppen (n = 18)
p-verdi
CD1334 (21,1%) 9 (50,0%) 0.065β-catenin7 (36,8%) 13 (72,2%) 0.031Table 3. uttrykk for CD133 og β-catenin i to grupper.
* er større enn eller lik 10% ekspresjon av CD133 i cellene ble registrert som positiv; 10% ekspresjon av β-catenin i cytoplasma og kjerner ble registrert som positiv. CSV ned CSV
Ekspresjon av β-catenin var tydelig ved celle-celle grenser og cytoplasma i et flertall av CRC prøver, mens i noen av cellene ble observert atom akkumulering av β-catenin protein (figur 1, panel 2 ). Det var en signifikant forskjell mellom de to gruppene i den positive frekvensen av β-catenin proteinekspresjon (p = 0,031). Den kjernefysiske opphopning frekvensen av β-catenin på mer enn 10% av tumorcellene var signifikant lavere i metformingruppen enn i den ikke-metformin gruppe (7/19, 36,8% vs 13/18, 72,2%; p = 0,031) . (Tabell 3)
Det er en signifikant positiv korrelasjon mellom CD133 og β-catenin uttrykk (p = 0,028).
Uttrykket av CD133 er korrelert med patologisk type CRC men de nådde ikke et betydelig nivå (p = 0,056
). Det er ingen signifikant korrelasjon mellom β-catenin og patologisk type CRC (p = 0,335).
2.2.1 antiproliferativ effekt av 5-FU alene og i kombinasjon med metformin på SW620 celler
In vitro, ble SW620-celler ble behandlet henholdsvis med 5-FU alene og med en kombinasjon av 5-FU og metformin. Spredning av SW620 celler i begge grupper øket med den tid som forløper. Vi har observert at metformin forbehandling fulgt av 5-FU behandling signifikant hemmet proliferasjonen av SW620 celler sammenlignet med behandling av 5-FU alene (1,019 ± 0,181 vs 1,218 ± 0,090, p = 0,058 for 24 timers eksponering; 1,075 ± 0,118 vs. 1,644 ± 0,219, p = 0,001 i 48 timer eksponering, 1,299 ± 0,147 vs 1,786 ± 0,109, p 0,001 for 72 timers eksponering). (Figur 2A)
B: Andelen av SW620-celler i enten G0 /G1 eller G2 /M fasen ble ikke åpenbart endret mellom de tre gruppene (p = 0,06 og p = 0,248) henholdsvis, men metformin forbehandling betydelig redusert andelen SW620 celler i S-fasen (24,14 ± 6,01 vs 39,62 ± 0,88, P = 0,003). **, P. 0,01 for sammenligninger av MET + 5-FU behandling henholdsvis med 5-FU behandling og kontroll
2.2.2 synergistisk effekt av metformin og 5-FU på cellesyklusen SW620 celler
for å undersøke effekten av metformin kombinert med 5-FU på cellesyklus, forbehandles vi SW620 celler med metformin i 24 timer før 5-FU behandling. Deretter ble de andelene av SW620 celler i G0 /G1, S og G2 /M-fase analysert ved flow-cytometri. Vi har observert at det ikke var noen signifikant forskjell mellom de tre gruppene i andelen av SW620 celler i G0 /G1 eller G2 /M fase (p 0,05), mens den metformin forbehandlingen betydelig redusert som i S-fasen, sammenlignet med 5-FU alene behandling (24,14 ± 6,01% mot 39,62 ± 0,88%, p = 0,003) (figur 2B).
2.2.3 Virkning av MET + 5-FU-behandling på apoptose av SW620-celler
prosent~~POS=TRUNC av apoptotiske celler ble signifikant økt med metformin forbehandling fulgt av 5-FU-behandling, sammenlignet med 5-FU alene behandling (Early apoptose hastighet: 3,50 ± 0,44% vs. 2,33 ± 0,38%, p = 0,029; sen apoptose hastighet: 11,80 ± 4,15% vs 5,30 ± 2,10%, p 0,001) (figur 3A).
*, p 0,05 og ***, p 0,001 for sammenligninger mellom MET + 5-FU gruppen og 5-FU alene gruppen. B: Andelen CD133 + celler ble betydelig redusert ved MET + 5-FU behandling sammenlignet med 5-FU alene behandling (15,13 ± 3,43 vs 21,30 ± 1,40; p = 0,027). Verdiene er gitt som middelverdi ± SD.
2.2.4 Effekt av MET + 5-FU-behandling på andelen av CD133 + -celler
Andelen av CD133 + celler ble bestemt ved flow-cytometri. 27,63 ± 2,58% av SW620-celler uttrykte membranantigen CD133 og både 5-FU alene og MET + 5-FU behandling signifikant redusert andelen av CD133-positive celler. Videre metformin forbehandling i 24 timer fulgt av 5-FU behandling i 48 timer i betydelig grad forsterket den inhiberende virkning av 5-FU alene behandling av andelen av CD133-positive celler (15,13 ± 3,43 vs 21,30 ± 1,40; p = 0,027) (figur 3B).
Diskusjoner
I CRC pasienter komplisert med type 2 diabetes, denne studien viste at fjernmetastaser satsen i metformingruppen var betydelig lavere enn i den ikke-metformingruppen (5,60% vs 21,6%, p = 0,035), og andelen av pasienter med dårlig differensiert adenokarsinom var signifikant mindre i metformingruppen enn i den ikke-metformin-gruppen (2,78% vs. 16,0%, p = 0,048). Disse resultatene viser en annen fordel med metformin i CRC pasienter. I det siste tiåret, epidemiologiske studier og store, randomiserte kontrollerte studier (RCT), for eksempel ADOPT (A Diabetes Outcome Progresjon Trial) og RECORD (rosiglitazon evaluert for kardiovaskulære utfall og regulering av blodsukker i Diabetes), har foreslått en omvendt korrelasjon mellom metformin bruk og kreftrisiko, særlig risikoen for kolorektal kreft (CRC), sammenlignet med andre antidiabetiske behandlinger [22,23]. Metformin behandling resulterte i en redusert risiko for total dødelighet og CRC spesifikk dødelighet hos CRC pasienter med diabetes [24]. En prospektiv randomisert studie viste at metformin behandling redusert antall rektal avvikende krypten foci (ACF), en endoskopisk surrogatmarkør for CRC, hos pasienter uten diabetes [25]. I flere kreftcellelinjer og dyremodeller, utøver metformin behandling antiinvasive og antimetastasis effekter [26-29]. Men få studier adressert korrelasjoner av metformin behandling med kreftmetastaser og med den patologiske type kreft i menneskelige befolkninger. Denne studien er en tentativ forsøk fra vår side til å utforske disse spørsmålene. Styrken i denne forskningen er vår patologisk observasjon av en undergruppe av CRC pasienter med samtidige type 2-diabetes som fikk metformin behandling. Vi fant solid patologisk bevis som støtter en bemerkelsesverdig sammenslutning av metformin med bedre resultater i slike pasienter, noe som utløste vår videre studier i noen av mekanismene bak foreningen.
I vår tidligere studie ble proliferasjonen av SW480-celler i betydelig grad hemmet av metformin behandling i en dose- og tidsavhengig måte som kan skyldes nedregulering av cyclin D1 ekspresjon og telomerase-aktivitet ved metformin [ ,,,0],9,10]. I denne studien, viser vi at metformin har synergieffekter med 5-FU på spredning og cellesyklusen SW620 celler. Den betydelige veksthemmende og pro-apoptotiske virkninger av metformin for kreftceller sannsynligvis på grunn av aktivering av LKB1 /AMPK og forbedring av insulinresistens [19,20,30]. I tillegg er det Ras /Raf /MAPK-reaksjonsveien og reduktiv glutamin metabolisme også blitt rapportert å spille en rolle i den antineoplastiske effekt av metformin [19]. Nå nylig, metformin ble rapportert å påvirke overlevelsen av cscs i flere kreftcellelinjer [13,14]. Cscs har blitt identifisert som terapeutiske mål for tumorprogresjon [31], fordi de spiller en viktig rolle i dannelsen og gjentakelse av tumorer, metastaser og motstanden mot kjemoterapi som et resultat av to viktige egenskaper: selvfornyelse kapasitet og differensiere potensial i ubegrenset heterogene populasjoner av kreftceller. Deretter utforsket vi effekten av metformin behandling på kolorektal cscs i CRC pasienter, ved hjelp av sine patologiske prøver. Vi således funnet en omvendt korrelasjon av metformin behandling med CD133 + cscs i CRC pasienter. CD133 har vært antatt å være den mest robuste overflate markør for kolorektal cscs. Pasientene med CD133-høy uttrykk syntes å ha en mye lavere rate av 5-års OS og flere sjanser til T3, 4 tumorinvasjon, positiv N og vaskulær invasjon enn de med CD133-lav uttrykk [32].
Etter vår funn av foreningen av metformin behandling med andelen CD133 + cscs i CRC av disse pasientene, vi undersøkt ytterligere synergistisk effekt av metformin pluss 5-FU behandling på andelen av CD133 + celler og uttrykk for β-catenin protein i SW620 celler. Vi har vist at metformin i kombinasjon med 5-FU betydelig redusert både andelen av CD133 + celler og ekspresjon av β-catenin protein, noe som indikerer metformin kan ha en synergistisk antineoplastisk effekt på CRC ved inhibting spredning av cscs via β-catenin pathway. En lignende antineoplastiske effekt av metformin har blitt rapportert i brystkreft [20]. Selv om 5-FU er den mest vanlige kjemoterapeutisk middel ved behandling av CRC, motstanden mot dette stoffet er svært vanlig i kjemoterapi av CRC pasienter. Aktivering av Wnt /β-catenin banen i CD133 (+) kolorektal cscs kan være ansvarlig for motstanden av kjemoterapi i CRC [15,16,33]. Nylig ble AMPK aktivatorer rapportert å undertrykke livmorhalskreft cellevekst ved å hemme Wnt /β-catenin vei [34]. Hemming av Wnt /β-catenin sti av AMPK kan være ansvarlig for synergistisk effekt av metformin i kombinasjon med 5-FU på spredning av tykk- cscs. Det er merkbart at vi har funnet den kombinerte behandlingen av metformin pluss 5-FU hadde en betydelig bedre antineoplastiske effekt enn behandling av 5-FU alene, noe som tyder på at den kombinerte behandling kan være en potensiell standard kjemoterapi for CRC pasienter, særlig for dem som er svært motstandsdyktig mot 5-FU. Selvfølgelig, ytterligere undersøkelser, både kliniske forsøk og laboratorieforsøk, er nødvendig for å bekrefte denne antakelsen.
I konklusjonen, bekrefter vår studie videre at metformin er ikke bare en antidiabetika, men også en potensiell kreft medisiner. Våre resultater viser omvendt korrelasjon av metformin behandling med forekomst av fjernmetastaser og dårlig differensiert adenokarsinom, den positive frekvensen av CD133 og uttrykk for β-catenin protein i CRC pasienter med type 2 DM. Vi viser også den synergistiske effekten av metformin i kombinasjon med 5-FU på cellebiologi og andelen av CD133 + celler in vitro. Imidlertid er mekanismen av metformin interfererer med spredning av cscs forblir underdetermined. I fremtiden er potensielle RCT nødvendig for å undersøke effekten av metformin i kombinasjon med 5-FU på prognosen for CRC pasienter og de underliggende mekanismene bør videre utforsket.
Takk
Vi ønsker å takke Prof. Yanqing Ding, direktør for Avdeling for patologi, og Hongfen Shen, en tekniker ved Cancer Research Institute, Southern Medical University, Guangzhou, Kina. Vi erkjenner også nyttige kommentarer og revisjoner av dette manuskriptet av professor Ping Allen Liang.
