Abstract
Vi her vurderes potensialet anti-kolorektal kreft aktivitet ved erastin, en spenningsavhengig anion kanal (VDAC) -binding sammensatte. Vår
in vitro
studier viste at erastin utøves potente cytotoksiske effekter mot flere menneskelige kolorektal kreft cellelinjer, muligens via indusere oksidativt stress og caspase-9 avhengige celle apoptose. Videre ble mitokondriell permeabilitet overgang pore (MPTP) åpning observert i erastin-behandlede kreftceller, som ble dokumentert av VDAC-en og cyklofilin-D (CYP-D) forening, mitokondrie depolarisering, og cytokrom C utgivelse. Kaspaseinhibitorer, ROS-scavenger MnTBAP og MPTP-blokkere (sanglifehrin A, cyklosporin A og bongkrekic syre), samt shRNA-mediert knockdown av VDAC-1, alt vesentlig attenuert erastin-indusert cytotoksisitet og apoptose i kolorektal kreftceller. På den annen side, over-ekspresjon av VDAC-en utvidet erastin-indusert ROS produksjon, MPTP åpning, og tykktarmskreft celle apoptose.
In vivo
studier viste at intraperitoneal injeksjon av erastin på godt tolerert doser dramatisk hemmet HT-29 xenograft vekst i alvorlig kombinert immunsvikt (SCID) mus. Sammen viser disse resultatene at erastin er cytotoksisk og pro-apoptotiske til kolorektal kreftceller. Erastin kan bli ytterligere etterforsket som en roman anti-colorectal cancer agent
Citation. Huo H, Zhou Z, Qin J, Liu W, Wang B, Gu Y (2016) Erastin forstyrrer Mitokondrie Permeabilitet Transition Pore (MPTP ) og induserer apoptose Death of tykktarmskreftceller. PLoS ONE 11 (5): e0154605. doi: 10,1371 /journal.pone.0154605
Redaktør: Cong Cao, Suzhou universitet, KINA
mottatt: 23 mars 2016; Godkjent: 16 april 2016; Publisert: 12. mai 2016
Copyright: © 2016 Huo et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. All relevant data er innenfor papir
Finansiering:. Denne studien ble støttet av vitenskapen grunnlaget for den niende Folkets sykehus tilknyttet Shanghai Jiao tong University School of Medicine (nr 2015521, til YG). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
kolorektal kreft er den viktigste bidragsyteren til kreftrelatert dødelighet både i Kina [1] og rundt om i verden [2,3]. Det er anslått at over 100 000 nye tilfeller av kolorektal kreft er diagnostisert hvert år, noe som forårsaker over 50.000 dødsfall årlig [4]. Kjemoterapi har vært mye utnyttet for behandling av tykktarmskreft, men legemiddelresistens og /eller off-target giftighet begrense effektiviteten av dagens chemo-narkotika [5,6,7]. Dermed vår gruppe [8,9] og andre [10,11] har vært fokus på utvikling av nye og mer effektive anti-kolorektal kreft agenter.
Mitokondrie permeabilitet overgang pore (MPTP) er et multi- proteinkompleks kanal som ligger i mitokondriene, hvis hovedfunksjon er å opprettholde balansen av mitokondriell respiratoriske kjeden [12]. MPTP er hovedsakelig består av tre proteiner: inkludert spenningsavhengig anion kanal (VDAC) i ut mitokondriemembranen (OMM), adenin-nukleotid Translocator 1 (ANT-1) i den indre mitokondrie-membran (IMM) og matrise lokalisering cyklofilin-D ( Cyp-D) [12]. Det har vist seg at flere stimuli vil indusere ANT-en og CYP-D forening og MPTP åpning, og dermed fører til reaktive oksygenforbindelser (ROS) produksjon, ATP uttømming og pro-apoptotiske molekyl (
i
.
e
. cytokrom c) meldingen [12,13]. Deretter caspases (hovedsakelig caspase-9) og celle apoptose vil bli aktivert [12,13].
Nyere studier har identifisert en første-i-klassen VDAC-bindende lite molekyl, nemlig erastin [14,15] . Det er blitt vist at erastin er selektivt cytotoksisk til visse kreftcellelinjer [14,15,16,17]. For eksempel, Yagoda et al., Viste at erastin binder seg til VDAC, noe som resulterer i dødelig oksidativ skade på kreftceller [18]. Den potensielle rolle erastin i kolorektal kreft celler, og underliggende signalmekanismer er ikke undersøkt. I denne studien, viste vi at erastin var cytotoksiske og pro-apoptotiske til kolorektal kreft celler, muligens via forstyrre MPTP.
Materialer og metoder
2,1. Cellekultur
Som beskrevet [8,9], kolorektal kreft cellelinjer, inkludert HT-29, DLD-en og Caco-2, ble kjøpt fra cellen bank av Chinese Academy of Science (CAS) Shanghai biologiske Institute (Shanghai, Kina). Celler ble opprettholdt i FBS-holdig RPMI /DMEM-medium. Menneskelig NCM460 kolon epitel cellelinje ble gitt av Fudan IBS Cell sentrum (Shanghai, Kina). Celler ble dyrket i Hams F12 næringsmedium (Gibco) [19].
2,2. Reagenser og kjemikalier
Erastin ble kjøpt fra Selleck (Shanghai, Kina). MPTP blokkere inkludert sanglifehrin A, ble ciklosporin A og bongkrekic syre kjøpt fra Sigma (Shanghai, Kina). Den anti-oxidant MnTBAP var også fra Sigma. Caspase-3 spesifikk hemmer z-DEVD-FMK og caspase-9 spesifikk hemmer z-LEHD-FMK ble innkjøpt fra Calbiochem (Darmstadt, Tyskland). Alle antistoffer anvendt i denne studien ble innhentet fra Santa Cruz Biotech (Shanghai, Kina).
2,3. MTT celleviabilitet assay
Celleoverlevelse ble målt ved hjelp av 3- [4,5-dimethylthylthiazol-2-yl] -2,5 difenyltetrazoliumbromid (MTT, Sigma) assay [9]. Ulike seeding tettheter ble optimalisert ved begynnelsen av forsøkene.
2,4. Trypan blå farving assay
trypanblått-analysen ble beskrevet i våre tidligere studier [9]. I korthet, når anvendt erastin behandling, antallet døde (trypanblått-positive) celler ble tellet. Den dødsrate (%) ble beregnet ved antallet av trypanblått-fargede celler dividert med det totale antall celler.
2,5. Kolonidannelse assay
Etter erastin behandling,-celler (2 x 10
3) ble først suspendert i kulturmedium med 0,25% agar (Sigma). Cellesuspensjonen ble deretter planked på toppen av en pre-størknet 0,25% agar på en 100-mm kulturskål. Mediet ble erstattet annenhver dag. Etter 10 dagers inkubasjon, ble overlevelses kolonier farget og manuelt telles.
2,6. BrdU-inkorporering assay
Celler (3 x 10
3 per brønn) ble sådd ut på 96-brønners plater, etter å ha påført behandling, ble celleproliferasjon vurdert gjennom den BrdU-inkorporering ELISA-kolorimetrisk analyse (Roche, Indianapolis, IN ) med produsentens protokoll. ELISA OD-verdien av behandlingsgruppe ble normalisert med den i ubehandlede kontrollgruppe.
2,7. Cell apoptose analysen gjennom Annexin V flekker
Etter behandling ble celle apoptose oppdaget av Annexin V FACS analyse som tidligere rapportert [9]. Antallet Annexin V fargede celler ble registrert.
2,8. Kvantifisering av apoptose ved hjelp av enzymbundet immunosorbent assay (ELISA)
Som beskrevet i [8,9], Cell Apoptose ELISA Detection Kit Plus (Roche, Palo Alto, CA) ble benyttet for å kvantifisere celle apoptose ifølge produsentens protokoll.
2,9. Kaspase aktivitetsanalyse
Etter behandling ble cytosoliske proteiner ekstrahert i bufferen som er beskrevet [8,9]. Tjue mikrogram av cytosoliske ekstrakter per prøve ble tilsatt caspase analysebuffer med substrater av caspase-3 /-8 /-9 (Roche, Shanghai, Kina). Frigivelsen av 7-amido-4- (trifluormetyl) kumarin (AFC) ble kvantifisert ved hjelp av en Fluoroskan system satt til en eksitasjon verdi på 355 nm [8,9]. Resultatene ble uttrykt som relative fluorescensenheter /ug protein.
2,10. Western blotting
I korthet ble alikvotene av 30 ug av lyserte proteiner av hver prøve ble separert ved 10% SDS-polyakrylamid-gel-elektroforese og overført til PVDF-membraner (Millipore, Bedford, MA). Etter blokkering, ble membranene inkubert med det primære antistoff over natten ved 4 ° C, etterfulgt av inkubasjon med sekundært antistoff i en time ved romtemperatur. Bolten ble visualisert ved ECL (forbedret chemiluminescence) maskin. Hvert bånd ble kvantifisert via ImageJ programvare, og verdien ble normalisert til hver lasting kontroll band.
2,11. Reaktive oksygenforbindelser (ROS) deteksjon
Intracellulær ROS ble målt ved flowcytometri via dichlorofluorescin (DCF) oksidasjon analyse. DCFH-DA trer passivt inn i celler og spaltes av ikke-spesifikke esteraser cellulære og oksyderes i nærvær av ROS. Etter behandling,-celler (3 x 10
5 per prøve) ble inkubert med DCFH-DA (5 uM) i en time ved 37 ° C. Deretter ble cellene vasket med PBS og holdt i 1 ml PBS, ble ROS fluorescens analysert ved hjelp av ovennevnte Fluoroskan systemet.
2,12. Påvisning av mitokondrie potensiell reduksjon (ΔΨ
m)
Som beskrevet [20], den ΔΨ
m ble målt gjennom JC-10 fluorescens fargestoff. Når den mitokondrielle potensial avtar, blir monomere-JC 10 danner i cytosol, som oppviser grønn fluorescens [20]. I korthet, når anvendt erastin behandling, ble cellene farget med 5 ug /ml av JC-10 (Invitrogen) i 10 minutter, og detektert umiddelbart på et Fluoroskan system som er satt til en verdi eksitasjon på 485 nm [20].
2.13. Mitokondrie immunoprecipitation (mito-IP)
Celler ble trypsinert, og mitokondrielle fraksjoner ble fremstilt via en Mitokondrier /cytosol Fraksjone Kit (BioVision, Shanghai, Kina) i henhold til produsentens instruksjoner. To hundre mikrogram av cellelysater fra mitokondrielle fraksjoner ble pre-erte med 20 pl protein A /G PLUS-agarose (Santa Cruz) i 1 time. Supernatanten ble deretter rotert over natten med 0,25 ug av anti-ANT-1 (Santa Cruz Biotech). Deretter ble lysatene sentrifugert i 5 minutter ved 4 ° C i en mikrosentrifuge for å fjerne ikke-spesifikke aggregater. Protein A /G PLUS-agarose (35 ul) ble deretter tilsatt til supernatantene i 4 timer ved 4 ° C. Pelletene ble vasket seks ganger med PBS, resuspendert i lyseringsbuffer, og deretter analysert ved Western-blotting [20].
2,14. Stabil knockdown av VDAC-en ved lentiviral shRNA
De to settene med lentivirus-pakket VDAC-1 kort hårnål RNA (shRNA-en og shRNA-2, ikke-overlappende sekvenser) ble utformet, syntetisert og verifisert av Genechem (Shanghai, Kina). Ti pl /ml lentiviral partikler ble tilsatt til HT-29-celler i 12 timer. Etterpå ble lentivirus holdig medium erstattet med fullstendig medium, og cellene ble dyrket i ytterligere 24 timer. Etterpå puromycin (5,0 ug /ml, Sigma) ble tilsatt for å velge resistente kolonier stabilt i 2-3 uker. Ekspresjon av VDAC-1 ble påvist ved Western blotting. Kontroll celler ble behandlet med krafse non-sense shRNA lentiviral partikler (Santa Cruz Biotech).
2.15 Over uttrykk for VDAC-en og stabilt celler utvalg
full-lengde human VDAC-en cDNA, kjøpt fra Genechem (Shanghai, Kina), var sub-klonet inn pSuper-puro-flagg (en gave fra Dr. Bi Lab) [21]. Den tomme vektor (pSuper-puro-flagg) eller VDAC-1 som uttrykker konstruksjon ble transfektert inn i HT-29 celler via Lipofectamine 2000-protokollen (Invitrogen). De stabilt kloner ble selektert via puromycin (5 ug /ml). Etter 12-14 dager med valget, stabilt cellene ble utsatt for Western blotting-analyse av VDAC-1 uttrykk.
2,16.
In vivo
antitumor effekt evaluering
tumorvekst studiene ble utført i alvorlig kombinert immunsvikt (SCID) mus xenograft modell. Alle mus ble kjøpt fra Animal Facility av Shanghai Jiao Tong University School of Medicine (Shanghai, Kina). I korthet, 2 x 10
6 levedyktige HT-29 celler i 100 ul vekstmedium (per mus) ble inokulert subkutant, og mus med ~ 100 mm
3 tumorene ble tilfeldig delt i tre grupper med 10 mus pr gruppe . Mus ble behandlet daglig med 10 eller 30 mg /kg kroppsvekt av erastin (intraperitoneal injeksjon, i 4 uker) eller bærerkontroll (saltvann). Tumorvolumene ble beregnet ved det modifiserte ellipsoide formelen: (π /6) x AB
2, hvor A er den lengste og B er den korteste vinkelrette aksen til en tumormasse [22,23]. Mus kroppsvekt ble også registrert hver uke. Humane endepunkter ble alltid anvendt for å minimalisere mus lidelse. Dyrene ble observert på daglig baser. Tegn som betydnings-redusert bevegelse, alvorlig diaré, alvorlig piloereksjon eller plutselig vekttap ( 20%) ble registrert. Hvis dyrene nådde disse endepunktene de ble avlivet ved blodtapping i henhold 2,2,2-tribromoethanol anestesi (4 mg /10 g kroppsvekt, Sigma). Alle injeksjoner ble utført under 2,2,2-tribromoethanol anestesi metode. De dyrestudier har blitt godkjent av Shanghai Jiao Tong University School of Medicine Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) og etikk komité (Kontaktperson: Dr. Jun Wang, 2014126).
2,17. Statistisk analyse
Alle data ble normalisert til kontrollverdier for hver analyse og ble presentert som gjennomsnitt ± standard avvik (SD). Data ble analysert ved enveis ANOVA etterfulgt av en Scheffe F-test ved hjelp av SPSS 16,0 programvare (SPSS Inc., Chicago, IL). Betydning ble valgt som p 0,05.
Resultater
3,1. Erastin utøver cytotoksiske, men ikke cytostatisk effekt til dyrkede kolorektal kreftceller
For å teste erastin aktivitet på tykktarmskreft celleoverlevelse, ble HT-29 celler behandlet med økende konsentrasjoner av erastin (0,1-30 mm). MTT-analysen ble utført. Som vist i figur 1A, erastin potent hemmet HT-29 celleoverlevelse, som ble bevist ved MTT OD reduksjon. Erastin viste en doseavhengig effekt (figur 1A), og 30 uM av erastin vist den mest dramatiske effekt (figur 1A). Erastin tok minst 48 timer for å utøve vesentlig cytotoksisk effekt i HT-29-celler (figur 1A). Den cytotoksiske virkning av erastin ble også demonstrert ved trypanblått-farving assay (fig 1B) og kolonidannelse analysen (figur 1C). Erastin (1-30 mm) behandling betydelig økt antall trypanblått positive ( «død») HT-29 celler (figur 1B), ford redusere overlevelses HT-29 kolonier (figur 1C).
tykktarmskreft celler (HT-29, DLD-1 og Caco-2 linjer) eller NCM460 kolon epitelceller ble behandlet med vehikkel-kontroll (0,1% DMSO, «CTRL») og indikerte konsentrasjoner av erastin for anvendt tid, ble celleoverlevelse testet ved MTT-analyse (A og E) og kolonidannelse assay (C); Prosentandelen av trypan blå positiv ( «døde» celler) ble registrert (B); Celleproliferasjon ble testet ved BrdU-inkorporering assay (D og F). For hver analyse, n = 5. Dataene presentert var gjennomsnittlig ± SD. Forsøkene ble gjentatt tre ganger med lignende resultater erholdt. * P 0,05 vs. gruppe «Ctrl».
Interessant, erastin (1-30 mm) dukket ineffektive i å hemme HT-29 celleproliferasjon, og BrdU inkorporering ble ikke endret i HT-29 celler etter cytotoksiske erastin (1-30 mm) behandling (figur 1D). Derfor er usannsynlig på grunn av hemming spredning den cytotoksiske effekten av erastin. MTT resultater i Fig 1E viste at erastin (1-30 mm) ble også cytotoksisk til to andre kolorektal kreft cellelinjer: DLD-en og CaCo2. Men samme erastin behandling var generelt trygt til de ikke-kreft NCM460 colon epitelceller (Fig 1E). Igjen, BrdU-inkorporering, indikatoren av celleproliferasjon, ble ikke påvirket av erastin (10 uM) i de DLD-1 og CaCo2-celler, og heller ikke i NCM460 epitelceller (figur 1F). Basert på disse resultatene, viser vi at erastin utøver cytotoksiske, men ikke cytostatisk, aktivitet til dyrkede kolorektal kreftceller.
3,2. Erastin induserer ROS produksjon og caspase-avhengig apoptose i dyrkede kolorektal kreftceller
Deretter evalueres vi potensialet aktiviteten erastin på celle apoptose. Som beskrevet i vår tidligere studier [8,9], ble forskjellige apoptose analyser utført. Caspase analyseresultatene viste at aktiviteten av caspase-3 og caspae-9 var signifikant økt i HT-29-celler etter cytotoksisk erastin (1-30 uM) behandling (figur 2A), som indikerer mitokondrielle apoptose bane aktivering [24]. På den annen side er aktiviteten av caspase-8, en indikator på ekstrinsisk apoptotisk reaksjonsvei aktivering [25,26], var uendret i erastin-behandlede HT-29-celler (figur 2A). Celle apoptose aktivering ved erastin ble også bekreftet av Annexin V FACS-analyse (figur 2B) og Histone DNA apoptose ELISA-analysen (figur 2C). Erastin doseavhengig økt Annexin V prosent og Histone DNA ELISA OD i HT-29 celler (figur 2B og 2C).
kolorektal kreft celler (HT-29, DLD-1 og Caco-2 linjer) eller NCM460 kolon epitelceller ble behandlet med kjøretøy kontroll (0,1% DMSO, «Ctrl») eller indikerte konsentrasjoner av erastin for anvendt tid, ble celle apoptose undersøkt av børsnoterte analyser (AC, G og H); ROS produksjonen ble også undersøkt (D og I). HT-29 celler ble forbehandlet med z-DEVD-FMK ( «zDEVD», 50 uM), z-LEHD-FMK ( «zLEHD», 50 uM) eller MnTBAP (10 pM) i 1 time før anvendt erastin stimulering , celleoverlevelse og celledød ble testet ved MTT-assay (E) og trypanblått-assay (F), respektivt. For hver analyse, n = 5. Dataene presentert var gjennomsnittlig ± SD. Forsøkene ble gjentatt tre ganger med lignende resultater erholdt. * P 0,05 vs. gruppe «Ctrl».
# p 0,05 vs. gruppe erastin bare (E og F).
Siden erastin er en VDAC bindende forbindelse som kan forstyrre mitokondrie respiratoriske kjeden og forårsake ROS produksjon [18]. Vi neste testet oksidativt stress nivå i erastin behandlet HT-29 celler. Resultatene i figur 2D demonstrerte tydelig at erastin økt nivå av ROS i HT-29 celler. For å studere rollen til apoptose og ROS produksjon i erastin-indusert cytotoksisitet, ble forskjellige farmakologiske inhibitorer anvendes. Som vist i figur 2E og 2F, caspase-3 spesifikk hemmer z-DEVD-FMK, caspase-9 spesifikk hemmer z-LEHD-FMK, eller den superoksid scavenger MnTBAP [27] all lindres erastin-indusert cytotoksisitet i HT-29 celler (fig 2E og 2F). I to andre kolorektal kreft cellelinjer, erastin (10 mm) også indusert caspase-9 (Fig 2G) og apoptose (fig 2 H) aktivering samt ROS produksjon (Fig 2I). Slike effekter ved erastin igjen ble ikke sett i tykktarmen epiteliale NCM460 celler (fig 2G-2I). Derfor induserer erastin ROS produksjon og caspase-avhengig apoptose i kolorektal kreft celler.
3,3. Erastin induserer MPTP åpning i dyrkede kolorektal kreftceller
Siden erastin er en VDAC bindende forbindelsen [18], ble status for MPTP i erastin behandlet kolorektal kreftceller så vurdert. Først, mitokondriell immunoutfelling (Mito-IP) assay [28,29] viste at ANT-1 og Cyp-D dannet et kompleks i erastin behandlet med HT-29-celler (figur 3A), som er kjent som det innledende trinn av MPTP åpningen [12,13]. For det andre nivået av cytosol cytokrom C ble også øket i HT-29 celler etter erastin behandling (figur 3B), som er en kjent reaksjon etter MPTP åpning [12,13]. Videre er økningen av JC-10 grønn fluorescens intensitet indikerte tap av mitokondriell potensial (ΔΨm) (figur 3C). Alle disse resultatene klart indikerte at MPTP åpning følgende erastin behandling i HT-29 celler. Merk at lignende resultater ved erastin ble også oppnådd i andre to kolorektal kreft cellelinjer (data ikke vist).
HT-29 celler ble behandlet med anvendt erastin for angitt tid, ble MPTP åpning dokumentert av mitokondrie VDAC-en -ANT-en forening (A), cytokrom C ( «Cyto-C») slipper (B) og JC-10 økning intensitet (C). HT-29 celler ble forbehandlet med sanglifehrin A (SFA, 2,5 uM), cyklosporin A (CsA, 0,5 pM) eller bongkrekic syre (BA, 5 uM) før erastin (10 uM) Behandling av celleoverlevelse (D) og apoptose (E) ble analysert etterpå. Stabilt HT-29-celler som uttrykker VDAC-1 shRNA-1 /-2 eller krafse kontroll shRNA ( «scr shRNA») ble behandlet med erastin (10 uM), VDAC-1-ekspresjonen (F), celleoverlevelse (G) og apoptose ( H) ble testet. ANT-1-assocaited Cyp-D (A), cytosol cytokrom C uttrykket (B) og VDAC-1-ekspresjonen (F) ble kvantifisert. For hver analyse, n = 4. Dataene presentert var gjennomsnittlig ± SD. Forsøkene ble gjentatt tre ganger med lignende resultater erholdt. * P 0,05 vs. gruppe «Ctrl».
# p 0,05 vs. gruppe erastin bare (D og E) eller «scr shRNA» gruppe (G og H). «Trans» står for transfeksjon kontroll (FH).
For å studere rollen til MPTP i erastin-forårsaket cytotoksisitet, vi brukt flere kjente farmakologiske MPTP blokkere, inkludert sanglifehrin A (SFA) [30], ciklosporin A (CsA) [31] og bongkrekic syre (BA) [28,32]. Som vist, forbehandling med disse MPTP blokkere betydelig svekket erastin-indusert HT-29 celledød (Fig 3D) og apoptose (figur 3E). For å støtte vår hypotese lenger, ble shRNA strategi brukt til selektivt og stabilt knockdown VDAC-1, den viktigste komponenten i MPTP og bindende protein av erastin [12]. To stabilt HT-29 linjer som uttrykker tydelig VDAC-en shRNAs (-1 /-2) ble etablert (Fig 3F). Viktigere, erastin-indusert cytotoksisitet (Fig 3G) og apoptose (figur 3 H) ble betydelig hemmet i VDAC-en-forstummet HT-29 celler. Disse farmakologiske og genetiske bevis tyder på at erastin-indusert cytotoksisitet mot kolorektal kreft celler krever VDAC-en bindende og påfølgende MPTP åpning.
3,4. VDAC-en over-uttrykk forsterker erastin sin cytotoksisitet
For å støtte nøkkelrolle VDAC-1 i erastin-indusert cytotoksisitet videre, vi eksogent uttrykt VDAC-1 i HT-29 celler. Western blotting resultatene i figur 4A bekreftet VDAC-en over-uttrykk i stabilt HT-29 celler med VDAC-en konstruksjon. Som et resultat ble erastin-indusert reduksjon levedyktighet (figur 4B) og apoptose (figur 4C) utvidet. Videre studier viste at over-uttrykk for VDAC-en tilrettelagt erastin-indusert ROS produksjon (Fig 4D) og JC-10 OD økning (indikatoren for MPTP åpning, figur 4E). Interessant, viste vi at NCM460 kolon epitelceller uttrykt lavt nivå av VDAC-en (figur 4F). Likevel, når vi overuttrykt VDAC-1 i NCM460 celler (figur 4F), ble disse cellene utsatt for erastin (figur 4G). Derfor er disse resultatene videre bekrefte at VDAC-en er en viktig faktor for erastin aktivitet.
stabilt HT-29 celler eller NCM460 tykktarm epitelceller uttrykker tom vektor (pSuper-puro «Vec») eller VDAC-en cDNA ( «VDAC-1») ble behandlet med laget erastin for anvendt tid, VDAC-1-ekspresjon, celleoverlevelse og apoptose ble undersøkt ved Western blotting-analyse (A og F), MTT-analysen (B og G) og histon DNA-ELISA-analysen (C), henholdsvis; ROS produksjon (D) og JC-10 intensitet (E) ble også analysert. For hver analyse, n = 4. Dataene presentert var gjennomsnittlig ± SD. Forsøkene ble gjentatt tre ganger med lignende resultater erholdt. VDAC-1 uttrykk ble kvantifisert (F) * p 0,05 vs. Ctrl gruppe av «Mer» celler (B-E).
# p 0,05 vs. erastin gruppe av «Mer» celler (B-E). «Trans» står for transfeksjon kontroll (D og E).
3,5. Erastin administrasjon undertrykker HT-29 xenograft vekst i SCID-mus
in vivo
aktivitet ved erastin ble også testet. SCID mus HT-29 xenograft modell ble brukt. De ukentlige svulst vekst kurve resultatene i figur 5A vist at erastin intraperitoneal injeksjon dramatisk hemmet HT-29 xenograft vekst i SCID-mus. Erastin s
in vivo
aktivitet var igjen konsentrasjonsavhengig. Erastin ved 30 mg /kg var helt klart mer potent enn 10 mg /kg i undertrykke HT-29 xenotransplantater (figur 5A). Det bør bemerkes at musekroppsvekten var ikke signifikant forskjellig mellom hver grupper (figur 5B). Verken vi oppdager tegn på åpenbare bivirkninger hos disse musene. Disse resultatene indikerer at disse dyrene var godt tolerert til erastin regimer her. Videre svulst daglig vekst, beregnet som mm
3 /dag, ble redusert med erastin administrasjon (Fig 5C). På slutten av forsøkene, vekten av erastin administrerte xenotransplantater ble også mye lavere enn den til kjøretøyet kontrollmus (Figur 5D). Disse resultatene viste at erastin administrering inhiberer HT-29 tumorvekst
in vivo
.
HT-29 tumorbærende SCID-mus ble intraperitonealt administrert med erastin (10/30 mg /kg kroppsvekt eller » bw «, daglig i 4 uker) eller bærer (saltoppløsning) kontroll, tumorvolumer (A) og mus kroppsvekt (B) ble registrert hver uke i fem uker; Daglig tumorvekst ble også beregnet (C). Ved opphør av eksperimenter, alle xenotransplantater ble isolert og vektet (D). For hver analyse, n = 10. De data som er presentert var gjennomsnittlig ± SD. Forsøkene ble gjentatt to ganger med lignende resultater erholdt. * P 0,05 vs. gruppe «Vehicle».
# p 0,05 vs. gruppe erastin på 10 mg /kg kroppsvekt.
Diskusjoner
I denne studien har vi vist at erastin utøves potent cytotoksisk effekt mot flere menneskelige kolorektal kreftceller eventuelt via induserende oksidativt stress og caspase-9 avhengige celle apoptose. MPTP åpningen ble observert i erastin-behandlede kreftceller, som ble dokumentert av VDAC-en og CYP-D forening, mitokondrie depolarisering og cytokrom C utgivelse. Kaspaseinhibitorer, ROS-scavenger MnTBAP og MPTP-blokkere (sanglifehrin A, cyklosporin A og bongkrekic syre), samt shRNA-mediert knockdown av VDAC-1, alt vesentlig attenuert erastin-indusert cytotoksisitet og apoptose i kolorektal kreftceller. På den annen side, over-ekspresjon av VDAC1 forsterkes erastin s cytotoksisitet. Basert på disse resultatene, foreslår at erastin binder seg til VDAC1 å forstyrre normal mitokondriefunksjon, forårsaker MPTP åpning, og til slutt fører til caspase-9-avhengig apoptose aktivering i kolorektal kreftceller.
Det skal bemerkes at erastin var ikke-cytotoksiske til NCM460 kolon epitelceller. Vi klarte også å påvise noen signifikant caspase-9 aktivering eller MPTP dysfunksjon i erastin behandlet NCM460 celler. En mulig årsak kan være at disse ikke-kreft epitelceller uttrykker svært lavt nivå av VDAC (-1), derfor celler ble ikke angrepet av erastin (se figur 4). Som et spørsmål om faktum, når vi eksogent over-uttrykte VDAC-1 i NCM460 celler, disse celler, på samme måte som kreftceller, ble utsatt for erastin (se figur 4). En annen mulighet er at kreftceller er alle rask dyrking av celler, som muligens krever høy grad av mitokondriell respiratoriske kjeden for å frembringe ATP. Disse cellene kan være mer følsomme for VDAC eller MPTP avbrudd. Det faktum at erastin kun er rettet mot kreftceller indikerer at det kan være en ideell kandidat for anti-kreftbehandling.
Selv om flere studier har undersøkt muligheten anti-kreft aktivitet ved erastin
in vitro product: [ ,,,0],14,16,33],
in vivo
bevisene er fortsatt mangelfull. I foreliggende studie viste vi at intraperitoneal injeksjon av erastin i godt tolererte doser (10 eller 30 mg /kg, daglig) dramatisk hemmet HT-29 xenograft vekst i SCID-mus. Viktigere,
in vivo
erastin regimer ikke påvirke mus vekter, heller ikke det forårsake vesentlige toksisitet til forsøksdyr. Disse prekliniske resultatene tyder på at erastin kan være en lovende anti-kolorektal kreft agent.
Konklusjoner
I sammendraget, forstyrrer erastin MPTP og induserer apoptose død av kolorektal kreft celler. Erastin kan bli ytterligere etterforsket som en roman anti-kolorektal kreft agent.
