Abstract
microRNAs (Mirs) modulere uttrykk nivåer av mRNA og proteiner, og kan dermed bidra til kreft initiering og progresjon . I tillegg til sin intracelluar funksjon, er Mirs frigjøres fra celler og skur i sirkulasjon. Vi postulerte at sirkulerende Mirs kan gi innsikt i trasé endret i løpet av kreft progresjon og kan tyde på respons på behandling. Her har vi fokus på kreft i bukspyttkjertelen ondartet progresjon. Vi rapporterer at endringer i Mir uttrykk mønstre i løpet av progresjon av normalt vev til invasiv bukspyttkjertelen adenokarsinom i P48-Cre /LSL-Kras
G12D mus modell avspeiler Mir observerte endringene i menneskelige kreft i bukspyttkjertelen vev. MIR-148a /b og Mir-375 uttrykk ble funnet redusert mens MIR-10, MIR-21, MIR-100 og MIR-155 ble økt når man sammenligner normalt vev, premaligne lesjoner og invasivt karsinom i musemodell. Forut target mRNA FGFR1 (MIR-10) og MLH1 (MIR-155) ble funnet nedregulert. Kvantifisering av ni microRNAs i plasmaprøver fra pasienter preget bukspyttkjertel kreft fra andre kreftformer samt ikke-kreft i bukspyttkjertelen sykdom. Til slutt, gemcitabin behandling av kontrolldyrene og P48-Cre /LSL-Kras
G12D dyr med kreft i bukspyttkjertelen forårsaket distinkt og opp til 60-fold endringer i sirkulerende Mirs som indikerer differensial narkotika effekter på normale og kreft vev. Disse funnene støtter betydningen av oppdage Mirs i sirkulasjonen og antyder at sirkulerende Mirs kan tjene som indikatorer på narkotika respons
Citation. LaConti JJ, Shivapurkar N, Preet A, Deslattes Mays A, Peran jeg, Kim SE , et al. (2011) Tissue og Serum microRNAs i Kras
G12D transgene dyremodell og hos pasienter med kreft i bukspyttkjertelen. PLoS ONE seks (6): e20687. doi: 10,1371 /journal.pone.0020687
Redaktør: Janine Santos, medisinske og odontologiske av New Jersey, USA
mottatt: 20 januar 2011; Godkjent: 06.05.2011; Publisert: 27 juni 2011
Copyright: © 2011 LaConti et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Studien ble støttet delvis av National Institutes of Health gi CA108440 (AW), US DOD CDMRP (JJL), Lombardi Cancer Center (NS), Gordon Foundation (AW), det Lustgarten Foundation (ATR) og Ruesch Senter (JLM og AW). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
microRNAs (mirnas eller Mirs) er små, ikke-kodende RNA som spiller en betydelig rolle i å kontrollere aktivitetene til mobilnettet veier både i fysiologi og patologi (se f.eks [1]). Den distinkte funksjon av Mirs i forskjellige kreftformer er blitt mer tydelig i løpet av de siste årene [2], [3], og mange studier viser at MIR signaturer kan brukes til å skille mellom forskjellige typer kreft [4], [5], [6], [7] prognoser [8], [9], [10], [11], [12], [13] eller avdekke potensielle mål [14] samt endrede signalveier [15]. Mest overraskende, en sammenligning av MIR og mRNA profiler av primære og metastatiske kreft lesjoner viste at Mirs gitt en mer pålitelig og karakteristiske signatur enn mRNA og funnet ut at Mir signaturer var overlegne til mRNA identifisere orgelet kilde til metastaser av ukjent opprinnelse [16] , [17]. Utover disse analyser av normale og syke vev, har nyere rapporter vist at det kan påvises MIR arter i omløp [18], og foreslo at analyse av serumprøver for definerte MIR art kan brukes til å identifisere pasienter med kreft [19], [ ,,,0],20], [21], [22], [23], [24], [25], så vel som andre sykdommer slik som hjertesykdom, [26], [27], [28], [29], [30] eller diabetes mellitus [31].
Sekvenser av Mirs ofte bevares over arter og vi spekulert i at analysen av Mirs i en veldefinert dyremodell kunne informere studier med pasientprøver. Vi var spesielt interessert i å vurdere om dette kan bli oversatt til påvisning og kvantifisering av Mirs i sirkulasjonen, fordi det kan til slutt avslører aktivert eller endret sykdoms trasé basert på analyse av en blodprøve i stedet for analysen av syke vevsprøve [32] . I tillegg behandlinger vil trolig innvirkning Mir mønstre i sirkulasjon og disse mønstrene kan godt være nyttig å etablere signaturer av narkotika effekter.
Her er vi fokusert på kreft i bukspyttkjertelen, som ble diagnostisert i 43,140 pasienter i 2010. Kreft i bukspyttkjertelen er en dødelig sykdom med en 5-års overlevelse på bare 6% [33]. Denne dårlige resultat skyldes sen deteksjon så vel som en mangel på effektive behandlinger [34]. Å identifisere informativ Mirs, vi brukte en genmodifisert mus modell, P48-Cre /LSL-Kras
G12D modell, som først ble beskrevet av Hingorani
et al.
[35]. Denne modellen gjengir den ondartet progresjon sett i menneskelig utvikling PDAC [34], [35] og en rekke studier med denne modellen snevret ned cellene opprinnelse PDAC [36] og viste bidrag av forskjellige driver gener [37], [38 ], [39] som styrer biologi og utviklingen av sykdommen [40]. Vi brukte vev høstet på ulike stadier av ondartet progresjon fra denne musemodell for å evaluere et panel av Mirs som hadde vist seg å være opp- eller nedregulert i menneskelige bukspyttkjertelen kreft vev og hadde blitt anmeldt og samlet nylig av Seux og kolleger [41 ]. Denne analysen ble deretter etterfulgt av kvantifisering av Mirs i sirkulasjonen hos pasienter med kreft i bukspyttkjertelen og andre eller kontrollene, og vi har funnet MIR uttrykk mønstre som skilte mellom de ulike gruppene. MIR uttrykk mønstre i serum fra forsøksdyr Parallelt funnene hos pasienter. Endelig behandling av dyrene med anti-kreft legemiddel Gemcitabin som er godkjent for førstelinjeterapi for kreft i bukspyttkjertelen [42], viste et tydelig mønster endring i mir nivåer i sirkulasjonen av dyr med kreft i bukspyttkjertelen versus kontroller.
Resultater
mikroRNA uttrykk i bukspyttkjertelen vev under Kras
G12D-indusert ondartet progresjon
Et panel av Mirs konsekvent opp- eller nedregulert på tvers av ulike studier i menneskelige kreft i bukspyttkjertelen vev i forhold til normale bukspyttkjertelen vev ble valgt fra litteratur og data base søk (se tabell S1, Refs [7], [41], [43], [44], [45]). For dette MIR panel vi etablert kvantitativ RT-PCR deteksjon [46] fordi vi ventet et bredt spekter av mir konsentrasjoner når man sammenligner vevsekstrakter versus blodprøver eller på tvers av humane og murine prøver.
Muse pankreas vevsprøver ble høstet ved ulike aldre fra P48-Cre /LSL-Kras
G12D musemodell. Pankreasgang epitel i disse dyrene går gjennom tidlige og sene dysplastiske lesjoner, Panin (= bukspyttkjertelen in situ karsinom) over en periode på flere måneder til invasiv kreft og dermed etterligne ondartet progresjon av sykdom hos mennesker [34], [35]. Hver vevsprøve høstet ble iscenesatt av en histologisk analyse av pankreas duktale endringer (Figur 1a). Kontroll vev inneholdt 100% normale kanaler (Figur 1b). Pankreata fra yngre mus (figur 1C) inneholdt mer enn 50% av kanaler med tidlig stadium dysplastiske lesjoner (Panin-1 eller -2). Pankreata fra eldre mus (figur 1D) inneholdt ~ 10% av kanaler med sent stadium dysplastiske lesjoner (Panin-3) i tillegg til -50% av kanaler med Panin-1 eller -2. PDAC vev inneholdt det meste invasiv adenokarsinom (figur 1E).
(A) Kvantifisering av histopatologiske forandringer i pankreata av kontroller eller P48-Cre /Kras
G12D mus. Prøvene ble delt inn i kontroller, tidlig stadium dysplastiske lesjoner (Panin-1 og -2), sent stadium dysplastiske lesjoner (Panin-tre stede) og invasiv pankreasgang adenokarsinom (PDAC). (B til E) Representative histopatologiske bilder fra hver av gruppene: (B) normal bukspyttkjertelen, (C) Panin-1 og -2 (tidlig), (D) Panin-3 (sen) og (E) PDAC. Gjennomsnitt ± standard feil av% av pankreatisk vev med de respektive lesjoner er vist (n = 3 dyr i hver gruppe). 0, ikke oppdaget
Analyse av uttrykk for individuelle Mirs viste tre store trender (figur 2A-C). Først uttrykk for MIR-10, MIR-16, MIR-21, speil 100 og MIR-155 økt i de tidlige Panin lesjoner i forhold til kontroll, og opprettholdt høy uttrykk på slutten Panin og adenokarsinom vev. (Figur 2A) det andre, MIR-22, MIR-148a /b, MIR-212, og MIR-375 ble sterkt uttrykt i kontroll vev og deres ekspresjon ble redusert i Panins (figur 2C), så vel som i adenokarsinom vev. Tredje, uttrykk for MIR-29b, MIR-34a /c, MIR-141, MIR-199, hadde MIR-210C og MIR-301a ikke endres vesentlig i løpet av ondartet progresjon (figur 2B).
(A- C) Expression nivåer av enkelte Mirs i kontroll og bukspyttkjertelen vev på ulike stadier av ondartet transformasjon. De Mirs Nivåene ble gruppert som øker (A), stø (B), eller mink (C) basert på en sammenligning av nivåene i hver gruppe (n = 3 per gruppe). Gjennomsnitt ± standardfeil er vist for hver MIR uttrykk. (D) Hierarkisk clustering muse vev basert på MIR uttrykk. Distinkte grupper er angitt av den blå og den gule boksen. (E) Hierarkisk clustering av Mirs basert på deres uttrykk nivåer. Mirs som ble uttrykt ved høye nivåer i kontroll (blå boks) versus PDAC vev (gul boks) er indikert. * P 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001; kontroll vs. tidlig Panin, sent Panin, eller PDAC. #: Au 0,85 og p = 0,06, ##: au 0,85 og p 0,05, ###: au 0,90 og p 0,01. (Au, ca objektiv sannsynlighet).
Tydelig gruppering av Mirs og bukspyttkjertelen vev med ulike sykdomsstadier
En ukontrollert clustering av muse vev basert på deres Mir uttrykk nivåer identifisert tre distinkte grupper (figur 2D). Kontroll vev atskilt fra alle andre vev i en gruppering av sine egne (blå boks). Fem av seks vev klassifisert som in situ lesjoner (Panin) ble gruppert sammen i en annen gruppe. Invasive adenokarsinom og en av de sene Panin vev segregert i en ytterligere klynge (gul boks). Dermed blir sett av Mirs analysert her er tilstrekkelig til å skille de ulike stadier av mutante Kras-indusert bukspyttkjertelen ondartet progresjon.
Unsupervised gruppering av de enkelte Mirs ble utført for å finne ut hvilke Mirs oppfører seg parallelt og kan dermed tjene som vanlige signaturer sammenfallende med sykdom stadium (figur 2E). En gruppe (gul boks) inneholdt de Mirs som viste den høyeste uttrykk i adenokarsinom vev og lavest i kontroll vev. En egen gruppe (blå boks) viste en gjensidig MIR uttrykk mønster, med høyest nivå i kontroll vev og de laveste nivåene i adenokarsinom. Disse grupperinger antyder at en undergruppe av Mirs kan definere en vev klassifisering bekreftende tidligere arbeid fra andre med forskjellige humane kreftprøver [16], [17].
En sammenligning av funnene i musemodell (Figur 1 ***, P 0,001 normal versus kreft
gemcitabin behandlingseffekt på sirkulerende Mirs i dyremodell
Tilstedeværelsen av sykt vev kan angis ved endrede Mir concentraions i. sirkulasjon (se Innledning). Som en logisk forlengelse, kan MIR konsentrasjoner i omløp også tjene som lett tilgjengelige markører for behandling og effekt selv indikere trasé endret ved en gitt behandling. Vi testet denne hypotesen i PDAC musemodell i forhold til å kontrollere dyr uten kreft. Gemcitabin er en første-linje legemiddel som brukes i behandling av pasienter med kreft i bukspyttkjertelen og ble administrert i en uke til dyr med PDAC og alderstilpassede kontrolldyrene. Dosen og behandlingsplan ble tilpasset fra andre studier som hadde vist effekt over en lengre behandlingsperiode [49], [50]. En liten blodprøve ( 0,1 ml) ble trukket før oppstart av behandling for å sammenligne Mir serumnivåer før og etter behandling på tvers av disse to gruppene av dyr. Tilstedeværelsen av PDAC i P48-Cre /Kras
G12D dyr ble bekreftet ved histologisk analyse av bukspyttkjertelvev ved slutten av studien. Vi valgte seks Mirs som ble funnet oppregulert og to som var ned regulert i PDAC vev i forhold til kontrollene (se figur 2). A 10 000-ganger konsentrasjonsområde av disse åtte Mirs ble funnet i sirkulasjon av dyr (figur 4A). Før behandling (figur 4A, åpne barer), serumnivåer av MIR-10 og MIR-155 ble forhøyet 2 ganger (p 0,05) i PDAC (rød) versus kontrollgruppen (svart). I kontrast er serumnivået av MIR-21, MIR-148b og MIR-375 hvor utvisket mellom gruppene. Gemcitabin behandling (figur 4A, fylte søyler) reduserte serumnivåer av MIR-10, MIR-21 og MIR-155 i dyr med PDAC og i kontroller av 6- til 60-fold (p 0,05 til 0,01; Figur 4B) . Serumnivåer av MIR-100 og MIR-375 ble redusert med 2 ganger etter behandlingen men kun de kontrollene viste statistisk signifikante forskjeller (p 0,05). MIR-148b serumnivåene ble ikke endret ved behandling og MIR-16 nivåer økt 5 ganger etter behandling. Det er bemerkelsesverdig at Gemcitabin behandling av dyr med PDAC redusert serumnivåer av MIR-21, MIR-10 og MIR-155 ved en ytterligere 2-, 3- og 6-gangers under reduksjonen sett i kontrolldyrene, selv om bare den speil 155 nådde statistisk signifikans i sammenligningen av PDAC og kontroll (figur 4B; p 0,05). Disse dataene antyder at overvåking passende Mirs i sirkulasjonen kan skille narkotika effekter på syke vev fra stoffet effekter på de sunne ikke-målet vev.
(A) MIR-nivåer i serumprøver høstet før (åpne søyler) og etter en ukes behandling med Gemcitabin (5 doser på 40 mg /kg). (B) Forholdet mellom serumkonsentrasjon før /etter gemcitabin behandling. Den stiplede linje indikerer en to-gangers forskjell. *, P 0,05; **, P. 0,01
Mirs i sirkulasjon av pasienter med bukspyttkjertel og andre kreftformer
Ni forskjellige Mirs ble isolert og kvantifisert fra plasmaprøver av pasienter med bukspyttkjertelkreft, annet gastrointestinal kreft, og ikke-kreft-kontroller. Pasienten diagnoser er oppsummert i Tabell S2. MIR-100a og MIR-10 var signifikant økt i de pankreatiske kreftpasienter sammenlignet med ikke-kreft-kontroller, mens en rekke av de andre Mirs (MIR-16, 21, 155, 199, 221, og 223) viste en tendens til øket ekspresjon som nådde ikke statistisk signifikans (figur 5A). En annen undergruppe av Mirs viste signifikante forskjeller mellom ekspresjonsnivåer kreft i bukspyttkjertelen og tykktarmskreftpasienter, men ikke i forhold til pasienter med andre gastrointestinale cancere. Uttrykket mønstre av de ulike sirkulerende Mirs tyder på at noen er best på å skille mellom kreft og ikke-kreftpasienter, mens andre beste skille de syke organer.
Prøver var fra bukspyttkjertelen kreftpasienter, ikke-kreft kontroller og pasienter med andre GI kreft. (A) Konsentrasjonen av ni Mirs oppdaget i omløp viser individuelle forskjeller mellom pasientgrupper. Legg merke til de forskjellige utvalgene av skalaene på Y aksene. (B) Unsupervised tilfeldig skog analyse som sammenligner kreft i bukspyttkjertelen (svarte sirkler) versus ikke-kreft-kontroller med pankreas sykdom (hvit trekant), ikke-kreft-kontroller uten pankreas sykdom (hvite sirkler), øvre gastrointestinal kreft (blå sirkler), coloncancere ( røde sirkler), og leverkreft (gule sirkler). Sirklet i rødt er de fleste av bukspyttkjertel kreft. Pilene viser to eksemplar fra pasienter med duodenal kreft. * P 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001. Pasientens egenskaper er gitt i Tabell S2.
I en ukontrollert tilfeldig skog analyse som betraktes som uttrykk for alle ni Mirs isolert fra sirkulasjonen, fem av seks bukspyttkjertelcancerpasienter gruppert sammen i en separat gruppe fra fleste andre pasienter (figur 5B). Dette bekrefter at det kombinerte ekspresjon mønster av disse ni Mirs i sirkulasjon var tilstrekkelig til å identifisere pasienter med kreft i bukspyttkjertelen som atskilt fra pasienter med andre GI kreft og kontroller. Av notatet var to prøver fra pasienter med duodenal svulster (piler) som er gruppert nærmest bukspyttkjertelen kreftpasienter, muligens på grunn av bukspyttkjertel engasjement uoppdaget på tidspunktet for prøvetaking. Også prøver fra pasienter med ikke-kreft i bukspyttkjertelen sykdom og ikke-kreft kontroller gruppert sammen som indikerer at panelet av MIR uttrykk er spesifikk for kreft i bukspyttkjertelen i stedet for noen sykdom som stammer fra bukspyttkjertelen.
Diskusjoner
mutant Kras
G12D-drevet kreft i bukspyttkjertelen modellen har blitt godt preget på mange molekylære og biologiske nivåer [35], [36], [37], [38], [39]. Vår analyse av vevsprøver viser at noen Mir endringer knyttet til invasiv kreft i bukspyttkjertelen er allerede tydelig i den tidlige fasen av sykdommen (figur 2). Mer overraskende var i hvilken grad forandringer i mir ekspresjon i dyremodellen etterlignet MIR uttrykk endringer observert i human kreft i bukspyttkjertelen (se tabell S1). Faktisk ble en undergruppe av Mirs som omfatter MIR-10 og MIR-155 oppregulert i bukspyttkjertelkreft vev fra pasienter og mus samt i de respektive blodprøver. Således tilveiebringer denne studien bevis for at inter-arter likheten av mir ekspresjon i sammenheng med kreft i bukspyttkjertelen er relativt konservert, høyst sannsynlig på grunn av mutant Kras som en viktig initiator av denne malignitet [42].
Sammenligning analyse av MIR uttrykk under ondartet progresjon i musemodell tillater oss å trekke noen konklusjoner om relevante Mirs i sirkulasjonen som kan indikere tilstedeværelse av forstadier. Habbe et al. [51] rapporterte om uttrykket nivåer av Mirs i menneske intraductal papillær mucinkjertler svulster (IPMN) vev, og konkluderte med at MIR-155 er oppregulert og en mulig biomarkør av pre-invasiv sykdom vev. Vi fant MIR-155 for å bli oppregulert i settene som inneholder Panin lesjoner i musemodell og også funnet MIR-155 oppregulert i plasmaprøver fra bukspyttkjertelen kreftpasienter. Andre studier som evaluerte sirkulerende MIR-21, MIR-210, MIR-155 og MIR-196a i forskjellige sett med kreft i bukspyttkjertelen pasienter har trukket lignende konklusjoner på den diagnostiske potensialet i Mirs [52]. IPMN, mucinous cystisk svulst (MCN), og Panin representerer tre kjente forstadier av PDAC. Disse tre typer premalignancies har mange genetiske og patologisk likheter, men også noen funksjoner som tillater å skille dem [53]. Våre funn støtter hypotesen om at plasmanivået av MIR-155 kan faktisk representere en biomarkør som indikerer tilstedeværelse av Panin lesjoner.
I likhet Mir endringer i vev og i sirkulasjon antyde at Mirs er løslatt fra syke vev i en kontinuerlig måte muligens via exosomes [54], [55] selv om det kan være spesifikke utløsermekanisme som kan favorisere enkelte Mirs over andre [56]. Her har vi hovedsakelig fokusert på Mirs som er forhøyet i sykt vev heller enn de som uttrykk er redusert eller tapt. Vi tenkte at et tap av en gitt MIR vil kun påvirke likevektsnivåer i sirkulasjonen dersom syke organ er den viktigste kilden til Mir stede i sirkulasjon. F.eks MIR-148a /b og MIR-375 er nedregulert veldig sterkt på kreft i bukspyttkjertelen i forhold til normale bukspyttkjertelen vev. MIR-375 har vist seg å spille en viktig rolle i pankreatisk øy utvikling [57], og funksjon samt i vedlikehold av glukose-homeostase [58], [59], og det er bemerkelsesverdig at en tidlig symptom på PDAC kan voksen utbruddet diabetes mellitus. MIR-148 kan undertrykke uttrykk for DNMT3b gjennom en region i sin kodende sekvens [60] og kan dermed påvirke DNA-reparasjonsmekanismer
Til tross for en . 100 ganger reduksjon av MIR-375 og MIR-148a /b under malign transformasjon av bukspyttkjertelen vev, er det påfallende at serumnivåer ikke er redusert hos dyr med PDAC (se figur 2C og 4A). Dette tyder på at bukspyttkjertelen bidrag til serumnivåer er bare små. Dette er sannsynligvis også for MIR-21, hvor økning av vevsnivåer av 100 ganger i løpet av pankreatisk malign transformasjon i dyremodellen ikke er reflektert i økte serumnivåer (se figur 2A og 4A). I kontrast er MIR-10 og MIR-155 nivåer i serum økte i bukspyttkjertelen malign transformasjon i mus og hos pasienter som støtter forestillingen om at den syke organ er en betydelig bidragsyter til serumnivået av disse Mirs (se Figur 4A og 5A).
Nyere studier fra Bartel laboratorium har vist at den dominerende aktivitet til Mirs er å senke mål-mRNA-nivåer, og fant at over 84% av mir virkninger på proteinproduksjon er på grunn av denne uttømming av mål-mRNA [48]. Dermed kan Mirs som er oppregulert i sirkulasjon av syke individer sammenfaller med reduserte nivåer av målet mRNA i sykt vev opprinnelsesland. Vi videre en hypotese om at Mirs funnet økt i sirkulasjon av pasienter kan være til stede på mye høyere nivåer i syke tisses på grunn av fortynning på deres Shedding inn i blodstrømmen. Vi identifiserte kandidat mRNA-mål og en objektiv liste over mindre uttrykte mRNA fra bukspyttkjertelkreft versus normalt vev samlet fra forskjellige studier returnerte 154 mRNA som kan være kreft relevante MIR mål. Disse ble matchet med Mir panelet studert her (tabell S3).
sett av gener returnert fra denne analysen inneholder
MLH1
spådd som et mål for MIR-155. Faktisk overekspresjon av MIR-155 i cellelinjer førte til nedregulering av hMSH2, hMSH6, og hMLH1. Også, en invers korrelasjon mellom uttrykk nivåer av MIR-155 og MLH1 eller MSH2 proteiner rapportert for menneske kolorektal kreft [61]. MLH1 er en ikke-tilsvarende reparasjon protein som bidrar til akkumulering av genetiske feil i sammenheng med familiær kreft i bukspyttkjertelen og noen sporadiske tilfeller [34]. Dens mRNA ble funnet nedregulert i bukspyttkjertelkreft prøver og en brøkdel av tapet av MLH1 mRNA uttrykk i bukspyttkjertel kreft har blitt tilskrevet arrangøren hypermethylation [62]. Vi har observert en betydelig invers sammenheng mellom ekspresjonen av MIR-155 og MLH1 mRNA i sammenligningen av normale og kreft vev (Figur 3A). I tillegg ble mRNA FGFR1 funnet nedregulert i humant pankreatisk adenokarsinom (tabell S3), og vi har observert en betydelig nedregulering i musemodellen PDAC i forhold til normalt vev (Figur 3B). Disse funnene med MIR-10 og MIR-155 og deres spådd mål mRNA MLH1 og FGFR1 støtter tanken om en potensiell regulerende funksjon av disse Mirs under ondartet progresjon.
I en videre rekke dyrestudier med potensial direkte klinisk søknad, testet vi om Mirs kan tyde på legemidlets effekt. Konsentrasjonen spekter av sirkulerende Mirs overvåkes i denne eksperimenter er 10.000 ganger og virkningen av medikamentell behandling var urelatert med forbehandling konsentrasjonen av de åtte Mirs overvåkes (Figur 4A). Etter Gemcitabine behandling MIR-16 ble funnet økt i serum med 5 ganger i PDAC samt kontrolldyrene. MIR-16-ekspresjon er assosiert med apoptose [63], veksthemming gjennom p53 [64] og tumorundertrykkelse [65]. Økningen av denne MIR-16 i omløp kreft og kontrolldyrene samsvarer med den cytotoksiske aktivitet av medikamentet på friskt vev. I motsetning til denne økningen, ble Mir-148b serumnivåer ikke berørt etter at medikamentell behandling og serum MIR-10 og MIR-155 ble redusert mest (30- og 60-fold) etter Gemcitabine behandling. Disse to Mirs hadde blitt funnet forhøyet i serum fra PDAC dyr i forhold til kontroller før initiering av medikamentbehandling. Videre serumnivåer av MIR-10 og MIR-155 i behandlede dyr med PDAC falt under serumnivåene av behandlede kontroll-dyr (figur 4A B) som indikerer dem som potensielle indikatorer på tumorspesifikke effekter av behandlingen. Totalt sett er funnene i denne eksperimentelle innstillingen støtter konseptet med en kreft i bukspyttkjertelen selektiv effekt av gemcitabin om effekter på homeostase av andre sunne vev ble også klart.
Konklusjon
Mir endringer i vev og sirkulasjons viser bemerkelsesverdige likheter mellom kreft i bukspyttkjertelen hos pasienter og P48-Cre /Kras
G12D musemodell for sykdommen. Utover mimcry av menneskelig molekylær patologi i musemodellen, kan signatur Mirs identifisert her også tjene som informative indikatorer på narkotika effekt i utviklingen av livsnødvendige monoterapi eller kombinasjonsterapi [42] av denne ødeleggende sykdommen.
Materialer og metoder
mus vev analyse
Animal studieprotokoller ble godkjent av Georgetown University Animal Care og bruk Committee (GUACUC # 08-028). Den P48-Cre /LSL-Kras
G12D musemodell har beskrevet tidligere [35]. I kontrollgruppen, sen Panins og adenokarsinom-grupper, musene ble avlivet ved 16 måneders alder. Styrer manglet enten KRAS
G12D eller P48-CRE allel. For tidlig Panin gruppen, ble musene på en måneds alder behandlet med caerulin og ofret på fire måneders alder etter en etablert protokoll [66]. Pankreata ble delt i to fra hale til hode med en halv fast i formalin og den andre halvparten frosset i flytende nitrogen. En patolog scoret høyest Panin klasse per lobule av alle lobules telles i et representativt H E beiset lysbilde av hver mus bukspyttkjertelen [35]. «Normal» omfatter enhver normal og reaktiv duktalt endring. Panin-1 og -2 ble slått sammen til én kategori av «tidlige» lesjoner mens vev med Panin-3 ble inkludert i en egen kategori for «sent» lesjoner på grunn av den høye sannsynligheten for ondartet progresjon.
MIR og mRNA-ekspresjon i mus pankreatisk vev
Total RNA ble ekstrahert fra vevene ved hjelp av TRIZOL-reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA) som beskrevet av fabrikanten. Mirs ble ytterligere isolert fra total-RNA ved anvendelse av en MIR isolasjonskit (SA Biosciences, Frederick, MD). Mir ble omdannet til cDNA ved hjelp polyA tailing fulgt av universell grunning med Mir First Strand Kit og kvantifisert ved hjelp av pre-designet MIR spesifikk qPCR (SA biovitenskap, Frederick, MD) på en ABI 7900 HT Real-Time PCR system (Applied Biosystems, Foster city, CA). mRNA kvantifisering ble beskrevet i [46]. I korte trekk ble cDNA syntetisert ved anvendelse av total-RNA ble ekstrahert og den iScript cDNA Synthesis Kit, i henhold til produsentens protokoll (Bio-Rad Laboratories). QRT-PCR ble utført ved anvendelse av iQ SYBR grønn Supermix (Bio-Rad Laboratories) på en iCycler (BioRad) med: 95 ° C i 3 minutter etterfulgt av 40 sykluser (95 ° C i 20 sekunder, 60 ° C i 30 sekunder og 72 ° C i 40 sek), og som smelter kurve trinn (95 ° C i 1 minutt, 55 ° C i 1 min, økt temperatur-gradient fra 50 ° C ved 0,5 ° C hver 10 sek i de følgende 80 sykluser). MLH1 frem primer: GCGGCACCCACTTCCAGTCC; omvendt: CGGAGAGTCTCATGGCACCGC. FGFR1 frem primer: GTAGCTCCCTACTGGACATCC; reverse primer. GCATAGCGAACCTTGTAGCCTC
Mir påvisning og kvantifisering i menneskelige og mus blodprøver
Menneskeblodprøver ble hentet fra biorepository av Lombardi Cancer Center som samler anonymisert prøven fra kreft og ikke-kreft pasienter for forskningsformål. Dataene ble analysert anonymt. Museblod ( 0,1 ml) ble oppsamlet via submandibulære blødning ved hjelp av en lansett [67]. Serum- eller plasmaprøver ble blandet i et forhold på 1:10 med Qiazol lysereagensen og virvles. Lysatet ble ekstrahert med CHCI3, og den vandige fasen ble videre behandlet for total-RNA ved hjelp av miRNeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA) og anriket for miRNA hjelp av RT2 qPCR-Grade miRNA Isolation Kit, MA-01 (SABiosciences).
Gemcitabine behandling av dyr
gemcitabin ble hentet fra sykehuset apotek og gis til 22-23 måneder gamle P48-Cre /Kras
G12D eller alder matchet kontrolldyrene 40 mg /kg i 5 doser i løpet av en uke. Denne dose på 200 mg /kg /uke var basert på Refs. [49], [50]. Blod ble tatt før behandlingsstart ( 0,1 ml) og én dag etter siste dose. Tilstedeværelsen av PDAC ble bekreftet i P48-Cre /Kras
G12D av post mortem histologisk analyse
Dataanalyse
databehandling metoder ble kodet i R (http: //www. .r-project.org). Hierarkisk clustering ble utført basert på gjennomsnittet sentrert og skalert Mir uttrykk nivåer.
