Abstract
Bakgrunn
Slett nyrecellekarsinom (ccRCC) er vanligste typen av nyrekreft. En av prosessene forstyrret i denne krefttypen er alternativ spleising, selv om fenomener bak disse forstyrrelsene er fortsatt ukjent. Alternativ spleising består av selektiv fjerning av introner og eksoner sammenføyning av gjenværende av det primære transkript, for å fremstille mRNA-molekyler av forskjellig sekvens. Spleise avvik kan føre til tumor transformasjon grunn syntese av nedskrevne spleisevarianter med onkogene potensiale. I denne artikkelen hypotese vi som forstyrret alternativ spleising i ccRCC kan skyldes feilaktig uttrykk for spleise faktorer, meklere av spleise reaksjoner.
metodikk /hovedfunnene
Ved hjelp av real-time PCR og Western-blot analyse analyserte vi uttrykk for syv spleise faktorer som tilhører SR proteiner familie (SF2 /ASF, SC35, SRp20, SRp75, SRp40, SRp55 og 9G8), og en ikke-SR faktor, hnRNP A1 (heterogen atom ribonucleoprotein A1) i 38 par tumor-kontroll ccRCC prøver. Videre analyserte vi spleising mønstre av fem gener som er involvert i kreftutvikling og delvis regulert av analyserte spleise faktorer:. RON, CEACAM1, Rac1, caspase-9, og GLI1
Konklusjon /Betydning
Vi har funnet at mRNA-ekspresjon av spleise faktorer ble forstyrret i tumorer sammenlignet med sammenkoblede kontroller, på samme måte som nivåene av SF2 /ASF og hnRNP A1 proteiner. Korrelasjonskoeffisientene mellom uttrykk nivåer av spesifikke spleise faktorer ble økt i tumorprøver. Videre alternativ spleising av fem analyserte genene ble også forstyrret i ccRCC prøver og skjøting mønster av to av dem, Caspase-9 og CEACAM1 korrelert med ekspresjonen av SF2 /ASF i tumorer. Vi konkluderer med at forstyrret uttrykk for skjøting av faktorer i ccRCC kan føre til nedsatt alternativ spleising av genene regulere tumorvekst, og på denne måten bidrar til prosessen med å karsinogenese
relasjon:. Piekielko-Witkowska A, Wiszomirska H, Wojcicka A , Poplawski P, Boguslawska J, Tanski Z, et al. (2010) Disturbed Expression of Skjøte Faktorer i nyre kreft påvirker alternativ spleising av apoptose regulatorer, Onkogener og tumor Dempere. PLoS ONE 5 (10): e13690. doi: 10,1371 /journal.pone.0013690
Redaktør: Juan Valcarcel, Centre de Regulació Genòmica, Spania
mottatt: 30 juni 2010; Godkjent: 07.10.2010; Publisert: 27 oktober 2010
Copyright: © 2010 Piekielko-Witkowska et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Arbeidet ble støttet av: den polske staten komité for Scientific Research Grants NN401354733 (til APW) og NN401073636 (til AN), og The Medical Centre of Postgraduate Education gi 501-2-25-01 /09 (til APW). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Nyrecellekarsinom (RCC) er den vanligste solide svulst i nyre og representerer ~3% av alle menneskelige kreftformer. Hvert år i Europa om lag 40 000 nye tilfeller av RCC er diagnostisert og ca 20 000 pasienter dør av sykdommen [1]. De aller fleste (80%) av RCC tilfeller histologisk klassifisert som tydelig celle nyrecellekarsinomer (ccRCC), med opprinnelse fra proksimale tubuli i nyrene. Den molekylære basis for ccRCC er ikke fullt ut forstått. Selv om det har vært foreslått flere molekylære markører, har ingen av dem vært godkjent for rutinemessig klinisk anvendelse [2].
En av de cellulære prosesser, ofte forstyrret i kreftformer, er alternativ spleising, er prosessen med selektiv fjerning av introner og sammenføyning av rest eksoner, hvor mRNA molekyler av forskjellige sekvenser blir produsert. Aberrant alternativ spleising kan føre til tumor transformasjon [3]. Nedsatt alternativ spleising av flere gener ble også rapportert i ccRCC. For eksempel, i vårt tidligere arbeid fant vi ccRCC spesifikke ubalansert uttrykk for type 1 iodothyroine deiodinase (DIØ1) spleisevarianter [4], [5] og uoversatt regioner av skjoldbruskkjertel hormon reseptor TRβ1 [6]. Flere andre rapporter som viser ccRCC-spesifikke forstyrrelser av alternativ spleising inkludere endringer i mRNA-prosessering av Mcl-en [7], TCF-4 [8], Survivin [9], og OGG1 [10]. Unormalt spleisede varianter av gener som er beskrevet ovenfor er sjelden effekter av mutasjonene i gener som koder for spleisede transkripter og kildene til forstyrrelser i alternativ spleising er vanligvis ikke kjent.
Alternativ spleising er en komplisert prosess, med et betydelig antall proteiner, inkludert spleise faktorer kalt serin-arginin rike proteiner (SR proteiner) [11]. Familien av SR-proteiner består av minst tyve medlemmer hvorav syv: SF2 /ASF (som kodes av genet: SFRS1), SC35 (gen: SFRS2), SRp20 (gen: SFRS3), SRp75 (gen: SFRS4), SRp40 (gen : SFRS5), SRp55 (SFRS6), og 9G8 (SFRS7) utgjør gruppen av «klassiske» SR proteiner. Disse faktorene binde til sekvenser som kalles spleise enhancers, som ligger i eksoner (eses, exonic spleise enhancers) eller i introner (ISES, intronic spleise enhancers). Binding av SR proteiner til spleise enhancers fremmer ekson inkludering. Skjøte Reaksjonen blir også regulert av et stort antall ikke-SR faktorer, slik som hnRNPs (heterogene atom ribonucleoproteins) som i det vesentlige bindes til sekvenser av skjøte lyddempere og virker som skjøte repressorer [12]. Dermed det endelige resultatet av alternativ spleising er en effekt av konserten handlingen av antagonistically opptrer spleise faktorer. Ett par av skjøte faktorer som oppviser motstående aktiviteter er SF2 /ASF (en SR-protein) og hnRNP A1 (heterogene atom ribonucleoprotein A1, et ikke-SR-protein) [13]. Overskudd av SF2 /ASF fremmer proksimale 5 «spleisesete utvalg mens av hnRNP A1 favoriserer distal 5» spleisesetet. Spesifikke medlemmer av SR familie kan også fungere antagonistically (f.eks SF2 /ASF og SRp20 [14], eller SF2 /ASF og SC35 [15]). Således relative nivåer av spesifikke skjøte faktorer bidrar til regulering av alternativ spleising, spesifikk for vevstype og utviklingsstadiet.
Det er kjent at forstyrrelser i alternativ spleising kan bidra til kreftutvikling på grunn av produksjon av tumor-undertrykkende eller onkogene varianter av genet transkripsjoner, påvirker spredning, cellemotilitet og apoptose mottakelighet [16]. Feilaktig skjøtes transkripsjon varianter kan også tjene som tumor biomarkører [17]. Den økende mengde bevis tyder på at spleise faktorer kan være direkte involvert i prosessen med kreftutvikling, fungerer som proto-onkogener [18] eller regulere skjøting og aktivitet av proto-onkogener [19], tumor suppressors [18] og apoptose regulatorer [20 ]. Forstyrret ekspresjon av spleise faktorer ble rapportert i flere typer kreft [11]. I vår siste papiret viste vi at uttrykket av to spleise faktorer, er SF2 /ASF og hnRNP A1 forstyrret i ccRCC [4], men så vidt vi vet uttrykket av spleise faktorer som gruppe aldri hadde blitt analysert i ccRCC.
i denne artikkelen hypotese vi at de observerte forstyrrelser av alternativ spleising i ccRCC kan være en konsekvens av endringer i ekspresjon av spleising faktorer, særlig av avvik av kvantitative forhold mellom dem. For å løse dette problemet, analyserte vi uttrykk for sju klassiske spleise faktorer: SF2 /ASF, SC35, SRp20, SRp75, SRp40, SRp55, 9G8 og en ikke-SR faktor, hnRNP A1. I tillegg til å undersøke konsekvensene av forstyrret ekspresjon av spleising faktorer, analyserte vi eksistens og ekspresjon av transkriptene av fem gener som er involvert i tumordannelse, som er kjent for å bli alternativt spleiset og delvis reguleres av de analyserte skjøte faktorer. Vi fant at uttrykket av spleise faktorer samt alternativ spleising av analyserte genene ble forstyrret i flertallet av analyserte vevsprøver. Vi konkluderer med at forstyrret uttrykk for skjøting av faktorer i ccRCC kan føre til nedsatt alternativ spleising av genene regulere tumorvekst og derfor bidrar til prosessen med kreftutvikling.
Materialer og metoder
Vevsprøver
Vevsprøver ble hentet fra ensidige nephrectomies utført på pasienter med klarcellet nyrecellekreft (38 pasienter) med tillatelse fra Etisk komité for menneske Studies (The Medical Centre of Postgraduate Education). Prøvene ble delt i to grupper: kreftvev (n = 38, T) og kontroll vev (sammenkoblet normalt vev fra den motsatte pol av den ondartede nyre med ingen histologiske tegn på svulst; n = 38, C). Clear celle nyrecellekreft ble diagnostisert med histologi i henhold til WHO-kriterier [21]. Svulster ble delt inn i tre grupper, avhengig av graden av differensiering. G1 (høyt differensiert) G2 (middels grad av differensiering), G3 (dårlig differensiert kreft)
RNA isolering
Total cellulært RNA ble isolert fra ~ 100 mg av frossen vev ved hjelp GeneMATRIX Universal RNA Purification Kit (EURx, Gdansk, Polen), i henhold til produsentens protokoll.
revers transkripsjon
600 ng av total RNA ble revers transkribert ved hjelp RevertAidTM H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas, Vilnius, Litauen) og oligo-dT primere henhold til produsentens protokoll. For etterfølgende PCR-analyse 1 ul av cDNA ble anvendt. For sanntid PCR reaksjoner en ul 5x fortynnet cDNA ble tatt.
PCR-analyse av alternativ spleising
PCR reaksjonen ble utført på en ul 5x fortynnet cDNA ved hjelp av Perpetual OptiTaq DNA Polymerase HOT START ( EURx, Gdansk, Polen) under forhold 95 ° C, 10 min. (Initial denaturering), etterfulgt av 35 sykluser: [95 ° C, 30 s; 58 ° C, 30 s; 72 ° C, 30 sekunder], endelig bruddforlengelse: 61 ° C, 10 min. Sekvenser av spesifikke primere (tabell S1) ble tatt fra de tidligere publiserte rapporter for: RON [19], caspase-9 [22], CEACAM-1 [23], Rac1 [24], og GLI1 [25]. PCR-produktene ble elektroforert i 1-2% agarosegel farget med etidiumbromid.
Real-time PCR
Semi-kvantitativ real-time PCR ble utført ved hjelp av LightCycler® 480 DNA SYBR Grønn jeg Master (Roche Diagnostics, Mannheim, Tyskland) i tre eksemplarer i henhold til produsentens protokoll. Sekvensen av primerne er vist i Tabell S2. Betingelser for real-time PCR var som følger: initial denaturering: 95 ° C, 10 minutter, 45 sykluser:. (95 ° C, 15 s, 57 ° C, 15 s; 72 ° C, 15 s); etterfulgt av smelting kurve analyse: (95 ° C, 5 min, 65 ° C, 1 min; kontinuerlig avlesning av fluorescens fra 65 ° C til 97 ° C med 0,11 ° C /s rampehastigheten og 5 kjøp pr hvert ° C). Resultater ble normalisert til uttrykk for 18sRNA host-genet
RN18S1
. Stabiliteten av ekspresjon av 18sRNA ble validert og bekreftet i innledende pre-analyse av 32 par av styre- og tumorprøver ved sammenligning med ACTB uttrykket (fig S1). De ACTB primere ble publisert andre steder [6].
Protein utvinning og Western blot analyse
For Western analyse, tolv representative par av tumor og kontrollprøver ble tatt. Vevsprøver ble homogenisert i en buffer inneholdende 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 50 mM Tris-HCl pH 8,0, protease inhibitor cocktail (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), og 0,5 mM PMSF. Homogenatet ble inkubert med risting i 2 timer ved 4 ° C og sentrifugert ved 12000 rpm i 20 min, ved 4 ° C. Den oppnådde supernatant ble anvendt for proteinkonsentrasjon analyse med Thermo Scientific Pierce BCA Protein Assay (Pierce Bioteknologi, Rockford, IL) i henhold til standardprotokollen. De proteinekstrakter ble delt inn i 30 mL alikvoter og lagret ved -70 ° C.
For SF2 /ASF Western blotting, ble 30 ug av proteinekstrakt oppløses ved 10% SDS-PAGE. Etter elektroforese ble proteinene overført til nitrocellulosemembraner som senere ble blokkert over natten ved 8 ° C i 5% ikke-fettmelk i TBS-T-buffer (10 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0,1% Tween-20, pH 7,6) . Membranene ble vasket tre ganger i TBS-T i 10 minutter ved RT, og inkubert over natten ved 8 ° C med anti-SF2 /ASF-antistoff fortynnet 1 (katt nr .: 32-4500, Invitrogen, Carlsbad, Ca.): 500 i TBS-T buffer med 5% fettfri melk. Etter vasking 3 ganger i 10 minutter med TBS-T, ble membranene inkubert i 1 time ved RT med pepperrot-peroksidase-konjugert geite-anti-muse-sekundært antistoff (1:10000, DakoCytomation, Glostrup, Danmark), og vasket 3 ganger i 10 min med TBS-T.
Western blotting av hnRNP A1 ble utført som for SF2 /ASF analyse ved hjelp av 15 mikrogram av protein ekstrakt og anti-hnRNP A1 antistoff (kat. nr .: ab10685, Abcam plc, Cambridge, UK).
Proteiner ble påvist ved en forbedret-kjemiluminescens påvisningssystem (Supersignal West Pico Chemiluminescent Substrate, Pierce Bioteknologi, Rockford, IL) i henhold til standardprosedyrer. Deretter ble membranene strippet, blokkert og inkubert med anti-actin β-antistoff (kat. Nr. Ab6276, Abcam plc, Cambridge, UK) fortynnet 1:10000 i TBS-T-buffer i 1 time ved romtemperatur, vasket tre ganger i TBS-T buffer og bearbeides videre som beskrevet for SF2 /ASF prosedyre.
Hvor mye spesifikt protein ble estimert densitometrically etter normalisering til uttrykk av β-aktin.
Tips for skjøting faktor bindende motiver
Analyse av CEACAM1 ekson 7 sekvensen ble utført med ESE finder programvare [26]. For prediksjon av SF2 /ASF bindingsseter ble to matriser brukes: «SF2 /ASF /IgM-BRCA1» og «SF2 /ASF». Disse to matriser ble utledet i annen sammenheng (forskjellige minigenes og størrelse på tilfeldig sekvens bibliotekene i SELEX [27]). Tersklene som brukes for prediksjon var: 1,956 (SF2 /ASF), 1,867 (SF2 /ASF /IgM-BRCA1), 2,383 (SC35), 2,670 (SRP40) og 2,676 (SRp55). Sekvensen av exon 7 ble avledet fra CEACAM1 transkript variant 1 (Acc. Nr. NM_001712.3).
Statistisk analyse
Shapiro-Wilk test ble anvendt for å bestemme normalitet av datadistribusjonssystem. Normalfordelte data ble analysert ved paret t-test og ikke-parametriske data ved Wilcoxon matchet parvis test.
p
0,05 ble ansett som statistisk signifikant. Visualisering av korrelasjonsmatrise ble gjort ved hjelp corrplot på R-plattformen [28].
Resultater
Den mRNA uttrykk for skjøting faktorer blir forstyrret i minst halvparten av ccRCC prøver
Skjøting faktorer som hører til gruppen av SR-proteiner består av et stort antall strukturelt og funksjonelt beslektede proteiner [11]. I vår studie har vi fokusert på den gruppen av «klassiske» SR proteiner, dvs. SF2 /ASF (kodet av genet: SFRS1), SC35 (SFRS2), SP20 (SFRS3), SRp75 (SFRS4), SRp40 (SFRS5), SRp55 (SFRS6 ), og 9G8 (SFRS7). Vi har også analysert ekspresjon av et ikke-SR skjøting faktor, hnRNP A1 som er generelt antatt å virke som antagonist til SR-proteiner.
Ved hjelp av sanntids-PCR vi funnet at mønsteret av ekspresjon av spleisefaktorene varierte mellom den enkelte pasient, så vel som mellom kontroll- og tumorprøver av en spesiell pasient. mRNA-ekspresjon av alle analyserte spleise faktorer ble forstyrret i omtrent 50-60% (avhengig av spleise faktor analysert) av tumorprøver, sammenlignet med koblede normale vev (fig. 1). Disse endringene uttrykks skyldtes ned- eller oppregulering av de analyserte genene, og tillater oss å dele alle tumorprøver i tre bassenger: D, U og N hvor uttrykket av gener ble nedregulert, oppregulert eller ikke endret, henholdsvis. Retningen av endringer korrelerte ikke med tumor grad av differensiering (Fig. 1a).
A. Endringer i uttrykket av bestemte par av kontroll- og tumorprøver. Diagrammet ble utført basert på data fra real-time PCR-analyse (figur S2). Fargene representerer uttrykk forholdet mellom kontroll- og tumorprøver. Grønn: downregulation i tumorprøver. Red: oppregulering i tumorprøver. Hvit: ingen forskjell i uttrykket nivåer. Tumor gradering (G1, G2, G3) vises. B. Fordelingen av endringer i mRNA-ekspresjonen av spleise faktorer. D: gruppe prøver med tumor-spesifikke nedregulering av uttrykk; U: gruppe prøver med tumor-spesifikke oppregulering av uttrykk; N: gruppe av prøver som ikke varierer i uttrykk mellom kontroll- og tumorprøver. Terskelen på 30% forskjell i uttrykk mellom kontroll- og tumorprøver ble brukt til å klassifisere prøvene.
Antall prøver i hvert basseng varierte fra n = 8 for D og n = 14 for U (for hnRNP A1) til n = 17 for D og n = 4 til U (for SRp40) (fig. 2). For flertallet av prøvene med endret uttrykk, basseng D var den mest tallrike (34-45% av alle analyserte prøvene). Det eneste unntaket var uttrykk for hnRNP A1 som ble nedregulert i bare 21% av prøvene og oppregulert i 37% av alle analyserte prøvene. Nedregulering av gener i bassenger D Over varierte fra 1,9 ganger (SRp20) til 2,6 ganger (SC35 annonse SRp75) sammenlignet med kontrollprøver. Gener i bassenger U ble oppregulert fra 1,4 ganger (9G8) til 2,4 ganger (SF2 /ASF) sammenlignet med kontrollprøver
Ekspresjon av hver skjøting faktor er vist i to grupper av prøver:. Med tumorspesifikt downregulation (D) (til venstre) og oppregulering (U) (til høyre). Terskelen 30% forskjell i ekspresjonen mellom kontroll- og tumorprøver ble anvendt for å klassifisere prøver. C: kontrollprøver, T: tumorprøver. Dataene er gitt som gjennomsnitt ± bred singlett .. Statistisk analyse ble utført ved anvendelse av paret t-test. * P 0,05; ** P 0,01; *** P. 0,001
Kvantitative relasjoner mellom spleise faktorene varierer mellom tumor og kontrollprøver
For å undersøke om endringer i uttrykket av skjøte faktorer er korrelert, analysert vi forholdstall mellom ekspresjonsnivåer av skjøte faktorer samt forholdene mellom spesifikke par av skjøte faktorer (fig. 3). Vi har funnet at mønsteret av korrelasjoner varierte mellom kontroll- og tumorprøver, med generell tendens til økt korrelasjonskoeffisienter i tumorprøver (fig. 3A). ble observert De sterkeste endringene i sammenheng for hnRNP A1. For eksempel var det ingen signifikant korrelasjon mellom hnRNP A1 og SRp20, hnRNP A1 og SRp75, og hnRNP A1 og 9G8 i kontrollprøver, mens i tumorprøver uttrykket av disse genene korrelerte signifikant. Også sammenhengen mellom SF2 /ASF og rest seks analyserte spleise faktorer var sterkere i tumorprøver.
A. Matrix viser korrelasjon koeffisienter mellom mRNA uttrykk av analyserte spleise faktorer. Tomten ble generert basert på Pearson korrelasjonskoeffisienter mellom uttrykk verdier av spleise faktorer. Pasient nummer 16 ble fjernet fra analysen på grunn av avvik fra normalfordeling. For SC35 (gen: SFRS2) Spearman nonparametric korrelasjon ble brukt som data ikke var normalfordelt i denne gruppen. Verdiene av Pearson eller Spearman r er gitt nedenfor den punktdiagrammet. Spleise faktorer «genet navn i parentes. P 0,05 ble ansett som statistisk signifikant. B. mRNA uttrykk forholdstall på spleise faktorer som er kjent for å opptre antagonistically. Dataene er gitt som gjennomsnitt ± S.E. (For SF2 /ASF: hnRNP A1 og hnRNP A1: SC35) eller som medianverdier og 95% KI (for SC35: SRp55 som data ble ikke normalfordelt i denne gruppen). Statistisk analyse ble utført med paret t-test (for for SF2 /ASF: hnRNP A1 og hnRNP A1: SC35) eller Wilcoxon parret test (for SC35: SRp55). . N = 37 for C, n = 37 til T, ** p 0,01
Det er par av skjøte faktorer som er kjent for å virke antagonistisk [13] – [15], [29] . Derfor analyserte vi prosenter av følgende spesifikke spleise faktorer: SF2 /ASF: hnRNP A1, SF2 /ASF: SRp20, SF2 /ASF: SC35, SRp40: SRp55, SC35: SRp55, og hnRNP A1: SC35. Vi fant at for de tre parene med skjøting faktorer forholdene skilte seg vesentlig i tumorprøver sammenlignet med kontrollprøver (Fig. 3B). Den SF2 /ASF: hnRNP A1 forholdet ble redusert i tumorprøver med ca 26% (1,07 ± 0,06 S.E. for C vs 0,78 ± 0,06 S.E. for T, p = 0,0022). Forholdet SC35: SRp55 ble øket i tumorprøver med ca. 40% (median 1,12, område 0,60 til 5,91 for C, median 1,57, område 0,59 til 12,29 for T; p = 0,0073). For forholdet hnRNP A1: SC35 var det en liten (15,3%), men statistisk signifikant økning i svulster i forhold til kontrollprøver (0,77 ± 0,05 SE for C vs 0,89 ± 0,064 SE for T, p = 0,0197)
protein~~POS=TRUNC uttrykk for SF2 /ASF og hnRNP A1 blir forstyrret i ccRCC
for å sjekke om endringer i mRNA nivå resultat i samtidige forstyrrelser av protein uttrykk vi utført Western blot analyse av to spleise faktorer, SF2 /ASF og hnRNP A1 på tolv representative par av styre- og tumorprøver (fig. 4). Ja, vi fant betydelige forskjeller mellom protein nivåer av spleise faktorer i kontroll- og tumorprøver. Tilsvarende som i tilfelle av mRNA-analyse, var endringene variabel, men ikke korrelerer med mRNA uttrykk. I flertallet av analyserte sammenkoblede vevsprøver uttrykk for skjøting faktor ble redusert i prøvene T i forhold til prøvene C (SF2 /ASF: 9 parene; hnRNP A1: 8 par).
Kreft grader av differensiering vises ( G1, G2, G3). Western blot av SF2 /ASF (A) og hnRNP A1 (B) ble anvendt for semikvantitativ analyse av proteinbånd etter normalisering til p-aktin. Grå stolper representerer kontrollprøver. Svarte striper representerer tumorprøver.
I flere eksempler ekstra eller skiftet band var synlige, spesielt i blot av SF2 /ASF (fig. 4A). Et slikt bilde er karakteristisk for annerledes fosforylerte molekyler av SF2 /ASF protein [30].
Alternativ spleising av gener som er involvert i tumordannelse og regulert av spleise faktorer blir forstyrret i ccRCC
SF2 /ASF regulerer alternativ spleising av et betydelig antall gener, inkludert RON proto-onkogen [19], apoptose regulator Caspase-9 [22], og Rac1, et medlem av Ras-familien av proto-onkogener (regulert av SF2 /ASF og SRp20) [14 ]. For å undersøke hvorvidt forandringer i mengder på skjøte faktorer blir fulgt av forandringer i alternativ behandling av målgener, analyserte vi deres skjøtemønster (fig. 5). Videre analyserte vi spleising profiler av ytterligere to gener:. GLI1 onkogen [25] og CEACAM1 tumor suppressor [23] som forstyrret spleising er kjent for å bidra til tumorprogresjon
A. PCR-analyse av alternative spleise mønstre i tolv par av kontroll (C) og vevsprøver tumor (T). 1) RON; 2) CEACAM-1; 3) Rac1; 4) Caspase-9; 5) GLI1. Posisjonene til primerne anvendt for PCR er vist i forhold til eksoner. Alternativt spleisede eksoner er skyggelagt. Graderingen av tumor differensiering er vist (G1, G2, G3). B. Diagram som viser ekspresjons forhold mellom spleisevarianter som bestemt ved densitometrisk analyse av elektroforese av PCR-produkter. Merk forskjellige akseskalaer. Grå stolper representerer kontrollprøver. Svarte striper representerer tumorprøver.
Vi har funnet at nivåene av ulike spleisevarianter av analyserte genene varierte mellom de fleste av de tolv analysert par av kontroll og tumorprøver der protein nivå av SF2 /ASF og hnRNP A1 ble analysert (fig. 5B). Uttrykk for RON proto-onkogen spleise varianter Ron og ΔRon skilte mellom prøver av spesifikke graderinger av differensiering. I alle G3 tumorprøver forholdet ΔRon /Ron var høyere enn i sammenkoblede kontrollprøver. I prøver G1 tumor-spesifikt forhold ΔRon /Ron var høyere eller lik i forhold til kontrollprøvene. I prøver tatt fra pasient nummer 13 begge isoformer var fraværende i tumor og kontrollprøver. I tumorprøver som er klassifisert som G2 forholdet ΔRon /Ron var variabel: i to tumorprøver var det samme som i sammenkoblet kontroller, i en prøve var det høyere enn i paret kontroll, og i en prøve var det lavere enn i sammenkoblet kontroll. Spleise mønstre av CEACAM1 ikke avhenge av differensiering karakteren av tumorprøve. I sju prøve parene forholdet CEACAM1-S /CEACAM1-L var høyere i svulster enn i kontrollprøver. I to prøve par CEACAM1-S ble ikke oppdaget. Spleising mønster av Rac1 var lik i flertallet av analyserte prøver. Forholdet Rac1b /Rac1 var høyere i kontrollprøvene enn i sammenkoblede svulster i elleve av analyserte vev par. Sju av analyserte prøven parene avdekket høyere andel av caspase-9b /Caspase-9a i tumorer enn i kontrollprøver uavhengig av differensierings karakterer. Spleising mønster av GLI1 var den mest variabel. Forholdet mellom GLI1-FL /GLI1-Sn i syv tumorprøver var høyere enn i sammenkoblede kontroller. I to par prøver var det ingen forskjeller mellom prosenter av analyserte spleisevarianter; men flere band var synlige, noe som tyder på tilstedeværelsen av ikke identifiserte spleisevarianter.
For å finne mulig sammenheng mellom endringer i uttrykket av SF2 /ASF og skjøting av SF2 /ASF-regulerte gener utførte vi Pearson korrelasjonsanalyse mellom ekspresjon av spleise faktorer, og målet ekson spleise (fig. 6). Positiv korrelasjon (r = 0,6915, p = 0,0127) mellom Caspase-9a og SF2 /ASF-protein ble observert i tumor, men ikke i kontrollprøvene (r = 0,004644, p = 0,9886). Vi har også funnet en positiv korrelasjon (r = 0,6187, p = 0,0320) mellom CEACAM1-L og SF2 /ASF protein i tumorer, men ikke i kontrollprøvene (r = 0,4482, p = 0,1439). Vi fant ingen sammenheng mellom uttrykk for SF2 /ASF (eller hnRNP A1) proteiner og spleise varianter av Ron, Rac1 eller GLI-en (data ikke vist).
Ble utført
Pearson korrelasjonsanalyse på data fra tolv par av kontroll- og tumor vevsprøver. P . 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Selv om det er kjent at SF2 /ASF regulerer skjøting av caspase-9 [22], er det ingen data som viser at CEACAM1-L er et mål for SF2 /ASF eller av andre spleise faktorer. Imidlertid ble det funnet at exon 7 av CEACAM1 inneholder cis-virkende regulatoriske elementer skjøte [23]. Derfor analyserte vi sekvensen av CEACAM1 exon 7 ved hjelp av matriser for prediksjon sekvenser som er nødvendig for binding av spleising faktorer SF2 /ASF, SC35, SRp40 OG SRp55 (fig. 7). Denne analysen avdekket flere high-score motiver for SF2 /ASF, to motiver for SC35, tre motivene for SRp40, og ett motiv for SRP55.
Prediksjon av motivene ble utført med ESE Finder programvare [26] ved hjelp av matriser for prediksjon av sekvenser som er nødvendig for binding av spleise faktorer. For prediksjon av SF2 /ASF bindingsseter ble to matriser brukes: «SF2 /ASF /IgM-BRCA1» (hvite søyler) og «SF2 /ASF» (grå søyler). Disse to matriser ble utledet i annen sammenheng (forskjellige minigenes og størrelse på tilfeldig sekvens bibliotekene i SELEX [27]). Bare high-score motiver over terskler for SF2 /ASF (1,956), SF2 /ASF /IgM-BRCA1 (1,867), SC35 (2,383), SRP40 (2,670), og SRp55 (2,676) er vist. Nukleotidsekvensen CEACAM1 ekson 7 er gitt på x-aksen.
Diskusjoner
I denne artikkelen viser vi at mRNA uttrykk for åtte spleise faktorer blir forstyrret i ccRCC. Proteinet ekspresjon av to spleise faktorer, som er kjent for å virke antagonistisk er SF2 /ASF og hnRNP A1 også forstyrret. Disse avvik er ledsaget av nedsatt alternativ spleising av SF2 /ASF avhengige gener, RON, caspase-9, og Rac1. Tumor-spesifikke forstyrrelser av alternativ spleising ble også funnet for GLI1 onkogen og CEACAM1 tumor suppressor.
Endringer i pre-mRNA spleising er et vanlig fenomen i menneske maligniteter. I henhold til våre funn improperties i ekspresjon av spleise faktorer opptrer i minst halvparten (50-60%) av analyserte prøver, selv om de er forskjellige forstyrrelser og resultat fra både opp- og nedregulering av skjøte faktorer (fig. 1 og 2). Retningen av endringer er ikke spesifikk for tumor graderinger av differensiering ettersom både opp- og nedregulering ble observert i alle graderinger. Det er bemerkelsesverdig at selv om de fleste av publikasjonene viser til tumor-spesifikk økning av spleising faktorer uttrykk, er den prosentandel av prøver hvor den forstyrrede ekspresjon forekommer sjelden vist. Karni et al. [18] rapporterte at blant 50 analyserte prøver ccRCC mer enn 2-ganger overekspresjon av SF2 /ASF-mRNA ble observert i løpet av mindre enn 5% av prøvene. Ifølge vår analyse prosentandelen av prøver med mer enn 2-ganger overekspresjon var litt høyere (8%), men denne forskjell kan være resultatet av forholdsvis lite antall analyserte prøver.
Interessant nok har vi funnet at mønstre av mRNA og protein ekspresjon av spleisefaktorene varierte mellom individuelle pasienter og også mellom kontroll og tumorprøver av en gitt pasient. Dette er i samsvar med vår forrige undersøkelse viser tumor-spesifikke og pasient-spesifikke skjøting mønstre av type 1 iodothyronine deiodinase [4] og med andre studier, som viser at ccRCC er preget av molekylær heterogenitet og kan deles inn i genuttrykk undergrupper [31] – [33]. I studiet av Zhao et al. [33] De uttrykk undergrupper korrelert med overlevelse etter operasjonen, men på samme måte som i vår studie, ikke korrelerer med tumor karakterer. Dessverre, i tilfelle vår studie pasientene ikke ble fulgt opp slik at det ikke er mulig å analysere eventuelle sammenhenger mellom uttrykk profiler og pasienter overlevelse. Klein et al. [34] analysert enkeltgjenværende tumorceller fra flere typer tumorer (men ikke fra nyre opprinnelse) og funnet høye heterogenitet av genekspresjon mellom visse kreftceller. Disse cellene ble heterogen uavhengig av om de oppholdt seg i samme rom eller innenfor ulike områder homing. Pasientspesifikk variasjon i gen-ekspresjon ble også rapportert for brystkreft og prostatakreft [35], [36]
Denne genekspresjon variasjonen er et interessant problem, og i det minste to mulige opprinnelse bør vurderes.: At variasjonene reflektere svulsten spesifisitet, eller at de reflekterer pasientens individuelle funksjoner som resulterer i et bestemt bilde av genekspresjon i tumor. Den første situasjonen ble beskrevet for leverkreft som separate svulster fra en enkelt pasient viste dramatiske forskjeller i genuttrykk mønstre [37]. På den annen side, Perou et al. [35] rapporterte at genuttrykksmønster av forskjellige brysttumorprøver som er tatt fra en pasient var mer lik hverandre enn for prøver tatt fra andre pasienter. Det er ikke klart hvilken situasjon gjelder vår studie som analyserte vi enkeltprøver per pasient. Som vi nylig har imidlertid vist ccRCC svulster kan også avsløre mer homogene genuttrykksmønster [6]. I den studien der vi brukte delvis det samme materialet som i denne artikkelen, fant vi svært konsekvent ccRCC tumor spesifikke forstyrrelser i skjoldbruskkjertel hormon pathway: redusert skjoldbruskkjertel hormon reseptor β1 (TRβ1) mRNA og protein, tap av type 1 iodothyonine deiodinase protein og senket nivå av skjoldbruskkjertel hormon, trijodtyronin (T3).
