Abstract
leverkreft (HCC) er den tredje største årsaken til kreft-relaterte dødelighet over hele verden. Gjeldende standard praksis for behandling av HCC er mindre enn tilfredsstillende på grunn av kreft stamceller (cscs) -mediert post-kirurgiske tilbakefall. Av denne grunn, rettet mot de cscs eller kreftcellene med cscs-lignende egenskaper har blitt en ny tilnærming til behandling av HCC. GLA utviser antitumoreffekter ved at det demper proliferasjon, migrering, invasjon, og angiogenese av menneskelige kreftceller. Men funksjonene GLA i reguleringen av cscs-lignende egenskaper i HCC celler, og de molekylære mekanismene bak i fortsatt uklar. Her fant vi at GLA dempes de cscs-lignende egenskaper ved mikroRNA-148a (MIR-148a) -mediert hemming av transformerende vekstfaktor beta (TGF-β) /SMAD2 signalveien i HCC cellelinjer (HepG2, he-7, og MHCC97H). Faktisk, GLA hemmet aktiveringer /uttrykk for både TGFB-indusert og den endogene SMAD2. Videre GLA forbedret ekspresjon av MIR-148a på en dose /tidsavhengig måte. MiR-148a, som målrettet
SMAD2
-3’UTR, redusert uttrykk og funksjon SMAD2. Knockdown av MIR-148a avskaffet GLA-indusert hemming av TGF-β /SMAD2 signalveien og cscs-lignende egenskaper i HCC celler. Vår studie har funnet en ny mekanisme som GLA hemmer cscs-lignende egenskaper HCC celler ved MIR-148a-mediert hemming av TGF-β /SMAD2 signalveien, som kan bidra til å identifisere potensielle mål for behandling av HCC.
Citation: Jiang F, Mu J, Wang X, Ye X, Si L, Ning S, et al. (2014) undertrykkende Effekt av MIR-148a på TGF beta-SMADs Signal Pathway er involvert i Glabridin-indusert hemming av kreftstamceller-lignende egenskaper i leverkreft celler. PLoS ONE 9 (5): e96698. doi: 10,1371 /journal.pone.0096698
Redaktør: Lian-Yue Yang, Xiangya Hospital of Central South University, Kina
mottatt: 02.01.2014; Godkjent: 10 april 2014; Publisert: 07.05.2014
Copyright: © 2014 Jiang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av National Natural Science Foundation of China (81171987, 30972507) og et prosjekt finansiert av Priority Academic Program Utvikling av Jiangsu høgskolerådet (PAPD). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
leverkreft (HCC) er den vanligste leveren kreft og den tredje største årsaken til kreft-relaterte dødelighet på verdensbasis [1]. Gjeldende standard praksis for behandling av HCC, kirurgisk reseksjon og kjemoterapi er mindre enn tilfredsstillende på grunn av metastaser og postoperativ tilbakefall [1]. Et konsept for å forklare hva som kjennetegner neoplastiske vev er eksistensen av selvfornyende, stilk-lignende celler, kalt kreft stamceller (cscs) [2]. Cscs har blitt identifisert i ulike menneskelige krefttyper, inkludert HCC. I løpet av en tumor, cscs, som utgjør en liten del av de neoplastiske celler, er definert ved deres evne til å produsere nye tumorer [3]. Av denne grunn har rettet mot kreftcellene med cscs-lignende egenskaper bli den nye måten for behandling av humane leverkreft.
Roten av
Glycyrrhiza glabra plakater (lakris) har vært brukt i mange århundrer i Asia og Europa som en antioksidant, motgift, demulcent, slimløsende og et middel for allergisk betennelse, samt en smaks- og søtningsmidler [4]. Glabridin [GLA, (
R
) -4- (3, 4-dihydro-8, 8-dimetyl) -2
H
, 8
H
benzo [ ,,,0],1, 2-
b
: 3, 4
b
«] dipyran-3-yl) -1, 3-benzenediol] er en polyfenoliske flavonoid og en hovedbestanddel i den hydrofobe fraksjonen av lakris extract [5]. I tillegg til østrogen effekt, GLA oppviser et bredt spekter av biologiske aktiviteter, inkludert neuro-beskyttende, hjerte-beskyttende, anti-inflammatorisk, etc [5] – [7]. Nyere studier viser at GLA presenterer antitumoreffekter, med dempning av proliferasjon, migrering /invasjon, og angiogenese i humane kreftceller [8], [9]; Men effekten av GLA på cscs-lignende egenskaper i HCC celler, og de molekylære mekanismer som ligger under i forblir uklar.
transformerende vekstfaktor beta (TGF-β) er en viktig regulator som er involvert i cellevekst, differensiering og utvikling [10]. Det er også den mest potente lever pro-fibrogenic cytokin hovedsakelig produsert av aktiverte mesenchymalceller ved kronisk leverskader [11]. I initiering og utvikling av forskjellige tumorer, induserer TGF-β epitel-mesenkymale overgang (EMT), som er en viktig cellulær hendelse i tilegnelsen av cscs-lignende egenskaper [12], [13]. Derfor har TGF-β inhibitorer blitt utviklet for anti-cancer-terapier [14], [15]. Studien indikerer at hemming av TGF-β blokkerer generasjon av cscs, som forbedrer kjemoterapi aksjon mot trippel-negativ brystkreft [16]. I denne studien, behandlet vi HCC cellelinjer (HepG2, he-7, og MHCC97H) av GLA å avgjøre tidlig molekylære endringer, med vektlegging på cscs-lignende egenskaper og TGF-β veien.
Materialer og metoder
Cell kultur og reagenser
HCC cellelinjer (HepG2 og Huh-7) og menneskelig normal levercellelinje (L-02) ble hentet fra Shanghai Institute of Cell Biology, Chinese Academy of Sciences (Shanghai, Kina). MHCC97H cellelinje (HCC celler med en høy vandrende potensielle) ble hentet fra Liver Cancer Institute, Zhongshan Hospital, Fudan University, Shanghai, Kina. Celler ble opprettholdt i 5% CO
2 ved 37 ° C i Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM, Life Technologies /Gibco, Grand Island, New York) supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS, Life Technologies /Gibco), 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin (Life Technologies /Gibco, Gaithersburg, MD). GLA (≥98.0% renhet) ble kjøpt fra Sigma Chemical Co. (St. Louis, Missouri, USA). Alle andre reagenser som ble brukt var av analytisk kvalitet eller den høyeste grad kjent.
Revers-transkriptase-polymerasekjedereaksjon (RT-PCR)
Totalt RNA (2 pg) ble transkribert til cDNA ved anvendelse av AMV revers transkriptase (Promega, Madison, USA). Primere som brukes er som spesifisert i tabell S1. PCR-reaksjonen ble evaluert ved å merke PCR-produktene på 2% v /v agarosegeler. Bånd ble normalisert ved anvendelse av
glyseraldehyd 3-fosfat dehydrogenase (GAPDH)
for å korrigere for forskjeller i belastning av cDNA.
Kvantitativ sanntids-polymerase kjedereaksjon (QRT-PCR)
Total RNA (1 ug) ble transkribert til cDNA ved hjelp av TaqMan miRNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, Foster City, California) med miRNA-spesifikke løkker revers primere. Reaksjonsbetingelsene var som følger: 42 ° C i 15 min og 85 ° C i 5 sek. QRT-PCR ble utført ved bruk av en TaqMan PCR-kit fra Applied Biosystems 7300 Sequence Detection System (Applied Biosystems) i 40 sykluser på 95 ° C i 15 s og 60 ° C i 1 min.
U6
snRNA ble brukt som en intern kontroll. Brett endringer i uttrykket av hvert gen ble beregnet ved en sammenlignende terskel syklus (Ct) metode å bruke formelen 2
-. (ΔΔCt)
Western blot
Cellelysater ble atskilt av natrium dodecylsulfat (SDS)-polyakrylamidgel-elektroforese og overført til polyvinylidenfluorid (PVDF) membraner (Millipore, Billerica, USA); immunkompleksene ble oppdaget av forsterket kjemiluminescens (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA). Antistoffer brukt var SMAD2 og p-SMAD2 (Ser 465/467, Cell Signaling Technology); GAPDH (Sigma). Blottene ble normalisert ved bruk av GAPDH å korrigere for forskjeller i lasting av proteiner.
spheroid formasjons
I ikke-heftende 24 brønner retter (Costar, US), behandlet celler (2 × 10
3) ble suspendert i definert, serumfritt medium bestående av DMEM /F-12 (Gibco), 10 ng /ml human rekombinant basisk fibroblast vekstfaktor (bFGF, R etter 14 dager, kolonier ble talt under et mikroskop (Olympus).
Cell transfeksjon
Anti-con, anti-MIR-148a, Con-etterligne, og MIR-148a-ligne var syntetisert ved RiBoBio Co Cellene ble transient transfektert ved hjelp av Lipofectamine 2000 reagens (Invitrogen, Carlsbad, USA) i 12 timer, i henhold til produsentens protokoll. For genet utvinning analyse, etter MHCC97H-celler ble transfektert med anti-MIR-148a i 12 timer, ble de dyrket i friskt DMEM-medium supplert med 10% FBS (Gibco), 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin (Gibco ) i ytterligere 24 timer, etterfulgt av tilført med Con-etterligne eller MIR-148a-ligne for 12 timer.
Luciferase reporter analysen
pGL3-
SMAD2
-3 «UTR-Luc konstruksjonen ble kjøpt fra Shuntian Biology (Shanghai). Plasmidet phRL-tk (anvendt som intern kontroll for transfeksjonseffektivitet og cytotoksisitet av testkjemikalier) inneholdende Renilla luciferasegenet ble kjøpt fra Promega. Kort fortalt ble HepG2 celler sådd ut i 24-brønner cellekulturskåler. Cellene prolifererte til 60 til 80% konfluens etter 24 timer i kultur. Anti-con eller anti-MIR-148a ble ko-transfektert med reporteren konstruerer henholdsvis, ved hjelp av Lipofecamine 2000 reagens (Invitrogen) i følge produsentens protokoll. Etter en inkubasjonstid på 12 timer ble mediet erstattet transfeksjon. Deretter, etter at cellene ble behandlet med 0 eller 20 uM av GLA i 24 timer, ble de høstet, vasket med PBS (pH 7,4). Cellene ble lysert med passiv lyseringsbuffer (Promega). Cellelysatene ble analysert straks med en 96-brønns plate luminometer (Berthold deteksjonssystem, Pforzheim, Tyskland). Mengden av luciferase og Renilla luciferase ble målt med Dual-luciferaserapportørplasmid analysesystem Kit (Promega) etter produsentens anvisninger. Verdiene av luciferaseaktivitet for hvert lysat ble normalisert til den Renilla luciferaseaktivitet. Den relative aktiviteten ble omgjort til fold induksjon over kjøretøyet kontrollverdi.
Statistisk analyse
Deriverte verdier ble presentert som gjennomsnitt ± SD. En Student «s
t
test, og en en-veis analyse av varians (ANOVA) etterfulgt av Dunnetts
t
-testen ble brukt for å vurdere signifikante forskjeller mellom gruppene.
P
verdier 0,05 ble betraktet som statistisk signifikant
Resultater
GLA demper cscs-lignende egenskaper i HCC celler
For å bestemme konsentrasjonene av. GLA ved hjelp av i vårt studium, eksponert vi HepG2-eller L-02-celler til 0, 5, 10, 20, 40, eller 80 uM av GLA til 24, 48 eller 72 timer. Som vist i fig. S1A og S1B, var det ingen påviselig effekt på 10 eller 20 mikrometer GLA på celle viabilities verken i HCC celler (HepG2) og heller ikke i normale leverceller (L-02). Så vi valgte disse konsentrasjonene for videre etterforskning.
En økt utstilling av cscs-lignende egenskaper spiller en sentral rolle i initiering, utvikling, og utfallet av diverse kreft, inkludert HCC [2].
CD44
,
CD90
,
CD133
, og
EpCAM
er celleoverflatemarkører på leveren kreft stamceller [17] – [19] ytterligere,
Oct-fire Hotell og
BMI-1
er de viktigste «stemness gener i cscs fra ulike kreftformer [13], [20]. Her, som vist på fig. 1A og 1B, redusert GLA uttrykk for disse genene i HepG2-celler på en doseavhengig måte; i mellomtiden ble redusert uttrykk for
CD44 Hotell og
EpCAM
ble også observert i ytterligere to HCC celler (Huh-7 og MHCC97H).
(A) HepG2 celler behandlet med 0, 10, eller 20 uM GLA i 72 timer. RT-PCR analyser av
CD44
,
EpCAM
,
CD133
,
CD90
,
Oct-4
, og
BMI-en
; (B) Huh-7, og MHCC97H-celler ble behandlet med 0 eller 20 uM GLA i 72 timer. RT-PCR analyser av
CD44 Hotell og
EpCAM
; (C og D) og HepG2-Huh-7-celler ble behandlet med 0 eller 20 uM GLA i 72 timer. (C) Gratis flytende, levedyktige kuler dannet av celler (bar = 250 nm); (D) Sphere kvantifisering (gjennomsnitt ± SD, n = 3); (E og F) og HepG2 MHCC97H-celler ble behandlet med 0 eller 20 uM GLA i 72 timer. (E) kolonidannelse i bløt agar (bar = 250 pm); (F) Koloninummer (gjennomsnitt ± SD, n = 3). ** P. 0,01 sammenlignet med mellomkontrollceller (studentens
t
test)
Dannelse av kuler viser kapasiteten på celler for selvfornyelse og for initiering /utvikling av svulster [2]. Da kapasiteten av HCC celler for dannelse av kuler i løpet av GLA behandling ble bestemt. Som vist i fig. 1C og 1D, redusert GLA dannelse av kuler i HepG2 og Huh-7 celler. Krings-uavhengig vekst er karakteristisk for maligne celler [21]. Vi bestemte videre effekten av GLA på de ondartede egenskaper i HCC celler. Som vist i fig. 1E og 1F, redusert GLA ankeruavhengig vekst i HepG2 og MHCC97H celler.
TGF-β /SMADs signalveien er involvert i heving av cscs-lignende eiendommer i HepG2 celler
TGF -p /SMADs bane har vist seg å øke stammen lignende egenskaper i humane kreftceller [22]. Her fant vi at TGF-β forbedret uttrykk for CD44 og EpCAM (figur. 2A). Videre, i TGF-p-behandlede HepG2-celler, evnene til sfæroidene dannelse og forankrings-uavhengig vekst ble forbedret (fig. 2B og 2C). Men i SMAD2 (en klassisk nedstrøms faktor regulert av TGF-β, [16]) knockdown HepG2-celler, slik fenomen indusert av TGF-β ble svekket (fig. 2D-2F).
(A -C) HepG2-celler ble behandlet med 0 eller 10 ng /ml TGF-β i 48 timer. (D-F) Etter at HepG2-celler ble transfektert med 10 nM SMAD2-siRNA i 12 timer, ble de behandlet med 10 ng /ml TGF-β i 48 timer. (A og D) RT-PCR analyser av
CD44 Hotell og
EpCAM
; (B og E, venstre) Gratis flytende, levedyktige kuler dannet av celler (bar = 250 nm); (B og E, høyre) Sphere kvantifisering (gjennomsnitt ± SD, n = 3); (C og F, venstre) kolonidannelse i bløt agar (bar = 250 pm); (C og F, til høyre) Colony nummer (gjennomsnitt ± SD, n = 3). * P 0,05 sammenlignet med mediumkontroll celler eller Con-siRNA-transfekterte celler behandlet med TGF-β (studentens
t
test)
GLA blokkerer TGF-β /SMAD2. signalreaksjonsveien i HCC celler
Vi undersøkte effekten av GLA på TGF-β-indusert aktivering av SMAD2. Som vist i fig. 3A, GLA blokkerte TGFB-indusert fosforylering av SMAD2 og uttrykk for
Snail plakater (nedstrøms genet av SMAD2, [23]); Interessant, GLA også svekket ekspresjon av total SMAD2 mRNA og protein i nærvær eller fravær av TGF-β. Så neste fastsatte vi effekten av GLA på de uttrykk for endogen SMAD2. Som vist i fig. 3B og 3C, redusert GLA ekspresjon og aktivering av endogen SMAD2 i HCC celler (HepG2, Huh-7, og MHCC97H). Som det faktum at
SMAD2
mRNA ble redusert med GLA, hypotese vi at dette undertrykkende effekten kan være mediert av mirnas.
(A) Etter HepG2 celler ble forbehandlet med 0 eller 20 uM GLA i 12 timer, ble de utsatt for 0 eller 10 ng /ml TGF-β i 24 timer. (Øverst) Western blot analyser av p-SMAD2 og SMAD2, (nederst) RT-PCR analyser av
SMAD2 Hotell og
snegle
; (B) HepG2-celler ble behandlet ved 0, 10, eller 20 uM GLA i 72 timer. (Øverst) Western blot analyser av p-SMAD2 og SMAD2, (nederst) RT-PCR analyser av
SMAD2 Hotell og
snegle
; (C) Huh-7, og MHCC97H-celler ble behandlet med 0 eller 20 uM GLA i 72 timer. RT-PCR analyser av
SMAD2 Hotell og
snegle
.
GLA forbedrer uttrykk for MIR-148a i HCC celler
Ved å bruke TargetScan 6.2 (www.targetscan.org), fant vi at Mir-148a ble spådd å binde
SMAD2
-3 «UTR. Målse av MIR-148a i
SMAD2
mRNA ble utstilt i figur. 4A. Vi deretter bestemmes effekten av GLA på uttrykket av MIR-148a i HCC celler. Som vist i fig. 4B og 4C, GLA forbedret ekspresjon av MIR-148a på en dose /tidsavhengig måte i HepG2-celler. I mellomtiden, GLA også forhøyet uttrykk av MIR-148a i Huh-7 og MHCC97H celler (Figur 4D).
(A) Måltallene sekvenser av MIR-148a i 3′-UTR av
SMAD2
; (B) HepG2-celler ble behandlet ved 0, 10, eller 20 uM GLA i 24 timer. QRT-PCR-analyser av ekspresjon av MIR-148a (gjennomsnitt ± SD, n = 3); (C) HepG2-celler ble behandlet med 0 eller 20 uM GLA for 0, 8, 16, 24 eller 48 timer. QRT-PCR-analyser av ekspresjon av MIR-148a (gjennomsnitt ± SD, n = 3); (D) Huh-7, og MHCC97H-celler ble behandlet med 0 eller 20 uM GLA i 24 timer. QRT-PCR-analyser av ekspresjon av MIR-148a (gjennomsnitt ± SD, n = 3). ** P. 0,01 sammenlignet med mellomkontrollceller (studentens
t
test)
GLA hemmer SMAD2 av MIR-148a i HCC celler
Basert på prediksjon at det er målse av MIR-148a i
SMAD2
mRNA og på at GLA forhøyet uttrykk av MIR-148a, hypotese vi at Mir-148a kan være involvert i GLA-indusert redusert uttrykk for SMAD2 . Her, knockdown av MIR-148a (figur. 5A) førte til en betydelig økning av luciferase aktivitet (figur. 5B), og blokkerte GLA-indusert redusert uttrykk og aktivering av SMAD2 i HepG2 celler (figur. 5C). I mellomtiden, overekspresjon av MIR-148a (figur. 5D) i Huh-7 celler redusert uttrykk og aktivering av SMAD2 (figur. 5E). Videre brukte vi genet utvinning analyse for å ytterligere bekrefte vår konklusjon. I MHCC97H celler, knockdown av MIR-148a forhøyet uttrykk for
SMAD2
imidlertid restaurering av MIR-148a ved ligne avskaffet slik effekt (figur. 5F og 5G).
(A- C) etter at HepG2-celler ble forhånds transfektert ved hjelp av anti-con eller anti-MIR-148a i 12 timer, ble de utsatt for 0 eller 20 uM av GLA i 72 timer. (A) QRT-PCR-analyser av ekspresjon av MIR-148a (gjennomsnitt ± SD, n = 3); (B) luciferaserapportørplasmid analyser analyse av virkningene av MIR-148a på
SMAD2
3’UTR; (C) RT-PCR analyser av
SMAD2 Hotell og
sneglen product: (øverst), og Western blot analyser av p-SMAD2 og SMAD2 (nederst). ** P 0,01 sammenlignet med middels kontrollceller, og
## p 0,01 sammenlignet med HepG2 celler behandlet av GLA alene eller sammen med anti-con-transfektert HepG2 celler behandlet av GLA (ANOVA etterfulgt av Dunnetts
t
test). (D og E) Huh-7-celler ble transfektert ved con-etterligne eller MIR-148a-mimic i 12 timer. (D) QRT-PCR-analyser av ekspresjon av MIR-148a (gjennomsnitt ± SD, n = 3); (E) RT-PCR analyser av
SMAD2 Hotell og
sneglen product: (øverst), og Western blot analyser av SMAD2 (nederst); ** P 0,01 sammenlignet med Huh-7 celler transfektert med con-ligne (students t-test). (F og G) Etter at MHCC97H-celler ble transfektert med anti-MIR-148a i 12 timer, ble de dyrket i friskt DMEM-medium supplert med 10% FBS, 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin i ytterligere 24 timer, etterfulgt av transfektert med con-etterligne eller MIR-148a-ligne for 12 timer. (F) QRT-PCR-analyser av ekspresjon av MIR-148a (gjennomsnitt ± SD, n = 3); (G) RT-PCR analyser av
SMAD2
. ** P 0,01 sammenlignet med MHCC97H celler transfektert med anti-con,
## p 0,01 sammenlignet med MHCC97H celler transfektert med anti-MIR-148a pluss con-ligne (ANOVA etterfulgt av Dunnetts
t
test).
GLA demper cscs-lignende eiendommer i HCC celler ved MIR-148a
siden TGF-β /SMAD2 forbedrer cscs-lignende egenskaper, og siden MIR-148a mål SMAD2, hypotese vi at GLA demper cscs-lignende egenskaper ved MIR-148a i HCC celler. Her, knockdown av MIR-148a blokkerte GLA-indusert redusert uttrykk for
CD44 Hotell og
EpCAM
mRNA (Figur. 6A). For HepG2 celler, knockdown av MIR-148a blokkerte GLA-indusert redusert dannelse av kuler (Figurene. 6B og 6C). For Huh-7 celler, overekspresjon av MIR-148a svekkede kapasiteten forankringsuavhengig vekst (Tall. 6D og 6E). Deretter brukte vi genet utvinning analyse for å ytterligere bekrefte vår konklusjon. I MHCC97H celler, knockdown av MIR-148a forhøyet uttrykk for
CD44 Hotell og
EpCAM
og forbedret dannelse av kuler; Men restaurering av MIR-148a ved ligne avskaffet slik effekt (figur. 6F-6H).
(AC) Etter HepG2 eller Huh-7 celler ble pre-transfektert med anti-con eller anti-MIR-148a i 12 timer, ble de utsatt for 0 eller 20 uM GLA i 72 timer. (A) RT-PCR analyser av
CD44 Hotell og
EpCAM
; (B) Gratis flytende, levedyktige kuler dannet av HepG2 celler (bar = 250 nm); (C) Sphere kvantifisering (gjennomsnitt ± SD, n = 3); ** P 0,01 sammenlignet med mellomkontroll HepG2 celler, og
## p 0,01 sammenlignet med anti-con-transfektert HepG2 celler behandlet av GLA (ANOVA etterfulgt av Dunnetts
t
test). (D og E) Huh-7-celler ble transfektert ved con-etterligne eller MIR-148a-mimic i 12 timer. (D) kolonidannelse i bløt agar (bar = 250 pm); (E) Koloninummer (gjennomsnitt ± SD, n = 3). ** P 0,01 sammenlignet med medium kontroll Huh-7 celler eller med Huh-7 celler transfektert med con-ligne (ANOVA etterfulgt av Dunnetts
t
test). (F-H) MHCC97H celler ble behandlet som beskrevet i fig. 5F. (F) RT-PCR analyser av
CD44 Hotell og
EpCAM
; (G) Gratis flytende, levedyktige kuler dannet av MHCC97H celler (bar = 250 nm); (H) Sphere kvantifisering (gjennomsnitt ± SD, n = 3); ** P 0,01 sammenlignet med MHCC97H celler transfektert med anti-con,
## p 0,01 sammenlignet med MHCC97H celler transfektert med anti-MIR-148a pluss con-ligne (ANOVA etterfulgt av Dunnetts
t
test).
Diskusjoner
Nåværende kjemoterapi mot HCC vanligvis rettet mot hoveddelen befolkningen i tumor direkte, som er i stand til å krympe den primære svulsten, men ikke klarer å konsekvent utrydde lesjoner . Oppdagelsen av cscs har endret vårt syn på kreftutvikling og kjemoterapi. Cscs, også blitt kalt «kreft initierende celler «, har kapasitet til å produsere nye svulster. Basert på dette konseptet, cscs er ansvarlig for dannelse og vekst av neoplastisk vev og er motstandsdyktig mot kjemoterapeutiske midler, forklarer hvorfor tradisjonelle medisiner kan i utgangspunktet krympe en svulst, men ikke klarer å utrydde den, slik at gjentakelse [24]. Her valgte vi HepG2, Huh-7, og MHCC97H cellelinjer for å studere effekter av GLA på cscs-lignende egenskaper fordi disse cellelinjene viste cscs-lignende egenskaper, og har blitt brukt til å undersøke effektene av fytokjemikalier på cscs -lignende «side befolknings» celler [24] – [27]
GLA, en isoflavonoid av
G.. glabra L. røtter
, hemmer tyrosinase-avhengige melanin biosyntese effektivt, noe som tyder på at det kan tjene som en kandidat for hud-lightening agenter [5]. Dessuten har det også vært forbundet med et bredt spekter av biologiske egenskaper som antioksidant, anti-inflammatorisk, østrogen, neurobeskyttende, etc [5] – [7]. Nyere studier viser den anti-kreft effekt indusert ved hjelp av GLA, at det hindrer den oksidative DNA-fragmentering i UVB-bestrålte humane keratinocytt HaCaT-celler [28]; i mellomtiden, den blokkerer proliferasjon av humane brystcancerceller [8]; Dessuten hemmer det den migrasjon, invasjon, og angiogenese ved å hemme FAK /Rho signalveien [29]; videre, er det også forbedrer effekten av kjemoterapi ved å hemme P-glykoprotein og multimedikamentresistens proteinsyntese 1 [30]. Her identifiserte vi at GLA dempes (a) er uttrykk for CD44, CD133, CD90, og EpCAM, (b) evnen av kuler formasjonen (en markør for selvfornyelse), og (c) kapasiteten på forankrings-uavhengig vekst ( en karakter av maligne celler) i HepG2, Huh-7, og MHCC97H celler, noe som tyder på en ny funksjon som GLA kunne regulere cscs-lignende egenskaper i HCC celler.
i leveren, er et viktig TGF-β koblingen mellom kroniske skader, skrumplever og HCC, og kan serveres som et viktig mål for HCC terapi [15], [31]. TGF-β signalisering innledes ved binding av TGF-β til TGF-β-reseptor II (TGFp-RII), etterfulgt av aktivering av TGFp-RI, Smad2 /3 fosforylering, og dannelsen av de Smad2 /3/4-komplekser [ ,,,0],10]. Det er en sammenheng mellom den TGF-β og cscs, sammen med bevis som tyder på at TGF-β induserer EMT, noe som fører til oppnåelse av cscs-lignende egenskaper [12], [13]. Her har vi funnet at (a) TGF-β behandling indusert putative kreft stilk markører og øket forankrings-uavhengig vekst og dannelse av sfæroider i HepG2-celler og (b) knockdown av Smad2 reversert disse effektene, noe som tyder på at TGF-β signale spilt en viktig rolle i styrke cscs-lignende egenskaper i HCC celler. Imidlertid har en sammenheng mellom TGF-β og GLA-regulerte cscs-lignende egenskaper ikke blitt undersøkt tidligere. I den foreliggende undersøkelse, ble redusert GLA TGF-β-indusert fosforylering av SMAD2. Viktigere, GLA dempet uttrykk og aktivering av endogene SMAD2 i HCC celler, noe som indikerer at TGF-β /SMAD2 veien kan være involvert i GLA-indusert undertrykkende effekt på cscs-lignende egenskaper i HCC celler.
mirnas er de ikke-kodende små RNA oligonukleotider som regulerer genekspresjon [32]. I flere tumorer enkelte mirnas blir uttrykt forskjellig i forhold til normalt vev [33]. Men mirnas nettverk og deres regulering av mRNA oversettelse og protein uttrykk i cscs-lignende egenskaper i HCC celler gjenstår å bli belyst. MiR-148a er en pro-apoptotiske miRNA ved å målrette BCL-2 [34]. I tillegg er hemming av MIR-148a av hyper-metylering assosiert med metastaser i mange krefttyper og med oppregulering av metastaseassosierte gener [35]. I leveren, ble MIR-148a først vist å modulere nivåene av cytokrom P450 3A4 via post-transkripsjonelt regulere 3’UTR av pregnan X-reseptor (
PXR
) mRNA [36]. Tidligere studie tyder på at Mir-148a er involvert i anti-metastasering av HCC celler ved hemninger av Wnt1-mediert EMT og tilegnelsen av cscs-lignende egenskaper [24]. Her, ved hjelp TargetScan 6,2, fant vi at Mir-148a ble spådd å binde
SMAD2
-3 «UTR. Videre knockdown av MIR-148a ført til betydelige økninger i uttrykket /aktivering av SMAD2 og cscs-lignende eiendommer i GLA-behandlede HepG2 celler. Videre overekspresjon av MIR-148a redusert uttrykk /aktivering av SMAD2 og CSC-lignende eiendommer i Huh-7 og MHCC97H celler. Disse resultatene antydet at hemming av SMAD2 av MIR-148a kan megle GLA-svekkede cscs-lignende eiendommer i HCC celler.
I konklusjonen, GLA dempes de cscs-lignende egenskaper ved hemming av TGF-β /SMADs veien. Faktisk GLA forbedret uttrykk for MIR-148a, som målrettet SMAD2-3’UTR og nedregulert i SMAD2 uttrykk /aktivering. Knockdown av MIR-148a avskaffet GLA-indusert hemming av TGF-β /SMAD2 og cscs-lignende egenskaper i HCC celler (figur 7.). Forstå en ny mekanisme, der GLA hemmer cscs-lignende egenskaper HCC celler, kan vår studie bidra til å identifisere potensielle mål for behandling av HCC.
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
Effekter av GLA på levedyktighet og cscs markører i HepG2 og L-02 celler. (A og B) HepG2 eller L-02 celler ble behandlet med 0, 5, 10, 20, 40, eller 80 uM GLA i 24, 48 eller 72 timer, henholdsvis. Cellene viabilities ble evaluert av WST-8 hydrolyse ved hjelp av en Cell Counting Kit-8 analysen. De relative forhold av cellelevedyktigheten ble bestemt ved sammenligning av celler eksponert til ingen GLA. (C) L-02-celler ble behandlet med 0 eller 20 uM GLA i 72 timer. QRT-PCR analyser av uttrykk for
CD44
,
EpCAM
, og
CD133 plakater (gjennomsnitt ± SD, n = 3)
doi:. 10,1371 /journal .pone.0096698.s001 product: (TIF)
Tabell S1.
Primere som brukes for RT-PCR
doi:. 10,1371 /journal.pone.0096698.s002 plakater (docx)
