Abstract
Bakgrunn
Prostata epitelceller avhenge av androgener for overlevelse og funksjon. I (tidlig) prostatakreft (PCA) androgener regulerer også tumorvekst, som blir utnyttet av hormonell behandling ved metastatisk sykdom. Hensikten med denne studien var å karakterisere androgen reseptor (AR) respons på hormonterapi bestandig PC346 celler og identifisere potensielle sykdomsmarkører.
metodikk /hovedfunnene
Menneskelig 19k oligoarrays ble brukt å etablere androgen-regulert uttrykk profilen til androgen-responsive PC346C celler og dens avledede terapiresistente underlinjer: PC346DCC (vestigial AR nivåer), PC346Flu1 (AR overekspresjon) og PC346Flu2 (T877A AR mutasjon). I alt ble 107 transkripsjoner forskjellig-uttrykt i PC346C og derivater etter R1881 eller hydroksyflutamid stimuleringer. AR-regulert uttrykk profiler reflekterte AR modifikasjoner av respektive terapiresistente underlinjer: AR overekspresjon resultert i sterkere og bredere transkripsjonen respons på R1881 stimulering, AR nedregule korrelert med mangelfull respons fra AR-målgener og T877A mutasjon resulterte i transkripsjonen respons på både R1881 og hydroksyflutamid. Dette AR-target signatur var knyttet til flere offentlig tilgjengelige cellelinje og svulst avledet PCA databaser, avsløre at distinkte funksjonelle klynger ble ulikt moduleres under PCa progresjon. Differensiering og sekretoriske funksjoner ble oppregulert i primær PCa men undertrykt i metastaser, mens spredning, cytoskeletal ombygging og heft ble overexpressed i metastasering. Til slutt ble de androgen-regulerte gener ENDOD1, MCCC2 og ACSL3 valgt som potensielle sykdomsmarkører for RT-PCR kvantifisering i et distinkt sett av menneskelige prostata prøver. ENDOD1 og ACSL3 viste nedregulering i høy grad og metastatisk PCA mens MCCC2 ble overuttrykt i lavgradig PCa.
Konklusjon /Betydning
AR modifikasjoner forandret transkripsjons respons (anti) androgener i terapi-resistente celler. Videre selektiv nedregulering av gener som er involvert i differensiering og opp-regulering av gener som fremmer proliferasjon og invasjon foreslå en forstyrret balanse mellom vekst- og differensierings funksjoner av AR reaksjonsveien i løpet av PCa progresjon. Disse funnene kan ha implikasjoner i dagens behandling og utvikling av nye terapeutiske tilnærminger for metastatisk PCa
Citation. Marques RB, Dits NF, Erkens-Schulze S, van IJcken WFJ, van Weerden WM, jenster G (2011 ) Modulation av androgen Receptor Signa i hormonbehandling resistent prostatakreft cellelinjer. PLoS ONE 6 (8): e23144. doi: 10,1371 /journal.pone.0023144
Redaktør: Laszlo Tora, Institutt for genetikk og molekylær og cellebiologi, Frankrike
mottatt: 08.12.2010; Godkjent: 13 juli 2011; Publisert: 04.08.2011
Copyright: © 2011 Marques et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Arbeidet presentert i dette manuskriptet ble finansielt støttet av nederlandske organisasjonen for Scientific Research (NWO), gjennom ZonMW stipend 903-46-187, og av det nederlandske Cancer Society (KWF), gjennom tilskudd NKB97-1479 og DDHK 2001-2455. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Prostatakreft er den hyppigste diagnosen non-hud kreftformen hos menn og den nest største årsaken til kreftdødsfall i de vestlige land [1]. Prostatakreft er en svært heterogen tilstand, som oppviser et bredt spekter av biologiske og kliniske manifestasjoner. Mens noen pasienter utvikler en asymptomatisk sykdomsforløp og heller dø med kreft enn fra kreft, andre til stede med en mer aggressiv og /eller mer avansert sykdom på diagnosetidspunktet [2]. Når svulsten er begrenset til prostata, kan det effektivt behandles ved radikal kirurgi og /eller strålebehandling, men når svulsten har spres, er systemisk terapi er nødvendig. Siden prostata kreft celler krever androgener for deres overlevelse og vekst, den gylne standard for behandling av unnvikende prostatakreft er androgen ablasjon gjennom kjemisk eller kirurgisk kastrasjon, som kan kombineres med administrasjon av androgen reseptor (AR) antagonister [2]. De fleste pasienter vil ha nytte av dette hormonbehandling, svulstene kan krympe og symptomene lindre. Imidlertid, etter hvert alle kreft blir motstandsdyktig og gjenta seg som terapi-refraktær eller kastrering resistente sykdommer, som for øyeblikket eksisterer ingen helbredende behandling [3], [4]. AR veien er veldig allsidig, å være involvert i mange biologiske prosesser, inkludert celleproliferasjon, regulering av apoptose og differensiering [5]. Balansen mellom disse forskjellige funksjoner dikterer homeostase av prostatakjertelen. Et relevant spørsmål er hvordan prostatakreftceller som er i utgangspunktet avhengig av androgener kan gjenoppta vekst i en androgen-belastede miljø. En mulighet er at prostatakreftceller oppnå dette ved å tilpasse deres AR vei til de lave androgen /høy anti-androgen nivåer, for eksempel ved mutasjon, amplifikasjon eller trunkering til en konstitutivt aktiv AR, deregulering av AR-kofaktorer og /eller intratumoral androgen produksjon [6] , [7]. På den annen side, kan kreftceller aktivere alternative vekst trasé, mens nedleggelse tumor suppressors og apoptotiske signaler [6], [7].
I denne studien har vi fokusert på rollen til AR sti i prostatakreft progresjon. Uttrykket mønster av androgen-regulerte gener i androgen-responsive og kastreringsresistent cellelinjer ble etablert, med mål om å: (i) avgjøre om AR veien er fortsatt funksjonelt aktiv i hormonbehandling bestandig PC346 celler; (Ii) identifisere mekanismen (e) ved hjelp av hvilken AR veien kan innstilles til den lave androgen /høy antiandrogen nivåer; (Iii) å identifisere androgen-regulerte gener som potensielt kan brukes i diagnose /prognose av prostatakreft eller som et terapeutisk mål. For dette formål, har vi brukt mikromatriser for å karakterisere den transkripsjonelle programmet aktiveres av den syntetiske androgen R1881 og antiandrogen hydroksyflutamid. Som modellsystem vi brukte PC346 cellelinjer (tabell 1): androgen-responsive PC346C foreldrecellelinje og sine terapiresistent avledede underlinjer PC346DCC, PC346Flu1 og PC346Flu2 [8]. Disse kastreringsresistent underlinjer reprodusere vanlige AR endringer observert i terapiresistent sykdom:. AR nedregulering (PC346DCC), AR mutasjon (PC346Flu2) og AR overekspresjon (PC346Flu1), gjør det til en unik og verdifull modell for denne studien
Metoder
Etikk erklæringen
Normal og tumorprøver fra pasienter ble hentet fra den frosne vev bredden av Erasmus Medical Center (Rotterdam, Nederland). Prøvene ble samlet inn mellom 1984 og 2001. De eksperimentelle protokollene ble godkjent av Erasmus MC Medical Ethics Committee i henhold til medisinsk forskning som omfatter mennesker loven.
Reagenser og cellelinjer
Den grunnleggende kultur medium som anvendes i vedlikehold av PC346 cellelinjer besto av DMEM-F12-medium (Cambrex BioWhitaker, Belgia) supplert med 2% føtalt kalveserum (FCS; PAN Biotech GmbH, Aidenbach, Tyskland), 1% insulin-transferrin-selen (Gibco BRL ), 0,01% bovint serumalbumin (Boehringer Mannheim, Tyskland), 10 ng /ml epidermal vekstfaktor (Sigma-Aldrich), penicillin /streptomycin antibiotika (100 U /ml penicillin, 100 mg /ml streptomycin; BioWhitaker, Belgia); pluss følgende tillegg: 100 ng /ml fibronektin (Harbor bio-produkter, Tebu-bio, Nederland), 20 mg /ml fetuine (ICN Biomedicals, Nederland), 50 ng /ml choleratoxin, 0,1 mM phosphoethanolamine, 0,6 ng /ml trijodtyronin og 500 ng /ml dexametason (alt fra Sigma). PC346C celler ble holdt i kultur i komplett medium nevnt ovenfor, supplert med 0,1 nM 17-methyltrienolone (R1881, NEN, Boston, MA, USA). PC346DCC seleksjonsmedium ble supplert som beskrevet ovenfor, men utarmet fra androgener ved bruk av dekstran-belagt trekull (DCC) ble behandlet FCS. PC346Flu1 og PC346Flu2 kulturmedium ble også androgen oppbrukt ved anvendelse av 2% DCC-FCS, og supplert med 1 uM av hydroksyflutamid (OH-flutamid, Schering-Plough Research Institute, New Jersey, USA). For hormon stimuleringer, ble en forenklet versjon av det benyttede kulturmediet, inneholdende 2% FCS DCC uten de nevnte tilsetninger (minimal medium). Cellene ble dyrket i T25 Primaria ™ vevskulturflasker (BD Biosciences Benelux NV, Nederland) ved 37 ° C under 5% CO
2 fuktig atmosfære.
Hormonstimulering og uttrykk microarray analyse
Celler ble sådd ut i deres respektive seleksjonsmedium for å nå -50% konfluens og fikk feste seg over natten. Neste dag ble mediet erstattet med 2% FCS-DCC i minimalt medium og cellene ble sultet i 48 timer, for å bringe AR-aktivitet til basalnivåer før hormon stimuleringer. Deretter ble cellene stimulert med enten bærer, 1 nM R1881 eller 1 uM OH-flutamid for 4, 8 eller 16 timer. Etter at stimuleringer ble cellene skylt to ganger med PBS og lagret ved -20 ° C inntil RNA isolering. Total RNA ble isolert med RNAzol B-reagens (Campro Scientific, Veenendaal, Nederland) og ytterligere renset ved RNeasy kolonner (Qiagen) med mot-kolonne DNA-fordøyelse, i henhold til produsentens protokoll. RNA kvalitet ble kontrollert på 1% agarosegel.
Cy3- eller Cy5-merkede RNA-prober ble fremstilt ved å inkorporere amino-allyl UTP i løpet av RNA-amplifikasjon, etterfulgt av kobling med N-hydroksysuksinimid modifiserte fargestoff. I korthet, ble 3 pg RNA anvendt for en T7-baserte lineære mRNA amplifikasjonsprotokoll, tidligere beskrevet [9]. Amino-allyl UTP, pluss lik mengde av umodifisert rUTP, ble innlemmet i Arna med T7 Megascript Kit (alle fra Ambion), i overensstemmelse med fabrikantens protokoll. Amplifisert RNA ble renset og konsentrert ved hjelp av Microcon-YM 30 kolonner (Amicon®) for å skylle tre ganger med 300 ul RNase-fritt vann. Til slutt, 2 ug aminoallyl-modifisert RNA, i en maksimalt 3,33 ul RNase-fritt vann, ble inkubert med 1,66 pl natrium-bikarbonat-buffer (0,3 M, pH 9) og 5 pl Cy3- eller Cy5-fargestoff (CyScribe Post-merking Kit, Amersham, NJ, USA), i 1 time i mørke ved romtemperatur. Reaksjonen ble stanset med 5 ul 4 M hydroksylamin-HCl (Sigma), contra-merkede prober ble kombinert og renset /konsentrert ved hjelp av Microcon-YM 30 kolonner. Probe ble samlet i 5-15 mL endelig volum og resuspendert i 80 mL Ambion hybridisering buffer nummer 1.
For microarray vi brukt dobbel-dye oligoarrays som representerer ca 15 000 menneskelige gener, som merket hormonstimulert RNA var cohybridized med sin kontra merket tids matchet kjøretøy (etanol) kontroll. To mikromatriser ble utført pr tilstand: i ett eksperiment de stimulerte prøvene ble merket med Cy3 og den ustimulerte referanse med Cy5, i det andre forsøket i omvendt (fargestoff-swap); Dette ble gjort for å utelukke dye-fortrinnsrett binding til oligonukleotider på microarray. I tillegg ble to uavhengige cellepassasjer som benyttes for hver av disse eksperimentene, for å ta hensyn til den biologiske variasjoner.
oligoarrays brukt i denne studien ble fremstilt ved Erasmus Senter for Biomics. Kort fortalt, et menneske 18,584 oligonukleotider bibliotek (Compugen, Sigma-Genosys) ble oppdaget på aminosilan lysbilder ved hjelp av en Virtek Chipwriter Professional arrayer (Virtek Vision International, Waterloo, Canada). Kontroll flekker inkludert landemerker, småblødninger buffer, fremmede oligonukleotider (SpotReport Alien Oligo Array, La Jolla, Stratagene), poly d [A] 40-60, laks sperm DNA, og menneskelig COT-1 DNA. Før hybridiseringen ble microarray lysbilder prehybridisert i 5x SSC, 0,05% SDS, 4% BSA-oppløsning i 30 minutter ved 45 ° C, vasket to ganger med RNase-fritt vann i 2 minutter, skyllet med isopropanol og spinn-tørket i 3 minutter ved 1500 g. Microarray hybridiseringer ble utført over natten ved 45 ° C, med kontinuerlig omrøring, i en HS4800 Hybridisering stasjon (Tecan Benelux BV). Til slutt ble de vasket arrays automatisk i Hybridisering stasjon ved hjelp av: 2x SSC /0,05% SDS (ved 45 ° C), 1 x SSC og 0,2 x SSC (ved romtemperatur), og tørket under en strøm av N
2, før skanning.
data~~POS=TRUNC ekstraksjon og analyse
Arrays ble skannet i en ScanArray Express HT scanner (Perkin Elmer, Nederland BV) og spot intensiteter ble kvantifisert ved hjelp Imagene programvare (Bio Discovery Inc, El Sequndo , CA, USA). For å balansere Cy3 og Cy5 stikk intensiteter, Loewess normalisering per undergruppe ble utført ved hjelp limma-pakke (https://bioinf.wehi.edu.au/limma/) fra Bioconductor (https://www.bioconductor.org) [10] , [11]. Å skalere mellom arrays, ble den globale median intensitet per array satt til 1000. Dye intensiteter under 200 ble deretter terskel på 200, for å redusere støy og gjøre fold-endring på lav intensitet spekter mer robust mot uteliggere. Flekker med intensiteter under terskelen (200) for både Cy3 og Cy5 kanaler, i mer enn 50% ( 3/6) av arrays for hver gang-kurs, ble ekskludert fra analysen. Prøve å kjøretøykontroll forhold ble deretter beregnet og 2log forvandlet. Flekker som viste motsatt effekt for dye-swap /biologiske replikater ble ekskludert fra videre analyse; effekter ble kalt motsatt hvis gjennomsnitts 2log ratio for de tre tidspunktene testet var ≥0,5 for en fargestoff og under ≤-0,5 for dye-swap. Etter normalisering og alle de ovennevnte kvalitetskontroller, ble 2log intensitetsforhold fra begge replikater gjennomsnitt for hvert tidspunkt. Disse dataene ble lagret i SRS7 (Sequence Retrieval System versjon 7, Lion Bioscience AG, Heidenberg, Tyskland) [12], som også ble brukt til sammenligninger med andre tidligere publiserte /offentlig tilgjengelige databaser [13], [14], [15 ], [16], [17], [18], [19], [20], [21], [22], [23], [24].
Hierarkisk clustering og datavisualisering var utføres ved hjelp av Cluster og Utforsker programmer (Eisen Labs: https://rana.lbl.gov), henholdsvis. Analyse av betydning Mikromatriser (SAM; https://www-stat.stanford.edu/~tibs/SAM) ble benyttet for å bestemme hvilke gener som var statistisk forskjellig mellom stimulerte prøver og ikke-stimulerte referanser. Gene ontologi clustering ble utført ved hjelp av Database for kommentering, visualisering og integrert Discovery (DAVID: https://david.abcc.ncifcrf.gov) [25], [26]. Den veien og funksjonelle analyser ble generert gjennom bruk av Oppfinnsomhet Pathways Analysis (Ingenuity® Systems, www.ingenuity.com).
Alle microarray data er MIAMI kompatibel og har blitt deponert i Gene Expression Omnibus repository ( https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/), under GEO sjonsnummer GSE22914.
cDNA syntese og RT-PCR-analyse
Total RNA ble isolert som beskrevet ovenfor, og cDNA ble syntetisert ved anvendelse MMLV-revers transkriptase kit og Oligo (dT)
12-18 primer (Invitrogen) i overensstemmelse med fabrikantens protokoll. cDNA-prøvene ble lagret ved -20 ° C. For validering av microarray resultater, ble kvantitativ real-time PCR-analyse utført ved hjelp av en ABI Prism 7700 Sequence Detection System (Applied Biosystems, Foster City, California). KLK2, PART1, TPD52, FKBP5, GPR88, STEAP1, TRIB1 og ID3 ble kvantifisert med absolutt QPCR SYBR Grønn ROX Mix (Thermo Scientific) og 330 nM av hver primer, i henhold til produsentens protokoll. Primere ble utviklet ved hjelp av dataprogrammet Oligo Primer Analysis Software versjon 6.22 (Molecular Biology Insights Inc, USA). Gene spesifisitet ble sjekket av BLAST og når det er mulig, intronspennende primere ble valgt for å unngå forsterkning av forurensende DNA. Primer sekvenser er beskrevet i tabell 2. TMPRSS2, Ptil og GAPDH ble kvantifisert ved TaqMan real-time PCR analyse, med absolutt QPCR ROX Mix (Thermo Scientific). TMPRSS2 (analyse ID Hs00237175_m1) og GAPDH (assay ID Hs99999905_m1) kits ble kjøpt fra Applied Biosystems og løp etter produsentens anvisninger. PSA ble kvantifisert som beskrevet tidligere [8]. For hvert gen, ble en standardkurve konstruert fra serielle fortynninger av en omvendt-transkribert PC346 RNA basseng, som så ble brukt til å bestemme mengden av target melding fra terskel syklus (Ct) verdi. GAPDH husholdningsgenet ble anvendt som endogene kontroll.
For kvantitativ PCR-analyse av de humane vev, normale og tumorprøver fra pasienter som ble oppnådd fra den frosne vev bredden av Erasmus Medical Center (Rotterdam , Nederland). Ytterligere informasjon om disse prøvene ble gitt tidligere [27]. TaqMan real-time PCR-analyse ble utført på en ABI Prism 7700 Sequence Detection System (Applied Biosystems, Foster City, CA), ved bruk av AmpliTaq Gold-DNA-polymerase (Applied Biosystems) i henhold til produsentens spesifikasjoner. Validerte primere og prober fra TaqMan genuttrykk Analyser (Applied Biosystems) ble brukt for kvantifisering av ACSL3 (Hs01071247_m1), MCCC2 (Hs00223257_m1), ENDOD1 (Hs00826684_m1) og GAPDH (Hs99999905_m1), i henhold til PCR-innstillingene som tilbys av Applied Biosystems. PBGD ble kvantifisert ved hjelp av 330 nM av primere termin: 5′-CAT GTC TGG TAA CGG CAA TG-3 «og bakover: 5′-GTA CGA GGC TTT CAA TGT TG-3» primere, i kraft SybrGreen PCR Master mix (Applied Biosystems ), ifølge termocykling protokoll som anbefales av produsenten. Transkripsjon mengder for hver prøve ble normalisert mot gjennomsnittet av to endogene referanser og i forhold til en kalibrator. De to housekeeping gener brukes som endogene referanser var PBGD og GAPDH; en blanding av cDNA fra prostata carcinoma xenotransplantater ble anvendt som kalibrator. Grafer og statistikk ble utført med GraphPad Prism (versjon 3.0). P-verdier. 0,05 ble vurdert som signifikante
Resultater
genuttrykksmønstrene av PC346 celler behandlet med R1881 og hydroksyflutamid
For å karakterisere uttrykket profilen til androgen reseptor målgener i prostatakreftceller, brukte vi uttrykket microarray analyse på PC346 cellelinjen panel inkuberes med androgen analoge R1881 eller antiandrogen OH-Flutamide. Den PC346 modellsystem består av fire cellelinjer: androgen-sensitive PC346C og tre hormonbehandling fast underlinjer, utledet fra foreldre PC346C ved langvarig androgen ablasjon (PC346DCC), supplert med antiandrogen OH-Flutamide (PC346Flu1 og PC346Flu2 ). Alle disse underlinjer oppviser forskjellige egenskaper med hensyn til AR status og respons (sammenfattet i tabell 1) [8].
For ekspresjon analyse vi stimuleres cellene med 1 nM R1881 eller 1 uM OH-flutamid til 4, 8 eller 16 timer og cohybridized den merkede RNA med sin tid matchet kjøretøy (etanol) kontroll. To mikromatriser ble utført per tilstanden ved hjelp av to uavhengige celle passasjer i dye-swap, å ta hensyn til den biologiske variasjon og potensielle fargestoff fortrinnsrett effekter. Tidlig tidspunktene ble valgt for å berike for primær AR mål, og minimere indirekte sekundære mål.
De to replikater per time-punktet ble gjennomsnitt og totalt 107 differensielt-uttrykt transkripsjoner ble valgt til å utgjøre AR pathway signatur: 74 oppregulert og 33 nedregulert ved R1881 og /eller OH-flutamid (tabellene 3, 4, 5, 6). Flekker ble ansett for å være differensielt uttrykt hvis den absolutte 2log forholdet ≥0.5 (forhold ≥1.42 eller ≤0.71) for alle tre tidspunkter, i minst én celletype. Analyse av betydning Mikromatriser (SAM) ble anvendt for å bestemme hvilke gener som var statistisk forskjellig mellom stimulerte prøver og ikke-stimulerte referanser. I eksperimentell design, valgte vi å utføre hormonstimuleringer på 3 forskjellige tidspunkter, slik at utskrifter med en raskere eller tregere respons ikke ville gå glipp av. Men tidseffekten var ubetydelig: de fleste androgen-regulert transkripsjoner ble uttrykt forskjellig ved alle tre tidspunkter og for den statistiske analysen vi besluttet å samle alle 3 tids poeng per tilstand. Totalt var det 253 SAM betydelige gener, med en falsk funnrate (FDR) satt til 0,05 (tabell S1, S2, S3, S4). Fra våre 107 signatur transkripter, muligens differensielt uttrykt i henhold til de ovennevnte kriterier, 77 var statistisk signifikante ved SAM. Faktisk uttrykk for de resterende 30 (28%) transkripsjoner av vår AR-target signatur variert over 3 tidspunktene, slik at disse ikke nådde statistisk signifikans i den sammenslåtte SAM analyse. Denne variasjonen kan ikke forklares med en tilsynelatende dominerende kinetisk mønster, eller kan det være knyttet til 4 h tidspunkt spesielt. Siden tidsmessig regulering ble observert for slike noen transkripsjoner, ble utført noen analyse av dynamikken i gen-uttrykk variasjon over tid. Uttrykket forholdstall presentert i tabeller og figur 4 er fra gjennomsnittet av alle tre tidspunkter per tilstand. Til slutt, det faktum at et betydelig antall av SAM betydelige vitnemål ikke ble inkludert i vår AR-regulert signatur skyldes vårt valg å sette 2log forholdet terskel på 0,5.
androgen-sensitive PC346C underlinjen reagert på R1881 stimulering med øket ekspresjon av 18 gener, mens to var nedregulert. Blant disse er noen kjente AR regulert gener som KLK2, STEAP1, TMPRSS2 og FKBP5. Terapien fast underlinjer viste tydelige reaksjoner på R1881 og OH-Flutamide. PC346Flu1, som uttrykker 4-ganger høyere AR nivå enn den parentale cellelinje, viste en «super-aktivering» av AR veien ved R1881, ikke bare i omfanget av genekspresjon, men også i antall regulerte gener (20 androgen -regulated gener i foreldre PC346C versus 91 i PC346Flu1). Derimot er PC346DCC underlinjen, som uttrykker restnivåer AR protein, viste ingen påvisbare endringer i genekspresjon etter at hormonbehandlinger. Verken PC346C, PC346DCC heller ikke PC346Flu1 viste betydelige endringer i den transkripsjonelle profilen i respons til OH-flutamid. I motsetning til dette, PC346Flu2 celler, som uttrykker T877A muterte AR, svarte til både R1881, og dette anti-androgen, selv om responsen til den sistnevnte var svakere (14 gener oppregulert ved R1881 versus 8 oppregulert med OH-flutamid, Tabeller 3 og henholdsvis 5,)
Validering av microarray data
microarray data ble validert av to tilnærminger. en eksperimentell tilnærming ved hjelp av kvantitativ RT-PCR og bioinformatikk tilnærming knytte våre gen signatur til en satt av offentlig tilgjengelige databaser på androgen respons. Vi valgte 10-androgen-regulert gener for å bli ytterligere validert av kvantitativ RT-PCR: PSA, KLK2, PART1, TPD52, GPR88, FKBP5, TMPRSS2, STEAP1, ID3 og TRIB1. Det er verdt å merke seg at vår microarray analyse ikke oppdage regulering av PSA uttrykk som svar på hormonelle behandlinger, men siden dette er en fremtredende AR target gen, det var inkludert i RT-PCR valideringstrinnet. Den kvantitative PCR-analyse bekreftet den differensielle ekspresjonen av alle valgte gener i den samme retning forutsagt av mikromatriseanalyse (fig. 1). Videre RT-PCR viste også en sterkere effekt av hormon-behandling på den PC346Flu1 cellelinje, i motsetning til den nesten fraværende induksjon av PC346DCC celler, sammenlignet med foreldre PC346C, for de fleste genene analysert. Som observert i mikromatriseanalyse viste PC346Flu2 tilsvarende responser til R1881 og OH-flutamid i mange regulerte gener (fig. 1, Tabeller 3, 4, 5, 6).
Kvantitativ RT-PCR-analyse av et sett 10 androgen-regulerte gener i PC346 cellelinjer. Celler ble stimulert med 1 nM R1881 (R1881), 1 mM OH-flutamid (Flut) eller bærerkontroll (DCC-FCS) i 16 timer. Grafene viser Mean (± SE) av normalisert genekspresjon (n.g.e.) i forhold til husholdningsgenet GAPDH, for to uavhengige celle passasjer. ID3 og TRIB1 ble androgen-trykt i microarray analyser, mens de andre genene var oppregulert av androgener.
I de siste årene har en rekke studier det er publisert at analysert genekspresjon i respons til stimulering androgener i cellelinjer og xenotransplantater (tabell 7). Av de 107 utskrifter i vår signatur, 73 var til stede i minst 3 av de 5 databaser og ble inkludert for videre analyse. Mer enn 90% av de koblede gener overlappet med tidligere rapporterte androgen-regulert mål. Gener med de sterkeste induksjoner i vårt liggende arbeid viser også gående høye induksjoner i flere tidligere rapporter, noe som tyder på at produktene av disse genene kan spille en grunnleggende rolle i den biologiske funksjon av prostata (fig. 2). Ved hjelp av vår unike cellelinje panel, var vi i stand til å identifisere nye androgen-responsive gener som MAFB, KLF9, NFIB, STBD1, BIK og HLX.
På venstre side, PC346C, PC346Flu1 og PC34Flu2 ble utsatt for 1 nM R1881 eller 1fiM OH-Flutamide for 4, 8 og 16 timer, mens PC346DCC ble stimulert med 1 nM R1881 bare. På høyre side, ble vår gen signatur vurderes i databasene fra DePrimo
et al.
, Nelson
et al.
, Nickols
et al.
, Wang
et al.
og Hendriksen
et al. product: (se tabell 7 for database detaljer). Heat-kart presenteres for 2log uttrykk forholdet mellom hormonbehandlet prøver og respektive tidstilpassede kjøretøy kontroller. Røde og grønne farger representerer induksjon og undertrykkelse, henholdsvis, mens svart indikerer ingen regulering. Grå firkanter indikerer manglende data på grunn av lavt uttrykk, dårlig datakvalitet eller fravær av sonder for den respektive transkripsjon i rekken plattformen som brukes for studien.
Biologiske prosesser koordineres av AR pathway
androgen-regulert signatur gener ble klassifisert i henhold til Gene ontologi (GO) biologiske prosesser ved hjelp av Database for kommentering, visualisering og integrert Discovery (DAVID: https://david.abcc.ncifcrf.gov) [25], [26].
i samsvar med de fysiologiske rollene til androgener, denne tilnærmingen avslørte at AR målgener som er valgt i den foreliggende undersøkelse operere i regulering av transkripsjon og intracellulære signalveier, metabolismen av proteiner , lipider og karbohydrater, og regulering av celleproliferasjon og differensiering (fig. 3A). Den største kategorien inkluderer gener som koder for transkripsjonsfaktorer og transkripsjon regulatorer som NFIB, KLF9, HIF1A, MAFB, EHF, NCOR1, NCOR2, PIAS1 og flere sink finger proteiner (ZNF189, ZBTB10, ZBTB16 og CASZ1). Dette ble etterfulgt av gener involvert i intracellulær signaltransduksjon, inkludert G protein-koblede reseptorer pathway (GPR88, RGS2, GNAI1), små GTPases av Ras-familien (RHOB, RHOU), mitogen-aktivert protein kinase kaskade (MAP2K4, MKNK2, TRIB1) og andre proteinkinaser /fosfataser (PPM1A, PPP2CB, PIK3R3, SGK1). Andre AR responsive gener har en effekt på celleproliferasjon gjennom regulering av cellesyklus og apoptotiske prosesser (f.eks RCC1, BBX, BIK, TP53INP1). Samtidig med en rolle av androgener på prostata utvikling og modning, en annen hovedgruppe inngår gener som er involvert i cellulær differensiering, for eksempel som TPD52, TWSG1, NDRG1, ID1 og ID3. Til slutt, androgen indusert metabolismen av proteiner, karbohydrater og lipider som bidrar til produksjon og sekresjon av prostatavæske. Slike R1881 målgener inkludert MTHFD1, PSPH, PSAT1 og MCCC2, som koder for enzymer i metabolismen av metionin, serin og leucin aminosyrer, respektivt. Videre oppregulering av translasjons-initierings-faktor EIF2C3 potensielt fremmer peptidsyntese. Videre gener som deltar i protein folding (PDIAS5, FKBP5), glykosylering (FUT8, GALNT1) og menneskehandel (DMN1L, KDELR2) ble også regulert av R1881. Bortsett fra proteiner og aminosyrer, i prostata væske også rik på lipider, polyaminer, sorbitol og flere metallioner. Faktisk, R1881 også stimulert ekspresjon av ACSL3 og ELOVL5, som deltar i forlengelsen av fettsyrer, spermin-syntase (SMS), en del av polyaminet syntetiske metode, sorbitol dehydrogenase (Sord), utskilt av prostata inn i den forutgående væske, og ionekanalene ACCN4 og KCNJ10.
(A) Pie-graf som representerer gener kategorisert etter mest fremtredende biologisk funksjon. Gene ontologi merknader ble hentet ved hjelp av DAVID [25], [26]. (B) Involvering av AR pathway genene i sykdommen etter retningslinjer Oppfinnsomhet Pathway Analysis (Ingenuity® Systems, www.ingenuity.com).
For å automatisere funksjonell klassifisering, kvantifisere graden av anriking av hvert klynge og velg statistisk signifikante funksjonelle kategoriene vi brukte DAVID Functional merknad Clustering verktøyet. Dette verktøyet identifisert 6 statistisk signifikante Merknads Clusters, som er forbundet med metabolismen av organiske syrer (lipider og aminosyrer), apoptose, celledifferensiering, utviklingsprosesser, regulering av transkripsjon og regulering av cellulære prosesser (Tabell 8).
involvering av androgen-regulerte gener i patologiske tilstander ble videre undersøkt ved hjelp av oppfinnsomhet database (Ingenuity® Systems, www.ingenuity.com). De sterkeste assosiasjoner ble funnet for kreft, reproduksjonssystemet, dermatologiske og kardiovaskulære sykdommer (Fig. 3B).
The AR veien i prostatakreft utvikling og progresjon
For å undersøke hvordan AR veien er modulert under utvikling og progresjon av prostatakreft vi koblet vår androgen-regulert gen signatur til syv uavhengige prostata kreft microarray databaser. Disse studiene inkluderte eksemplarer av «normal prostata» og prostatakreft fra ulike sykdomsstadier, hvis viktigste kjennetegn er oppsummert i Tabell 7. Totalt 89 hormon-responsive gener var til stede i minst 4 av de 7 databaser, og ble valgt for videre analyse. I figur 4 viser vi den hierarkiske clustering av R1881-responsive gener (første blokk av 4 kolonner), ved siden av primær kreft kontra normal prostata (andre blokk), metastase versus primær kreft (tredje kvartal), og til slutt tilbakevendende versus ikke- tilbakevendende og hormonbehandling motstandsdyktig mot hormon-naive sykdom (fjerde kvartal). PC: prostatakreft;
