Abstract
Molekylær analyse av celler fra urin gir en praktisk tilnærming til ikke-invasiv påvisning av blærekreft. Den praktiske anvendelse av urin celle-baserte tester blir ofte hemmet av vanskeligheter med håndtering og analyse av store prøvevolumer, behovet for rask prøvebehandling for å unngå nedbrytning av celleinnhold og lav følsomhet på grunn av en høy bakgrunn av normale celler. Vi presenterer en filtrering enhet, beregnet for hjem eller point-of-care bruk, som gjør det mulig for innsamling, lagring og utskipning av urin celler. Et spesielt trekk ved denne enheten er en fjernbar patron som huser et membranfilter, noe som etter filtrering av urin, kan overføres til en oppbevaringsenhet inneholdende en passende beholder løsning. I spiking eksperimenter ved bruk av denne innretningen forsynt effektiv utvinning av blærekreftceller med eliminering av 99% av overskytende mindre størrelse celler. Utførelsen av anordningen ble ytterligere evaluert ved DNA-basert analyse av urin celler samlet fra 57 pasienter som utsettes for transuretral reseksjon følgende fleksibel systoskopi som indikerer tilstedeværelsen av en tumor. Alle prøvene ble testet for
FGFR3
mutasjoner og sju DNA metylering markører (
BCL2
,
CCNA1
,
EOMES
,
HOXA9
POU4F2
,
SALL3 Hotell og
VIM
). I gruppen av pasienter der en overgangsordning celle tumor ble bekreftet ved histopatologisk evaluering, urin DNA var positivt for en eller flere markører i 29 av 31 tilfeller (94%), inkludert 19 med
FGFR3
mutasjon (61% ). I gruppen av pasienter med godartet histopatologi, urin DNA var positivt for metylering markører i 13 av 26 tilfeller (50%). Bare én pasient i denne gruppen var positive for en
FGFR3
mutasjon. Denne pasienten hadde en scene Ta svulst resected 6 måneder senere. Muligheten til enkelt å samle inn, lagre og sende diagnose celler fra urin bruke presenteres enheten kan legge til rette for ikke-invasive tester for blærekreft
Citation. Andersson E, Dahmcke CM, Steven K, Larsen LK, Guldberg P ( 2015) Filtrering enhet for On-Site Collection, lagring og utskipning av celler fra urin og dens anvendelse i DNA-basert diagnostikk av blærekreft. PLoS ONE 10 (7): e0131889. doi: 10,1371 /journal.pone.0131889
Redaktør: Jorg Tost, CEA-Institut de Genomique, FRANCE
mottatt: 01.10.2014; Godkjent: 08.06.2015; Publisert: 07.07.2015
Copyright: © 2015 Andersson et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er innenfor papir
Finansiering:. Denne studien fikk stipend støtte fra Candy Foundation
Konkurrerende interesser. KS og PG er oppkalt oppfinnere på en patentsøknad innlevert ved Cancer Research Technology Limited, som knyttet til enheten som er beskrevet i denne artikkelen: Publikasjonsnummer nummer~~POS=HEADCOMP WO2015036781; Søknadsnummer PCT /GB2014 /052776; Publiseringsdato 19 mars 2015. Dette patentet endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Analyse av sjeldne celler til stede i komplekse biologiske væskeprøver gir en potensielt kraftig diagnostisk og vurderingsverktøy for en rekke sykdommer og tilstander. Spesielt isolasjon, kvantifisering og nedstrøms testing av kreftceller til stede i pasientens kropp væskeprøver holde store løftet for ikke-invasiv påvisning og karakterisering av svulster å veilede diagnostiske og terapeutiske avgjørelser. En felles tilnærming for å kreftdiagnostikk gjennom minimal invasiv sampling er ved isolering av intakte tumorceller eller celle-fri tumor-DNA fra perifere blodprøver [1,2]. Evnen til å analysere sirkulerende tumor avledet materiale er raskt avanserte av store teknologiske utviklingen og oppdagelsen av svært informative biomarkører, inkludert noen som representerer mål for presisjon kreftbehandling [3].
For urologiske kreftformer som blære kreft, gir urin et mer passende kilde for diagnostisk materiale. Celler utøst fra svulster som ligger i urinveiene akkumuleres i blæren og kan samles inn og analyseres non-invasiv av urin sampling [4]. Urin cytologi har vært mye brukt til å diagnostisere urologiske kreftformer, særlig som et supplement til cystoskopi for påvisning og overvåking av blærekreft. Men for blære svulster lavgradig, har cytologi en følsomhet så lav som 10-20% [5] og har blitt forlatt av mange sentre. Flere urinprøver for blærekreft har blitt godkjent av US Food and Drug Administration (FDA), men resultatene deres er fortsatt dårligere enn cystoskopi i form av følsomhet (sann positiv rate) og spesifisitet (sann negativ rate) [6]. Høyere ytelse kan oppnås ved å bruke gen-baserte urin biomarkører som driver mutasjoner og DNA-metylering endringer, som er kreft spesifikke og mindre påvirket av inflammasjon og andre benigne tilstander [7-12]. Med bruk av forbedrede metoder for påvisning og kvantifisering av sjeldne DNA-molekyler, inkludert neste generasjons sekvensering og digital PCR [13], følsomheten av DNA-basert gjenkjenning av blæren svulster kan økes ytterligere.
Til tross for sin løfte, bruk av urincellebaserte analyser for påvisning av blærekreft er begrenset av iboende utfordringene ved innsamling og behandling av urinprøver. Den vanligste fremgangsmåte for å analysere det cellulære innholdet av urin innebærer sedimentering av celler ved sentrifugering. For å unngå cellelyse og nedbrytning av cellulære komponenter, må prøvene behandles raskt etter tømming. For disse praktiske grunner er sampling vanligvis utføres på en egen side med spesialisert utstyr og opplært personell. Et annet viktig aspekt knyttet til utførelsen av urinbaserte tester er den høye intra- og interindividuell variasjon i total urincelletall og forholdet mellom tumor-til-normal celler [14]. En høy bakgrunn av normale celler begrenser følsomheten for de fleste deteksjons analyser og krever at en større fraksjon av prøvematerialet bli analysert for å øke sjansen for å identifisere tumorceller.
Den cellulære komponent i urin er meget heterogen, bestående av celler av forskjellige typer og størrelser, slik som epitelceller, plateepitel-celler og makrofager [15,16]. Vi [17] og andre [18-20] har tidligere vist at pre-analytiske filtrering av urinen ved hjelp av et membranfilter tilveiebringer et middel for å fange opp og å anrike blærekreftceller fra urin. Med en porestørrelse på ca. 8 mikrometer, kan slike filtre fange normale og maligne urotelialceller, som typisk har en diameter på 20 um, mens de eliminere noen mindre celler. En typisk fremgangsmåte for filtrering, slik som den som brukes i vår tidligere studie [17], innebærer bruk av en engangssprøyte for å tvinge urin gjennom et membranfilter montert i et egnet filterholder utstyrt med et innløp og et utløp. Etter filtrering, blir filteret fjernet med pinsett og overført til et mikro-sentrifugerør for umiddelbar bearbeiding eller fryselager. Denne fremgangsmåten krever trening, er ikke egnet for behandling av store volumer og innebærer risiko for å miste materiale gjennom søl og under håndtering av den delikate filtermembraner.
Vi presenterer en filtrering enhet for prøvetaking og lagring av celler fra store volumer av urin eller andre biologiske fluider. Etter filtrering kan filteret med fangede celler lett kan fjernes fra filtreringsanordningen og plassert i en vanntett lagringsenheten, som inneholder en hensiktsmessig løsning for å fremstille eller å bevare de fangede cellene. Lagringsenheten kan så sendes til et testanlegg for passende nedstrøms analyse av det cellulære innholdet. Vi demonstrerer bruk av denne enheten for DNA-basert karakterisering av pasienter med godartede lesjoner og ondartede svulster i blæren.
Materialer og metoder
Pasienter og urinprøver
Urin prøvene ble samlet inn fra pasienter som rutine fleksibel cystoskopi i poliklinikken viste tegn på blæren svulst og som senere ble henvist til transuretral reseksjon av blæren (TURB) ved Københavns universitetssykehus, Herlev, Danmark. Studien inkluderte både nydiagnostiserte pasienter og pasienter som gjennomgår sjekk cystoskopi rutine som oppfølging av tidligere diagnostisert overgangsordning celle svulst i blæren. Prøvene ble fraktet i romtemperatur til den danske Kreftforeningen og behandles innen 4-6 timer etter tømming. Studien ble godkjent av Komiteen for Biomedical Research Ethics av Region Hovedstaden (H-2-2010-045), og skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle fagene før studien deltakelse.
Innsamling av celler og DNA
annullert urinprøver (100-400 ml) eller suspensjoner av dyrkede celler ble behandlet ved hjelp av en filtreringsenhet (fig 1) montert med en Nuclepore spor-etset polykarbonat hydrofil membranfilter (diameter 25 mm, porestørrelse 8 pm; Whatman, Maidstone, UK). Etter filtrering ble filterpatronen overført til lagringskassetten, som deretter ble montert med lokket fra en Oragene DNA Self-prøvetakingssett inneholdende 1,7 ml lyserings /stabilisering buffer (plateformat OG-250, DNA Genotek, Ottowa, Ontario, Canada). Ifølge produsenten, er DNA stabilt i denne løsningen for 5 år ved romtemperatur. DNA ble renset fra 0,5 ml av prøven ved hjelp av Oragene DNA-renseoppløsning (DNA Genotek), i henhold til den etanolutfelling protokollen gitt av produsenten. For oppsamling av den totale cellulære komponent, ble 25 ml urin ble sentrifugert ved 2000 g i 10 min. Pelleten ble resuspendert i 200 ul av fosfatbufret saltvann (PBS) og lagret ved -80 ° C. DNA ble ekstrahert ved bruk av Qiagen Mini-Prep-sett (Qiagen GmbH, Hilden, Tyskland) i henhold til produsentens instruksjoner (protokoll for DNA-rensing fra vev). DNA utbyttet ble anslått av kvantitativ real-time PCR-analyse, ved hjelp av et LightCycler 2.0 system (Roche, Mannheim, Tyskland), den Faststart DNA Master
PLUS SYBR Grønn Jeg Kit (Roche), Human Genomisk DNA (Roche) som referanse og de følgende primere for
GAPDH product::. 5′-TAGTGTCCTGCTGCCCACAGTCCAG-3 «og 5′-GGCGACGCAAAAGAAGATGC-3»
anordningen består av en filtreringsenhet (A, individuelle komponenter; B, samlet enhet, C, etter filtrering) og en vanntett oppbevaring kassett (D, individuelle komponenter;. E, montert kassett)
Cellekultur kultur~~POS=HEADCOMP og modellsystem
urothelial karsinom avledede cellelinjer 639V og 97-7 var fra laboratoriet av Margaret A. Knowles og havnen
FGFR3
p.R248C og p.S249C mutasjoner, henholdsvis [21]. Celler ble opprettholdt i DMEM-medium supplert med 10% føtalt bovint serum ved 37 ° C i en fuktet inkubator med 5% CO
2. Lymfocytter fra en frisk donor ble fremstilt fra perifert blod i henhold til en tidligere beskrevet protokoll [22]. Celler ble frosset i AIM V Medium (Gibco) inneholdende 45% menneske-plasma-avledet serum + 10% DMSO og lagret ved -80 ° C. Frosne celler ble tint i et 37 ° C oppvarmet vannbad, og utvinnes i AIM V medium ved 37 ° C i 30 minutter før bruk. Cellene i suspensjonen ble tellet og deres diameter ble målt ved anvendelse av en Countess Automated celleteller (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Lymfocytter og carcinoma celler ble blandet i forskjellige forhold i 100 ml PBS og behandlet ved hjelp av filtrering enhet.
Mutasjon analyse
Deteksjon og kvantifisering av
FGFR3
mutasjoner (s. R248C, p.S249C, p.G370C og p.Y373C) og tilsvarende villtype-sekvenser ble utført ved PCR dråpe digital (ddPCR), ved hjelp av QX200 system (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA), og hydrolyse-probe-baserte analyser ( PrimePCR ddPCR mutasjonsdeteksjon Analyser, Bio-Rad). PCR Blandingen inneholdt 11 pl av ddPCR dråpe SuperMix av sonder (ikke dUTPs), 1,1 ul av mutasjon primer /probe mix (FAM), 1,1 ul av villtype-primer /probe mix (HEX) og 2 pl av DNA i et sluttvolum av 22 pl. Tyve mikroliter av denne blanding og 70 pl av dråpe generasjon olje ble overført til forskjellige brønner på en dråpe generasjon patron. Etter dannelsen av små dråper ved hjelp av dråpegeneratoren, ble prøver overført til en 96-brønners PCR-plate og underkastes amplifikasjon i 40 sykluser ved 94 ° C i 30 sek. og 55 ° C i 60 sek. Dråper (i gjennomsnitt ~ 16000 per reaksjon) ble analysert på dråpen leseren, og Quantasoft software (versjon 1.4.0.99) ble anvendt for å analysere DNA-konsentrasjoner. Stenge innstillinger ble bestemt ved hjelp av mutasjon-positive og negative kontroll DNA-prøver. For urinprøver behandlet både ved filtrering og sedimentering, ble ekvimolare mengder av DNA som benyttes som templat.
DNA metylering analyse
DNA (opp til 500 ng) ble behandlet med bisulfit ved hjelp av EZ DNA Metylering -Gold Kit (Zymo Forskning Corp, Orange, CA, USA), eluert i 20 ul M-elueringsbuffer og lagret ved 80 ° C. Kvantitativ analyse av metylering nivåer på promotor CpG øyene
BCL2
,
CCNA1
,
EOMES
,
HOXA9
,
POU4F2
SALL3 Hotell og
VIM
ble utført ved bruk av TaqMan-basert real-time PCR (MethyLight) analyser, ved hjelp av tidligere beskrevne primere, prober og vilkår [17]. Reaksjonene ble utført på LightCycler 480 kurven med LightCycler 480 prober Master Kit (Roche, Mannheim, Tyskland) og 1 mL av sulfitt-behandlede DNA per reaksjon.
In vitro
metylert DNA (IVM; CpGenomeTM Universal denaturert DNA, Chemicon /Millipore, Billerica, MA) og hel-genom forsterket DNA fungerte som positive og negative kontroller for metylering, henholdsvis. Metylering nivåene ble beregnet som prosent metylert referanse (PMR;. Ref [23]) ved å normalisere merkespesifikke reaksjons verdier til
ALUC4
verdier i forhold til de samme verdiene for fullt metylert kontroll (IVM). Prøver med en konsentrasjon under tilsvarende 0,25 ng /mL ikke sulfitt-behandlet DNA ble ekskludert. For hver markør, ble den cut-off-verdi over hvilken en prøve ble ansett som positiv bestemt ved analyse av DNA fra filtrerte urin fra 11 friske kontroller [17]. Cut-off PMR verdier for
HOXA9
,
POU4F2
,
SALL3 Hotell og
VIM
var 3, 2, 0,5 og 2, henholdsvis, mens ingen bakgrunnen forsterkning ble observert for
BCL2
,
CCNA1 Hotell og
EOMES
.
Resultater
Outline av filtreringsenheten
proto~~POS=TRUNC av filtreringsanordningen og dens enkelte komponenter er vist i figur 1. hele anordningen sammenstillingen omfatter 1) en filtreringsenhet for filtrering av en biologisk væskeprøve, 2) en fjernbar filterpatron som inneholder et filter som passer for å fange opp relevant material og 3) en lagringsenhet for fremstilling og /eller bevaring av filterinnholdet. Filtreringsenheten har et oppsamlingskammer, et avfallsreservoaret, og en filterstøtteplattform som huser den fjernbare filterpatron (figur 1A). Disse tre delene er forbundet for å tillate passasje av en væske fra oppsamlingskammeret og inn i avfallsreservoaret gjennom filteret av filterpatronen (figur 1B). Oppsamlingskammeret består av en sylindrisk pose er omgitt av en skruefjær, som kan være manuelt komprimeres for å generere et trykk som tvinger væske gjennom filteret (figur 1C). Filterstøtteplattformen inneholder en ventil som frigjøres ved høyt trykk dersom filteret blir tilstoppet av materiale, slik at direkte passasje av væske fra oppsamlingskammeret inn i avfallsreservoaret. Den avfallsreservoaret inneholder absorberende materiale for å muliggjøre avhending av enheten og fluid avfall. Prototypen av denne enheten er utformet med en maksimal fluid kapasitet på 500 ml for å imøtekomme og behandle hele urin hulrom.
Etter filtrering kan den filterpatron med filter tas ut av filtreringsenheten og satt inn i lagerenheten (fig 1D). Lokket på lagerenheten inneholder en passende behandling eller lagringsløsning som er sluppet på filter når lokket er montert. Når engasjert med filterpatron og lokk, danner lagringsenhet en forseglet konstruksjon som kan enkelt og trygt transportert (Fig 1E). Når mottatt av en analytiker kan fanges biologisk materiale lett kan hentes fra lagerenheten ved fjernelse av lokket.
Evaluering av enhetsytelse
Som et modellsystem for å vurdere muligheten av enhet for å fange opp og nummerere tumorceller fra fluidprøver, vi brukte 639V urothelial carcinoma-cellelinjen, som har en punktmutasjon (p.R248C) i genet som koder for fibroblast-vekstfaktor-reseptor-3 (
FGFR3
) med tap av det tilsvarende villtype-allelet (fig S1). I det første sett av eksperimenter, 100 ml PBS inneholdende mellom 1000 og 5 x 10
6 639V celler (diameter, 11-18 um) ble tilsatt til oppsamlingskammeret av innretningen og presses gjennom en polykarbonatmembranfilter med en porestørrelse på 8 um. For å kvantifisere antallet celler fanget på filteret, ekstrahert vi total DNA og bestemt antall mutant
FGFR3
molekyler ved hjelp av en dråpe digitalt PCR (ddPCR) assay. I denne innstillingen, er en positiv hendelse tilsvarer en celle. Positive signaler ble reproduserbart oppnådd for alle prøver når 2 ul (4%) av det ekstraherte DNA ble anvendt som templat for ddPCR (figur 2A). Spesielt, for den laveste konsentrasjon av celler (1000 i 100 ml), gjenvinning var ~ 70% (figur 2B). Ved høyere konsentrasjoner av celler, var det en reduksjon i utvinningsgrad, ned til ~ 5% ved 5 x 10
6 celler /100 ml. Denne lavere gjenvinning var forventet som metning av filteret vil føre til frigjøring av trykkventilen og en direkte strøm av det gjenværende fluidet og dets cellulære innhold inn i avfallsreservoaret. Denne innledende testingen antydet at filtreringsanordningen kan benyttes til effektivt å fange opp blærekreftceller fra en væske, og at utvinningsgraden er meget høy ved lave konsentrasjoner av celler, hvor kapasiteten til filteret har ennå ikke blitt nådd.
PBS (100 ml) inneholdende mellom 1000 og 5 x 10
6 639V-celler ble behandlet ved bruk av en anordning montert med en 8-um porestørrelse polykarbonat membranfilter. DNA ble ekstrahert fra filtrene og testet for mutante
FGFR3 plakater (p.R248C) molekyler ved hjelp ddPCR. DNA fra normale perifere blodlymfocytter ble anvendt som en kontroll for villtype
FGFR3
. A, ddPCR fluorescens amplitude plot. Vertikale linjer representerer manuelt sette cutoff innstillinger. Resultatene som vises er fra en av to uavhengige eksperimenter. B, Bar diagram som viser antall gjen celler (beregnet på grunnlag av mutant
FGFR3
molekyler) i forhold til antall input celler. Totale tellinger av mutantmolekyler ble beregnet ut fra tre uavhengige ddPCR tester, som hver måler mutante molekyler i 4% av den totale DNA-prøve. Data fra triplikate målinger (hver på 4% av total DNA) fra ett eksperiment er representert som middel ± SD. Prosentandeler over stolpene representerer antall gjenvundne celler i forhold til antall inn- celler.
For å teste evnen til filtreringsanordningen for å øke konsentrasjonen av blærecancerceller til stede i en bakgrunn av mindre størrelse normale celler, tilsatt vi mellom 1000 og 50.000 639V celler inn i 100 ml PBS inneholdende 10
7 normale rensede dyrkede humane lymfocytter (diameter 7-8 um) og behandlet suspensjonen ved hjelp av filtreringsanordningen. Analyse av DNA ekstrahert fra filtre ved ddPCR viste signaler for både mutant (p.R248C) og villtype
FGFR3 plakater (figur 3A). Viktigst, utvinningsgraden av mutant DNA var lik den som oppnås med rene løsninger av 639V celler (figur 3B). Selv om behandling av prøver ved filtrering eliminert de fleste lymfocytter (mer enn 99%), var det et konsistent bakgrunn av villtype
FGFR3
alleler (fig 3), som kan være avledet fra gjenværende monocytter (diameter, 15-25 um) som er tilstede i de lymfocyttpreparater.
mellom 1000 og 50000 639V-celler ble tilsatt i 10
7 normale lymfocytter i 100 ml PBS, og suspensjonen ble behandlet ved hjelp av filtreringsanordningen. DNA ble ekstrahert fra filtrene og testet for mutant (p.R248C, Mut) og villtype (WT)
FGFR3
hjelp ddPCR. A, ddPCR fluorescens amplitude plott av
FGFR3
R248C-FAM probe fluorescens signal (blå, øvre panel) og
FGFR3
WT-HEX probe fluorescens signal (grønn, nedre panel). Vertikale linjer representerer manuelt sette cutoff innstillinger. Resultatene som vises er fra en av to uavhengige eksperimenter. B, et stolpediagram som viser antall gjenvundne celler (beregnet på grunnlag av mutanten og WT
FGFR3
molekyler) i forhold til antall inngangstumorceller. Totale tellinger av
FGFR3
molekyler ble beregnet ut fra tre uavhengige ddPCR tester, hver ved hjelp av 4% av total DNA som templat, og er representert som middel ± SD. Prosenter over stolpene representerer antall gjen celler i forhold til antall input celler.
For å vurdere variasjonen i resultatene, vi filtrert 100 ml PBS som inneholder 500, 1000 eller 5000 97-7 celler (diameter, 18-25 um), hver med 3-5 datapunkter fra tre uavhengige eksperimenter. DNA ble isolert og antall-mutanten
FGFR3
(p.S249C) molekyler ble kvantifisert ved hjelp av ddPCR. I denne modellen, den intra-prøven variasjonen var generelt lav og redusert med større celle nummer (S2 figur).
Deteksjon av blærekreft i urinprøver
Vi har evaluert resultatene av enheten neste ved å behandle urin samlet inn fra 59 pasienter umiddelbart før TURB. Alle pasientene hadde vist tegn til blæren tumor når den først undersøkt av fluorescens-guidet fleksibel cystoskopi. På grunnlag av histopatologiske evaluering av biopsier, ble 33 av pasientene diagnostisert med blæretumorer, mens de gjenværende 26 pasienter hadde benigne lesjoner eller normal blære epitel. Tabell 1 og 2 viser de demografiske og sykdomslære data for disse pasientene. Flertallet av svulster var invasiv (stadium Ta; 73%), en var en papillær urothelial svulst i lav malignt potensial (PUNLMP), to ble klassifisert som tumor in situ (Tis), fire var stadium T1 og to var scenen T2. Tjue svulster (61%) var lav karakter.
For å teste om filtrering kunne øke andelen av normal-til-tumor celler, vi først testet 13 urinprøver i en split- prøven oppsett, hvor 25 ml av hver prøve ble sedimentert ved sentrifugering, og resten ble behandlet ved filtrering. DNA isolert fra alle filtrer og sedimentprøver ble screenet for fire felles
FGFR3
mutasjoner (p.R248C, p.S249C, p.G370C og p.Y373C) ved hjelp ddPCR. Åtte av prøvene (58%) var positive for en av disse mutasjoner (tabell 1). Kvantitativ analyse ved anvendelse av ekvimolare mengder av samlet DNA fra filtrene og sedimenter viste at forholdet mellom mutant-til-villtype-DNA var høyere i de filtrerte prøver enn i de tilsvarende sedimenter (Tabell 3). Viktigst, ble de største enrichments (6,5 og 8,0 ganger, henholdsvis) oppnådd for de to utvalgene som representerer de laveste mutant-til-villtype forholdstall (fig 4).
Urinprøver fra pasienter med blære svulster ble delt i to fraksjoner og behandlet av anordningen filtrering og sedimentering, respektivt. Ekvimolare mengder av DNA fra filtre og sedimenter ble testet for
FGFR3
mutasjoner ved hjelp ddPCR.
Alle gjenværende urinprøver ble behandlet ved filtrering alene, og DNA ble ekstrahert og undersøkt for
FGFR3
mutasjoner ved hjelp ddPCR og sju DNA-metylering markører (
BCL2
,
CCNA1
,
EOMES
,
HOXA9
,
POU4F2
,
SALL3 Hotell og
VIM
) med MethyLight analyser. Flere studier av blærekreft har rapportert høy følsomhet ( 50%) og spesifisitet ( 90%) for disse markørene i blæren svulster [7,8,24], og som et panel de ga en sensitivitet på 94% [17 ].
median DNA utbytte fra urinprøver fra 33 pasienter med blære svulster var 138 ng (intervall 6,3 til 3600 ng). I to prøver fra pasienter med lav grad av Ta- tumorer, mengden av DNA etter behandling bisulfitt var utilstrekkelig til å tillate analyse av hele biomarkør panelet. Tabell 1 viser resultatene for de resterende 31 prøvene. Nitten av prøvene inneholdt
FGFR3
mutasjoner (61%), med de fleste mutasjoner er p.Y373C (50%) og p.S249C (45%). En prøve inneholdt p.Y373C og p.S249C. Totalt 118 promoter hypermethylation hendelser ble identifisert i 29 prøver (94%), med et gjennomsnitt på 4,1 (range 1-7) hendelser per prøve. I samsvar med den høyeste følsomhet ble oppnådd med
VIM
, som var positiv i 81% av tilfellene tidligere studier [8,17]. De seks andre markører hadde følsomhet som strekker seg fra 74% (
HOXA9
) til 29% (
EOMES
). De to prøvene negative for alle mutasjon og metylering markører var fra en pasient med PUNLMP og en pasient med en lavgradig Ta svulst, henholdsvis.
Median DNA utbytte fra urinprøver samlet inn fra 26 pasienter med godartet histopatologi var 271 ng (område 21 til 1605 ng). Totalt 30 promoter hypermethylation hendelser ble identifisert i 13 prøver (50%), med et gjennomsnitt på 2,3 (range 1-5) hendelser per prøve. De resterende prøvene var negative for alle markører. Profilen til positive markører i denne pasientgruppen var forskjellig fra den hos pasienter med svulster, med
SALL3 product: (26%),
CCNA1 product: (22%) og
POU4F2
(19%) er den hyppigste. Positive metylering markører ble funnet i åtte av 12 pasienter (67%) som tidligere hadde vært behandlet for blærekreft, og ble tatt opp til oppfølging, og i 5 av 14 pasienter (36%) som ikke hadde noen tidligere historie med blærekreft . Bare én av pasienter med benign blære patologi hadde en
FGFR3
mutasjon påvises i urinen. Denne pasienten var også positivt for fem metylering markører og ble diagnostisert med en lavgradig Ta svulst på repeat cystoskopi 6 måneder etter negative TURB.
Diskusjoner
Vi har utviklet og testet en filtrering enhet noe som gir enkel og rimelig innsamling og behandling av diagnostiske celler fra urin. Enheten kan brukes av pasienter eller helsepersonell for å levere en prøve av celler som er egnet for DNA-analyse. Bufferen i lagringsenheten sikrer langtidsstabilitet av DNA ved romtemperatur, og gir rikelig tid for å sende prøven til et testanlegg ved hjelp av standardpostvesenet. Den enkel prosedyre for å gi urin celler kan i stor grad redusere behovet for direkte kontakt mellom pasient og helsevesen, og kan være et attraktivt alternativ i lave ressursinnstillingene der cystoskopi ikke kan tilbys som en standard for påvisning av blærekreft. Fokuset i denne studien var på blærekreft, men den samme fremgangsmåte kan anvendes på andre urogenitale kreftformer, slik som øvre urinveis tumorer [4], så vel som andre tilstander hvor analyse av urin celler har diagnostisk, prognostisk og terapeutisk verdi.
i spiking eksperimenter har vi demonstrert at filtrerings- anordningen var i stand til å fange opp tumorceller mens den eliminerer et stort overskudd av mindre størrelse celler. Videre analyse av urinprøver fra pasienter med blærekreft viste at filtrering økte forholdet mellom tumoren-til-normal-celler sammenlignet med sedimentering av celler ved sentrifugering, spesielt for prøver hvor dette forhold var lav. Det bør imidlertid bemerkes, at utvinning og anrikning av celler ved filtrering, avhenger av en rekke variabler, inkludert cellekarakteristikker (for eksempel størrelse og deformerbarhet), filterkarakteristikken (for eksempel porestørrelse, antall porer, avstanden mellom porene og filter materielle) [25] og filtreringsparametre (f.eks strømningshastighet og trykk over filteret) [26].
Blant pasienter som hadde en blære svulst bekreftet ved histopatologisk undersøkelse, urin DNA var positivt for minst én av de testede biomarkører (
FGFR3
mutasjoner og arrangøren hypermethylation hendelser) i 94% av tilfellene. Dette tallet er oppmuntrende tatt i betraktning at de fleste pasientene i denne kohort presentert med små ikke-invasive tumorer, som er generelt vanskelig å oppdage i urin, fordi de kaster relativt få celler [27]. Likevel er større prospektive studier er nødvendig for ytterligere å evaluere potensialet av denne tilnærmingen for detektering av blærekreft i et diagnostisk omgivelser. Den høye følsomheten for påvisning av blæretumorer som er oppnådd i denne undersøkelsen kan i det minste delvis tilskrives de store volumer (full hulroms) urin behandlet. Zuiverloon et al. [14] viste at følsomheten av DNA-basert deteksjon av blæretumorer økte proporsjonalt ved å øke volumet av urin og at den mest pålitelige testen ble oppnådd på basis av en 24 timers kolleksjon av urin celler, i likhet med de vanlige prosedyrer for samling av råolje urin for diagnostisering av andre forhold som porfyri og nyresvikt. I denne forbindelse, kan enheten som er beskrevet her lette hyppig og gjentatt prøvetaking.
Nesten halvparten av pasientene som utsettes for TURB grunn av bevis for tumor ved rutine fleksibel cystoskopi ble funnet ikke å nære overgangsordning celle tumor i biopsiprøver . Interessant, urinprøver fra halvparten av disse pasientene var positive for en eller flere av DNA-metylering markører, til tross for disse markørene blir negativ i urin fra friske individer. Tidligere studier har vist promoter hypermethylation i normal-vises urothelium fra pasienter med blærekreft [28], noe som indikerer en epigenetisk feltet defekt «. Andre studier har vist at DNA-metylering biomarkører kan påvises i urin år etter reseksjon av en blære svulst tross for manglende tilbakefall [29,30]. Epigenetiske endret flekker av urothelium fenotypisk umulig å skille fra normal urothelium kan representere forstadier for blærekreft og kan forklare den høye tilbakefall. Derfor er det mulig at pasienter med DNA-metylering markører påvise i urinen kan ha økt risiko for å utvikle blærekreft senere i livet. I motsetning til den høye forekomst av
FGFR3
mutasjoner i urinen fra pasienter med bekreftet blære tumor (67%), bare én av pasienter med benign histopatologi hadde en
FGFR3
mutasjon påvises i urin. Interessant nok var denne pasienten diagnostisert med en blære svulst et halvt år senere, noe som tyder på at urinen DNA-testing kan påvise noen blæresvulster på et tidligere stadium enn TURB prosedyre.
filtrering enhet fanger effektivt celler fra store mengder urin og konsentrater og lagrer dem for praktisk transport og nedstrøms testing.
