Abstract
microRNAs (mirnas) spiller viktige roller i utviklingen av kreft. Ved kloning og sekvensering av en HPV16
+ CaSki celle små RNA bibliotek, isolert vi 174 mirnas (inkludert romanen MIR-193C) som kan grupperes i 46 ulike miRNA arter, med MIR-21, MIR-24, speil 27a, og MIR-205 er mest tallrike. Vi har valgt for videre studier 10 mirnas i henhold til deres kloning frekvens og tilhørende deres nivåer i 10 cervical kreft-eller cervikal intraepitelial neoplasi-avledede cellelinjer. Ingen korrelasjon ble observert mellom deres ekspresjon med tilstedeværelse eller fravær av en integrert eller episomal HPV-genomet. Alle cellelinjer undersøkt inneholdt ingen påvisbare Mir-143 og MIR-145. HPV-infisert cellelinjer uttrykte et annet sett med mirnas når dyrket i organotypic flåte kultivert i forhold til monolayer cellekultur, blant annet uttrykk for MIR-143 og MIR-145. Dette tyder på en sammenheng mellom miRNA uttrykk og vev differensiering. Ved hjelp av miRNA rekke analyser for alderstilpassede normal livmorhalsen og livmorhalskreft vev, i kombinasjon med nord blot verifisering, identifiserte vi betydelig deregulerte mirnas i livmorhalskreft vev, med MIR-126, MIR-143, og MIR-145 downregulation og Mir-15b , MIR-16, MIR-146a, og MIR-155 oppregulering. Funksjonelle studier viste at både MIR-143 og MIR-145 er undertrykkende for cellevekst. Når det innføres i cellelinjer, ble MIR-146a funnet å fremme celleproliferasjon. Samlet våre data tyder på at nedregulering av MIR-143 og MIR-145 og oppregulering av MIR-146a spille en rolle i livmorhalskreft
Citation. Wang X, Tang S, Le SY, Lu R, Rader JS , Meyers C, et al. (2008) Aberrant Uttrykk for onkogene og tumor-undertrykkende microRNAs i Livmorhalskreft er nødvendig for veksten av kreft celler. PLoS ONE 3 (7): e2557. doi: 10,1371 /journal.pone.0002557
Redaktør: Dong-Yan Jin, University of Hong Kong, Kina
mottatt: 10 april 2008; Godkjent: 13 mai 2008; Publisert: 02.07.2008
Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Public Domain erklæring som fastslår at en gang plassert i det offentlige rom, dette arbeidet kan fritt kopieres, distribueres, overføres, endres, bygd på, eller brukes av alle for ethvert lovlig formål
Finansiering:. Denne forskningen ble støttet av egenutført Research Program fra NIH, National Cancer Institute, Senter for kreftforskning og ved NIH tilskudd CA 94141 og CA 95713to JSR og CA 79006 til CM
Konkurrerende interesser:. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Livmorhalskreft er en av de vanligste kreftformene hos kvinner over hele verden, med en estimert global forekomst av 470.000 nye tilfeller og ca 233 000 dødsfall per år [1], [2]. Livmorhalskreft er den ledende dødsårsaken av kreft i mange lavt ressurs land hvor utbredt screening av livmorhals cytologi er utilgjengelig. Forekomsten er lavere i utviklede land som følge av livmorhalsscreening og av pågående aktive helse utdanningsprogram. Cervical kreft priser i USA ble estimert som 10,370 nye tilfeller og 3,710 dødsfall i 2006 [3]. Årsakssammenheng mellom høyrisiko HPV (HR-HPV) infeksjon og livmorhalskreft har blitt godt dokumentert i epidemiologiske og funksjonelle studier. Høy risiko HPV, som HPV16, HPV18 og HPV31, er påvist i opptil 99,7% av livmorhals plateepitelkarsinom og 94% -100% av livmorhals adenovirus og adenosquamous karsinom [4], [5]. De høyrisiko HPV teinene, E6 og E7, bidra til livmorhalskreftutvikling ved å inaktivere mobil svulst p53 og pRb henholdsvis [6] -. [8]
mirnas er regulatoriske, ikke-kodende RNA om 21-23 nukleotider i lengde og er uttrykt ved bestemte faser av utvikling vev eller celledifferensiering, og ha store virkninger på ekspresjonen av en rekke gener på det post-transkripsjonelle nivå. Gjennom baseparring med sitt målrettede mRNA, induserer en miRNA RNA-degradering eller translasjonelle undertrykkelse av den målrettede transkripter [9], [10]. Cellular mirnas er transkribert av RNA polymerase II som lange, avkortet, polyadenylert primære miRNA (pri-miRNA) transkripsjoner bærer en stilk-løkke hårnål strukturen ~80-nts [11]. Eldre mirnas skyldes behandlingen av pri-miRNAs i to sekvensielle cleavage trinn formidlet av to RNase III enzymer, drosha og dicer [12]. Drosha, i kompleks med DGCR8, spalter pri-miRNA ved en spesifisert avstand (ca. 11 bp) fra stamme-enkelt-trådet RNA knutepunkt i kjernen for å gi en forhånds miRNA av en -60-nt hårnål med en 2-nt 3 «overhenget [13], [14]. Etter pre-miRNA blir eksportert til cytoplasma av exportin 5 [15], [16], er det da gjenkjent av dicer, i kompleks med dsRBD-inneholdende partner HIV-1 TAR RNA-bindende protein (TRBP) [17], for å fjerne terminalsløyfen, og etterlater en andre to-nt 3 «overhenget [18]. De resulterende 21- til 23-nt miRNA produkter inneholder en 2-nt 3 «overheng i hver tråd, og fungere som funksjonelle mellom av RNAi som direkte mRNA cleavage og translasjonell demping. Selv om deres biologiske funksjoner fortsatt i stor grad ukjent, nyere studier tyder på at mirnas bidra til utvikling av ulike kreftformer [19] og kan fungere som en viktig komponent i celle naturlige forsvar mot virusinfeksjon [20] – [22]. Det er blitt foreslått at et unikt miRNA uttrykk profil for en bestemt kreft ville være et nyttig biomarkør for kreftdiagnostikk [23] og prognose [24]. I denne studien brukte vi ulike tilnærminger til å profilere miRNA uttrykket fra livmorhalskreft vev og livmorhalskreft cellelinjer utvunnet samt fra HPV-smittet vaginal keratinocytter. Vi viser at en undergruppe av miRNAs er betydelig dysregulerte i livmorhalskreft og pre-neoplastiske lesjoner.
Resultater
miRNA uttrykk profil i livmorhalskreftcellelinjer
For å undersøke uttrykket profiler av mirnas i livmorhalskreftceller, isolert vi total celle RNA fra livmorhalskreft-avledet CaSki C-2 celler, som inneholder ca. 500 eksemplarer av HPV16 genom per celle. Den fraksjonerte RNA med størrelser på 15-30 nts ble klonet og sekvensert på grunnlag av en protokoll som er publisert [25]. Samlet vi klonet totalt 174 mirnas fra 363 cDNA kloner som ble kategorisert i 46 ulike miRNA arter (tabell 1), med MIR-21, MIR-24, MIR-27a, og MIR-205 er mest tallrike. Ingen HPV16-avledet miRNA ble klonet i denne screening, alle mirnas var cellulære. Interessant nok har vi funnet at noen kopier av den klonede MIR-21 og MIR-205 hadde heterogen 3′-ender, med en ekstra C-nukleotid i 3′-enden av 68% av MIR-21 eksemplarer og en ekstra U på 3′- ende av 33% av MIR-205 kopier, antagelig stammer fra slingre fordøyelse av pre-mirnas ved dicer (fig. 1). I tillegg en ny underart av MIR-193, MIR-193C (GenBank tilgangsnummer: EF100863), ble identifisert tre ganger fra screening og ble bekreftet av det nordlige blotting. Mir-193C underarter skiller seg fra MIR-193b av en nukleotid i posisjon nt 21 og av mangel på tre oss på 3 «enden (MIR-193b, 5′-aacuggcccucaaagucccgcuuu-3′; MIR-193C, 5»-aacuggcccucaaagucccga -3 «). Uttrykket profil av den nylig identifiserte MIR-193C som er 3-nt mindre enn MIR-193b var lik den for MIR-21 i HeLa-celler og 293-celler, men mindre tallrike enn MIR-27a. HeLa og 293 celler produseres uten påvisbare Mir-205 som en dublett som sett i CaSki celler (fig. 2A).
Piler over pre-miRNA indikere vingle-fordøyelse steder på pre-MIR-21 i A og pre-MIR-205 i B, produsere produkter med ytterligere nukleotider på 3′-enden. Sekvensene vist i rødt tilsvarer modne miRNA mens det som er vist i svart er den delen av pre-miRNA som fjernes under behandlingen.
A. MIR-193C uttrykk i CaSki, HeLa, og 293 celler. CaSki og dets subkloner C-V og C-2 celler [72] ble sammenlignet med HeLa (HPV18
+) og 293 celler (HPV
-) for uttrykk av MIR-193C ved nordblotting. Total RNA (30 ug) fra CaSki, HeLa, og 293-celler ble separert i en 15% denaturerende polyakrylamidgel, blottet på et Gene Screen-Plus membran, og deretter probet separat med en følelse (e) eller et antisense (as) MIR -193c sonde. Deretter ble membranen reprobed med antisens prober for MIR-21, henholdsvis MIR-27a, MIR-205, eller U6,. B. miRNA uttrykket i livmorhalskreft cellelinjer utvunnet. Totalt celle-RNA (30 ug) ble ekstrahert fra forskjellige cellelinjer med eller uten HPV-infeksjon. Northern blotting ble brukt til å undersøke uttrykket av 10 mirnas fra åtte kreftcellelinjer, to W12 celle subkloner, HaCaT celler, normal livmorhals og livmorhalskreft vev (Ambion). C. nedregulering av MIR-143 i livmorhalskreft vev. Total RNA fra to par av normal (NT) cervix vs livmorhalskreft (Ca) vev fra kliniske prøver og ett par av normal livmorhalsen og livmorhalskreft innkjøpt fra Ambion ble sammenlignet for ekspresjon av MIR-143 ved Northern blotting. U6 ble også strøket som en intern kontroll for utvalg lasting i panel A, B og C.
Basert på disse kloning resultater, vi videre vist flere tilgjengelige livmorhalskreft cellelinjer med eller uten HPV-infeksjon ved nordblotting for uttrykket av 8 mirnas med relativt høy kloning frekvens og 2 mirnas (MIR-143 og MIR-145) som ikke ble isolert i vår kloning (tabell 1). Åtte livmorhalskreft cellelinjer; to isolater av W12 cellelinje (20861 med integrerte HPV16 genomer og 20863 med episomal HPV16 genomer) opprinnelig isolert fra en livmorhalsen (CIN) biopsi vev [26] og HaCaT celler (en udødelig HPV-negative hud keratinocyte linje) [27 ] ble undersøkt for ekspresjon av de 10 miRNAs. En sammenkoblet total RNA fra livmorhalskreft og tilstøtende normale cervical vev kommersielt hentet fra Ambion ble også sammenlignet. Alle cellelinjer og livmorhalskreft vev viste en lignende miRNA uttrykk profil. Dette miRNA profilen skilte seg fra normale cervical vev med redusert uttrykk av MIR-27a, MIR-143, og MIR-145 (Fig. 2B). I motsetning til dette livmorhalskreft vev og cellelinjer, unntatt Siha (HPV16
+), HeLa (HPV18
+), og C33A-celler (HPV
-) hadde økt ekspresjon av MIR-205 når sammenlignet med normalt vev i livmor (fig. 2B). Siha, HeLa, og C33A celler har ingen uttrykk av MIR-205. I alle cellelinjer, ekspresjon av MIR-143 og -145 var mindre enn det som ble observert i livmorhalskreft vev. Til tross for tilstedeværelsen av noen forskjeller i uttrykket av individuelle miRNA fra en cellelinje til en annen, var vi ikke i stand til å angi et uttrykk profil av de oppdagede miRNAs i sammenheng med tilstedeværelsen av integrerte eller episomale HPV genomer. Den nedregulering av MIR-143, som er avledet fra den samme miRNA forløper fra MIR-145 [28], ble ytterligere bekreftet å være kreftspesifikke ved å sammenligne dets ekspresjon i livmorhalskreft vev til normal cervix (Fig. 2C).
miRNA ekspresjonsprofilen i normale og cancerøse vev i livmor
Siden våre kloning tilnærmingen har en begrensning i isolering av lave rikelig mirnas og northern blotting er begrenset av sonden valgt, kan de to metodene ikke bli best å skjelne en forskjell fra en cellelinje til en annen i miRNA uttrykk profil. For ytterligere å undersøke om mirnas er forskjellig uttrykt i livmorhalskreft vev, samlet vi fem par alderstilpassede normale og kreft cervical vev og sammenlignet deres uttrykk profiler ved hjelp av en miRNA rekke analyse inneholder 455 miRNAs. Bare fire eksempel par kvalifiseringen clustering analyse som bestemmes av prøven konsistens analyser. Et uttrykk overflod analyse, basert på et signal tetthet ≥20,000, viste at både normale og cancerøse vev i livmorhalsen hadde rikelig ekspresjon av MIR-23a, MIR-23b, la-7a, la-7c, og la-7d, mens høy ekspresjon av MIR-26a, MIR-29a, MIR-99a, MIR-100, MIR-125b, MIR-143, MIR-145, miR195, og MIR-199A ble kun observert hos normale cervical vev, og høy uttrykk for MIR-16, MIR-21, MIR-205, og la-7f ble bare observert i livmorhalskreft vev, til tross for at relativt lave nivåer av MIR-16 og MIR-21 ble lagt merke til av en homogen cellepopulasjon i enkelte cellelinjer (fig. 2B). Uttrykk av MIR-143 og MIR-145 viste mer enn 2,7 ganger reduksjon i livmorhalskreft vev. Ved hjelp av en gruppering analyse, observerte vi en betydelig økt uttrykk av 18 miRNAs i livmorhalskreft og 15 mirnas i normal cervix (P 0,05, t-test) (figur 3A, mirnas i rød farge.). For verifisering, ble et sett av utvalgte miRNA sonder brukes til å utføre en northern blot-analyse for to normale og kreft to prøver. Vi var i stand til å bekrefte at kreftvev hadde redusert uttrykk av MIR-126 og MIR-424, og økt uttrykk av MIR-15b, MIR-16, MIR-146a, MIR-155, og MIR-223 (Fig. 3B og 3C), etter individuell miRNA nivå i hver prøve ble kvantifisert og normalisert til U6 uttrykk.
Total RNA (5 mikrogram) isolert fra alderstilpassede normale cervical vev (NT) og livmorhalskreft vev (CA) ble analysert av miRNA rekke analyse. Den kreftvev 1, 3 og 5 ble infisert med HPV16 og kreftvev 4 ble infisert med HPV45. A. En gruppering grafen ble opprettet ved hjelp av en hierarkisk metode fra de mirnas med signal tetthet på mer enn 1000 og viser økt (rød) eller redusert (grønn) uttrykk (P 0,05) av individuelle miRNA fra fire alders matchet normal og kreft i livmor vev (Tabell S1). kolonneoverskriften angir enkelte eksempelkode i analysen. Hver rad viser uttrykk mønster av individuelle miRNA som log2-transformert uttrykk forhold, med de mest nært beslektet uttrykk sammen med en gren og gruppert med et gjennomsnitt bundet algoritme. Avdelings lengder reflektere grad av likhet mellom miRNA uttrykk mønstre. Fargeskala på toppen av panelet representerer graden av ekspresjon basert på en kalibrert forhold. Grønn betyr lavere ekspresjon sammenlignet med den midlere (null), indikerer sort uttrykk lik middelverdien, og rødt indikerer høyere ekspresjon i forhold til gjennomsnittet. B. Verifisering av miRNA uttrykket profil ved Nord-blotting. Totalt celle-RNA (30 ug) isolert fra hvert vev ble probet med individuell antisense-oligonukleotidet til hver indikert miRNA. En ekstra bånd i hver blot indikerer en slingre produkt fra dicer fordøyelsen. C. Bar grafene viser de relative nivåer av de undersøkte mirnas normalisert til U6 RNA i hvert vev i panel B.
miRNA uttrykk profil i HPV-smittet, keratinocytt-avledet flåten vev
for å undersøke om de observerte miRNA signaturer i livmorhalskreft vev er spesifikke for livmorhalskreft, undersøkte vi miRNA uttrykk i pre-neoplastiske lesjoner. Mangelen på konvensjonelle cellekulturer for HPV multiplikasjon har i stor grad hindret vår forståelse av HPV livssyklus og patogenese. Imidlertid har infeksjons HPV blitt produsert fra raft kulturer avledet fra humane keratinocytter [29], [30] og induksjon av pre-neoplastiske lesjoner i flåten vev ved HPV-infeksjon med morfologi lik den til cervikal intraepitelial neoplasi [31] som gjør denne system av stor fordel for våre studier. Ved hjelp av miRNA rekke analyser, vi sammenlignet uttrykket profiler av 455 menneske mirnas i HPV18-infisert primære humane vaginal keratinocytter (HVKs) i monolagskulturer og i stratifiserte og differensierte flåten vev. Et uttrykk overflod analyse, basert på et signal tetthet ≥20,000, viste at MIR-21, MIR-23a, MIR-23b, MIR-26a, MIR-205, la-7c, og la-7f rikelig uttrykt i HVKs både i mono kulturer og flåte kulturer. Tre mirnas rikelig uttrykt bare i monolagkulturer (MIR-24, MIR-29A, og MIR-221) og 11 mirnas rikelig uttrykt bare i lagdelte og differensierte flåte kulturer (MIR-27a, MIR-27b, MIR-200b, speil 200c, MIR-203, MIR-638, la-7a, la-7b, la-7d, la-7e, og la 7g). Ved hjelp av en gruppering analyse, vi videre fastslått at 16 mirnas ble oppregulert (fig. 4A, flåte i rødt) og 25 mirnas ble nedregulert (fig. 4A, flåte i grønt) i flåten kulturene sammenlignet med uttrykket nivåer i den tilsvarende monolaget kulturer (P 0,05, t-test). For å bekrefte observasjonene ble parede prøver analysert for miRNA uttrykk ved Nord-blotting ved hjelp av et sett av spesifikke miRNA sonder (Fig. 4B og 4C). Kvantifisering av hvert miRNA nivå i hver prøve ble normalisert til U6 uttrykk. Vi bekreftet at uttrykket av MIR-26b, MIR-195, og MIR-200c ble økt i flåten kulturer, men uttrykket av MIR-143 og MIR-145 ble redusert (Fig. 4B og 4C). Den økte overflod av MIR-200c som viser 67% mer uttrykk i flåter enn i monolag (P 0,08) ved å rekke analyse ble bekreftet av det nordlige blotting. Selv om oppregulering av MIR-15a og MIR-223 og nedregulering av MIR-218 og MIR-424 ble observert både i flåtene (pre-neoplastiske lesjoner) og livmorhalskreft vev, de fleste av miRNA uttrykket signaturer viste ingen sammenheng mellom to vev (se fig. 4A til fig. 3A). Imidlertid nedregulering av MIR-146a ble lagt merke til i flåten kulturer i stedet for oppregulering sett i livmorhalskreft vev og ble ytterligere bekreftet ved Northern-blotting (fig. 5), noe som indikerer at oppregulering av MIR-146a uttrykk er livmorhalskreft-spesifikke. I motsetning til dette ble en liten økning i ekspresjon av MIR-21 og MIR-26b observert både i pre-neoplastiske lesjoner (HPV-infisert flåter) og livmorhalskreft vev og således deres ekspresjon synes ikke cancer-spesifikke (fig. 5).
Raft vev (kulturer) med HPV18 infeksjon ble avledet fra menneskelige vaginale keratinocytter (HVKs) i monolagskulturer med HPV18 DNA transfeksjon. Totalt celle RNA (5 mikrogram hver) hentet fra hver type celler ble sammenlignet i parallell for miRNA uttrykket med miRNA rekke analyser. A. En gruppering grafen ble skapt av en hierarkisk metode fra disse mirnas med et signal tetthet på mer enn 1000 hentet fra tre uavhengige transfections i hver gruppe (tabell S2). Grafen viser redusert (grønn) eller økt (rød) uttrykk (p 0,05) av individuelle mirnas fra udifferensierte HVKs i monolag (mono) versus stratifisert og differensierte HVKs i flåter. Se andre detaljer i fig. 3A. B. Verifisering av miRNA uttrykk fra udifferensierte HVKs i monolag og stratifisert og differensierte HVKs i flåter av nordblotting. Totalt celle RNA (30 mikrogram hver) isolert fra differensierte eller udifferensierte HVKs ble undersøkt med utvalgte miRNA sonder. C. Bar grafene viser de relative nivåer av de undersøkte mirnas normalisert til U6 RNA i hver prøve i panel B. M = enlagskultur, R = flåte.
A. Totalt RNA fra HVKs i to flåter og to monolags (mono) kulturer ble sammenlignet med to livmorhalskreft (Ca) vev for uttrykk av MIR-146a av nordblotting. Uttrykket nivåer av MIR-21 og Mir-26b ble undersøkt som miRNA kontroller. Liten atom RNA U6 ble også strøket som en intern kontroll for utvalg lasting. B. Bar grafene viser de relative nivåer av de undersøkte mirnas normalisert til U6 RNA i hver prøve i panel A. M = enlagskultur, R = flåte.
Redusert MIR-143 og MIR-145 i livmorhalskreft og livmorhalskreft er undertrykkende i livmorhalskreft cellevekst
Etter å ha vist en betydelig nedregulering av MIR-143 og MIR-145 i livmorhalskreft og pre-neoplastiske lesjoner, undersøkte vi om dette downregulation er viktig i utviklingen av livmorhalskreft. For å løse dette spørsmålet, ble syntetisk MIR-143 og MIR-145 forløpere transient transfektert inn i HeLa-celler og virkningen av overekspresjon av deres modne mirnas på HeLa cellevekst ble evaluert ved celletelling. Som vist på fig. 6, ble både MIR-143 og MIR-145 funnet undertrykkende (p 0,005 for MIR-143 og p 0,008 av MIR-145,
t
-test) for å HeLa cellevekst. Dette undertrykkende effekt på cellevekst var ikke en umiddelbar cellerespons; heller, ble to påfølgende celletransfeksjoner med hverandre miRNA med et intervall på 48 timer er nødvendig. Data tyder på at både MIR-143 og MIR-145 må sannsynligvis bli nedregulert i livmorhalsen for tumorprogresjon.
A. MIR-143 og MIR-145 er undertrykkende for HeLa cellevekst. Piler viser tidspunktene når cellene fikk en spesifikk miRNA (30 nM) transfeksjon. Levedyktige celler i hver gruppe ble talt på angitte tidspunkter. Data representerer gjennomsnittet ± SD av to eksperimenter, hvert utført in triplo. B. relative nivåer av MIR-143 og MIR-145 i HeLa celler i 96 timer etter første transient transfeksjon. Totalt celle-RNA ble ekstrahert, ble undersøkt ved miRNA ligering assay. En tRNA nivå i hver prøve ble brukt som en lasting kontroll.
Økt MIR-146a i livmorhalskreft fremmer celledeling
Vurderer en 6-dobling av MIR-146a uttrykk i livmorhalskreft vev, hypotese vi at et høyt nivå av MIR-146a kan spille en rolle i livmorhalskreft cellevekst. Vår første tilnærming ved hjelp av anti-MIR-146a-hemmere eller bruker en morphonino-oligo å blokkere MIR-146a modning for å slå ned MIR-146a uttrykk i livmorhalskreft cellelinjer ikke klarte å overtale en fenotypisk effekt (data ikke vist). Til vår overraskelse fant vi at alle livmorhalskreftcellelinjer undersøkt uttrykte ingen påvisbare Mir-146a (fig. 7A). Deretter MIR-146a ble innført ved forbigående transfeksjon inn i HeLa-celler, en HPV18
+ livmorhalskreft cellelinje, og HCT116-celler, en kolorektal kreft cellelinje (Fig. 7B). En langsom, men betydelig forbedret celle proliferasjon av både HeLa (p 0,009,
t
-test) og HCT116 (P 0,019,
t
-test) celler ble lagt merke til i nærvær av eksogene MIR-146a. Ved beregning av celletellinger fra hver gruppe, vi demonstrert at både HeLa-celler og HCT116-celler inneholdende MIR-146a hadde en fordoblingstid 2-3 timer raskere enn den av cellene med MIR-kontroller (fig. 7C og 7D). Disse dataene tyder på at Mir-146a fungerer som en vekstfaktor i livmorhalskreft.
A. Ingen ekspresjon av MIR-146a i livmorhalskreft-avledede cellelinjer og i en menneskelig hud-avledet keratinocytt linje, HaCaT-celler. Totalt celle RNA ble ekstrahert fra individ cellelinje og undersøkt for MIR-146a og MIR-21 uttrykk ved Nord-blotting. U6 i hver prøve fungert som prøve lasting kontroll. B. Relativ nivå av MIR-146a i HeLa og HCT116-celler i 96 timer etter den første transfeksjon. Totalt celle-RNA ble ekstrahert fra hver gruppe ble undersøkt ved Northern blotting. C og D. MIR-146a fremmer celleproliferasjon. Pilene viser tidspunktene når cellene mottatt transfeksjon med MIR-146a eller MIR-kontroll (30 nM). Levedyktige celler i hver gruppe ble talt på angitte tidspunkter. Data representerer gjennomsnitt ± SD av to eksperimenter, hver utført i tre eksemplarer.
Diskusjoner
I denne studien viste vi miRNA uttrykk profiler i livmorhalskreft og HPV-infeksjon-indusert pre- neoplastiske lesjoner i flåten vev. Selv om både livmorhalskreft vev og HPV-infisert flåten vev med pre-neoplastiske lesjoner viste en oppregulering av MIR-15a og MIR-223 og nedregulering av MIR-143, MIR-145, MIR-218, og MIR-424, de fleste av miRNA uttrykket viste ingen sammenheng mellom de to vev og kan avgrense sykdomsprogresjon. Imidlertid ble en høy grad av MIR-146a uttrykk funnet å være livmorhalskreft spesifikke siden dens uttrykk ble nedregulert både i normalt vev og i HPV-smittet flåten vev med pre-neoplastiske lesjoner.
Funn av nedregulering av MIR-143 og MIR-145 og oppregulering av MIR-146a i livmorhalskreft var særlig attraktiv for to grunner: (1) MIR-143 og MIR-145 kommer til uttrykk fra samme miRNA forløper [28] og er nedregulert også i HPV-indusert pre-neoplastiske lesjoner, i vårt tilfelle i HPV-smittet flåten vev, noe som tyder på at deres reduksjon finner sted i et tidlig trinn før kreftutvikling. Nedregulering av MIR-143 og MIR-145 er funnet i flere andre krefttyper, inkludert tykktarmskreft [32], B-cellelymfom [33], og nylig i livmorhalskreft [34], [35]. Dermed er våre funn viktig for å forstå mekanismene som MIR-143 og MIR-145 er involvert i kreftutvikling. Hemming av MIR-143 og MIR-145 av HeLa cellevekst innebærer at MIR-143 og MIR-145 må sannsynligvis bli nedregulert i orden for kreft vekst. (2) Oppregulering av MIR-146a i livmorhalskreft vev, men ikke i HPV-indusert pre-neoplastiske lesjoner eller i kreftcellelinjer utvunnet indikerer at MIR-146 uttrykk er livmorhalskreft-spesifikke. Ulike studier viser at MIR-146a er en NF-kappaB avhengig genet [36] – [38]. Ekspresjon av MIR-146a ser ut til å variere i forskjellige cancervev i hvilken et øket nivå av MIR-146a ble observert i Burkitts «lymfom linjer med EBV-lmp1 (latent membranprotein 1) ekspresjon [37], [38], men en redusert nivå i hormon ildfaste prostatakreft [39] og papillær thyroideakarsinom [40]. I livmorhalskreft, oppregulering av miR146a uttrykk synes ikke relatert til noen av HPV genuttrykk siden uttrykket ble også redusert i produktivt HPV-infiserte flåten vev. Interessant, inneholder alle livmorhalskreft cellelinjer og en hud keratinocyte linje undersøkt uten påvisbare Mir-146a, noe som tyder på at MIR-146a i livmorhalskreft vev er oppregulert med en faktor mangler i en homogen cellepopulasjon eller uttrykkes av en annen type celler i kreft vev. Dermed konkluderer vi med at oppregulering av MIR-146a uttrykk i livmorhalskreft er gunstig for kreft vekst som innføring av MIR-146a til kreftceller økt celle dobling tid og fremmet celleproliferasjon.
Om lag 800 mennesker mirnas har blitt spådd . Av disse har mer enn 450 (https://microrna.sanger.ac.uk/sequences, 2006) nå blitt identifisert i menneske [41], [42] [43], [44], og deres funksjoner begynner for å bli belyst [45]. I denne studien har vi klonet og identifisert 174 mirnas som ble gruppert i 46 ulike miRNA arter. En ny underart av MIR-193, MIR-193C, ble også klonet og identifisert fra vår miRNA bibliotek screening. Screening av 10 cellelinjer avledet fra livmorhalskreft eller CIN vev for ekspresjon av 10 mirnas foreslått at nærvær eller fravær av integrerte eller episomale HPV genomer har ingen effekt på ekspresjonen av analyserte miRNAs. Dessuten var vi ikke i stand til å identifisere en enkelt HPV16-avledet miRNA fra HPV16
+ CaSki celler ved denne tilnærmingen, selv om andre atom DNA-virus gjøre koder mirnas [46], inkludert EBV [47]; KSHV [48] – [50]; HSV-1 [51], [52]; og SV40 [53]. En negativ kloning for HPV16-avledet mirnas tyder på at den integrerte HPV16 genomet i CaSki celler synes ikke å uttrykke viral miRNAs. En annen studie med differensiert HPV31
+ LKP1 celler som inneholder ~ 50 eksemplarer av en episomal HPV31 genom per celle også unnlatt å identifisere virus-avledet mirnas [54].
Nye rapporter har antydet at mirnas bidra til en rekke av cellefunksjoner [41] og er involvert i utvikling av kreft hos mennesker [19]. For eksempel, MIR-32 styrer celle motstand mot en retroviral infeksjon [55]. En gruppe på seks mirnas på det humane kromosom 13 reguleres av c-myc og c-Myc-regulert MIR-17-5p og MIR-20a negativt modulerer ekspresjonen av E2F1, en transkripsjonsfaktor [56]. mirnas er også preget nylig som potensielle onkogener som fremmer utviklingen av menneskets B-cellelymfom (MIR-17-92 cluster) [57] og spredning og tumorigenesis av primære humane celler (MIR-372 og MIR-373) ved å nøytralisere p53-mediert CDK hemming [58]. En annen studie antydet at overekspresjon av MIR-17-5p, MIR-20a, MIR-21, MIR-92, MIR-106a, og MIR-155 kan anses som en miRNA signatur av solid kreft [59]. I denne rapporten ble 18 mirnas oppregulert og 15 mirnas ble nedregulert i livmorhalskreft vev. Den økte uttrykk for MIR-15b, MIR-16, MIR-146a, MIR-155, og MIR-223 som vi observerte i livmorhalskreft vev har også vært innblandet i utviklingen av andre menneskelige kreft: Mir-15 og MIR-16 regulere apoptose ved å målrette BCL2 [60] og deres mutasjon har vært assosiert med kronisk lymfatisk leukemi [61]; MIR-16 er også involvert i kontroll av cytokin RNA ustabilitet [62]; MIR-146B nivåer er sterkt økt i papillær skjoldbruskkreft [40]; MIR-155 er nylig blitt implisert i utviklingen av lymfoblastisk leukemi /høyverdig lymfom [63] og lungekreft [24] og i reguleringen av human-fibroblast-angiotensin II type 1 reseptor ekspresjon [64]; MIR-223, sammen med transkripsjonsfaktorer C /EBPa og NFI-A, deltar i reguleringen av granulocytic differensiering ved å undertrykke transkripsjon av NFI-A mRNA [65].
Selv om modne miRNAs stammer fra deres primære transkripsjoner gjennom drosha og dicer fordøyelse i to separate reaksjoner trimming inneholder en 2-nt 3 «overhenget på hver tråd, blir dicer fordøyelse av pre-miRNA ikke alltid utført nøyaktig. Dette ble reflektert i MIR-21 og MIR-205 isolert i denne studien. Vi har funnet at mer enn 68% av den mir-21 isolert fra CaSki-celler hadde en ekstra C ved 3′-enden og 33% av den MIR-205 isolert inneholdt en ekstra U i 3»-enden, men uten ekstra nukleotid var stadig identifisert fra de 5 «ender av enten miRNA. Når sammenlignet med den tilsvarende før-miRNA sekvens, ble det ytterligere C på MIR-21 og U på MIR-205 funnet å være avledet direkte fra nukleotidet 3 «for spaltningssetet, noe som tyder på at dicer fordøyelse har en slingre mekanisme . Denne observasjonen av små RNA kloning kan bli ytterligere bekreftet som doble band for MIR-21 (Fig. 5A og 7A fig.) Og for MIR-205 (Fig. 2A og 2B) i det nordlige blot analyser. Våre funn er i overensstemmelse med andre rapporter som oppnås fra biokjemiske analyser som dicer bruker en 3 «ende telling styre og måler en avstand på ~22 nt fra den 3»-enden for å spalte begge trådene av RNA, med 1- til 2-nt skift i den foretrukne cleavage posisjon [18], [66].
Materialer og metoder
celler, vev og flåten kulturer
Åtte livmorhalskreft cellelinjer ble brukt til analysene : HPV16
+ CaSki og Siha, HPV18
+ HeLa og C4II, HPV68
+ ME180 [67], og HPV31
+ CIN612 6E og 9E celler. To HPV16
+ W12 subkloner (20861 og 20863) opprinnelig isolert fra en lavgradig cervikal lesjon histologisk diagnostisert som CIN I [26] ble også brukt for sammenligning. Blant disse cellelinjer, 20863 og 9E cellene inneholder en episomal form av HPV-genomet, og 20861 og 6E celler har en integrert HPV-genomet [68], [69].
