Abstract
Til tross for kronisk betennelse, psoriasislesjoner nesten aldri utvikle seg til hudkreft. Avvikende funksjon av CCHCR1 genet (Coiled-Coil α-heliks Rod protein 1, HCR) innenfor PSORS1 locus kan bidra til utbruddet av psoriasis. Som CCHCR1 er uttrykt i visse kreftformer og regulerer keratinocyte (KC) spredning i en transgen musemodell, studerte vi dens forhold til spredning i kutan plateepitelkreft (SCC) cellelinjer av uttrykk arrays og kvantitativ RT-PCR og i hud svulster ved immunhistokjemi . CCHCR1 protein ble påvist i skyve grensen til SCC og fôr basalcellekarsinom øyer. Forskjellig fra psoriasis, Ki67 hadde en lignende uttrykk mønster som CCHCR1. Den mest intense farging CCHCR1 forekommet i områder som var positive for epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR). Uttrykk for CCHCR1 mRNA ble oppregulert 30-80% i SCC linjer i forhold til normal KCs og positivt korrelert med Ki67 uttrykk. De mest aggressive og invasive tumorcellelinjer (rT3, Fadu) uttrykte CCHCR1 mRNA mindre enn ikke-tumorigene HaCaT celler. Videre tumorpromotere okadainsyre og menadion downregulated CCHCR1 mRNA. Vi konkluderer med at både psoriasis og de tidlige stadiene av KC transformasjon, kan CCHCR1 fungere som en negativ regulator av spredning, men utover et visst punkt i onkogenese kan ikke kontrollere dette fenomenet lenger
Citation. Suomela S, Elomaa O, Skoog T, Ala-aho R, Jeskanen L, Pärssinen J, et al. (2009) CCHCR1 Er oppregulert i hudkreft og Associated med EGFR Expression. PLoS ONE 4 (6): e6030. doi: 10,1371 /journal.pone.0006030
Redaktør: Benjamin Rich, Harvard Institute of Medicine, USA
mottatt: 8. desember 2008, Godkjent: 21 mai 2009; Publisert: 24 juni 2009
Copyright: © 2009 Suomela et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet av Academy of Finland (US-K. innvilge nr. 115 590, SS gi no. 122 236, RA og VM.K. gi no. 114 409, LL gi no. 108828), Sigrid Juselius Foundation (US-KJK, VM .K.), The Helsinki University Hospital Research Fund (TYH 7113), Den finske Cancer Research Foundation (VM.K.) og EU-rammeprogram 6 (LSHC-CT-2003-503297) (RA og VM.K.) , Turku Universitets Central Hospital EVO stipend (prosjekt 13336), og finsk Dermatologisk Society (SS), Finland, Vetenskapsrådet (US-K., JK) og svenske Cancer Foundation (US-K., JK), og Finsen- Welander Foundation (TS), Sverige. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Vi har tidligere vist at CCHCR1 genet innenfor hoved psoriasis mottakelighet locus PSORS1 kan fungere som en negativ regulator av KC proliferasjon [1] – [3]. Den CCHCR1 genet koder for et 782 aminosyre protein (GenBank AY029160) [4] som er forskjellig uttrykt i angrepne psoriasis huden i forhold til normal hud: lesionally CCHCR1 lokaliserer i basal og suprabasal KCs hvor epidermis er på sitt tynneste. Farging for celleformering Ki67 viser invers korrelasjon til CCHCR1 i psoriasis-lesjoner, i overensstemmelse med en rolle i spredning KC [1], [4]. Videre vår mus modell overekspresjon den CCHCR1 * WWCC psoriasis risiko allel etter keratin 14 arrangøren viser nedsatt spredning evnen til KCs [3], noe som tyder på mindre aktiv aktivator protein 1 (AP-1) mediert signalering i risiko mus. AP-1-mediert signalisering regulerer gener assosiert med celleproliferasjon, inkludert EGFR også kjent som ErbB1 [5].
psoriasis-lesjoner nesten aldri utvikle seg til hudkreft til tross for kronisk betennelse som ofte er en risikofaktor for kreft [6] , [7]. Både psoriasis og hudkreft er karakterisert ved ukontrollert proliferasjon KC i tillegg til angiogenese og inflammasjon. Cellulær proliferasjon og differensiering kan formidles via EGFR-signalisering [8]. Flere EGFR ligander (TGF-a, amfiregulin, heparin-bindende EGF-lignende vekstfaktor) er overuttrykt i psoriasis-lesjoner, og transgene ekspresjon av det humane genet amfiregulin induserer en psoriasisaktig fenotype [8]. EGFR signale har også vært innblandet i patogenesen av non-melanom hudkreft [8] – [10]. Interessant, både forbedring og forverring av psoriasis har blitt rapportert i forbindelse med EGFR tyrosinkinasehemmer kreftbehandling [11], [12].
I våre tidligere studier, ble CCHCR1 uttrykk påvist i nonproliferating celler i bryst og lunge adenokarsinomer: den hyperproliferasjon Ki67 ble påvist i tilstøtende, men ikke i de samme cellene som CCHCR1 [1]. Videre EGF oppregulert CCHCR1 protein ekspresjon i HaCaT-celler [2]. For ytterligere å forstå funksjonen av CCHCR1 i KC transformasjon og hudkreft, studerte vi uttrykk i premaligne og maligne plateepitel lesjoner og basalcellekarsinom (BCC). Som EGFR og dens nedstrøms mål cyclin-D1 er involvert i kreftutvikling og muligens påvirket av de antatte CCHCR1 trasé, undersøkte vi deres uttrykk i forhold til CCHCR1. Forholdet mellom CCHCR1 til KC hyper ble markert ved farging tilstøtende prøver med Ki67 antistoff. Vi studerte også korrelasjonen av CCHCR1 ekspresjonsnivået til de av Ki67 og EGFR i kulturer av celler med forskjellig proliferativ og invasive egenskaper. CCHCR1 mRNA nivåer ble bestemt i HaCaT kulturer inkubert med ulike bioaktive stoffer med betydning i tumorvekst, oksidativt stress eller psoriasis betennelse. Til slutt ble ekspresjonsnivåene av CCHCR1, Ki67, og EGFR-mRNA bestemmes i et oligonukleotid microarray av kutane SCC cellelinjer og normale humane epidermale KC cellelinjer. Våre resultater tyder på at CCHCR1 er uttrykt i ikke-melanom hudkreft i forbindelse med EGFR og Ki67 in vivo. Men i cellekultur de atypic celler uttrykker CCHCR1 mindre enn udødeliggjorte HaCaT celler, og tumorvekst og indusert spredning av HaCaT celler korrelerer med redusert CCHCR1 uttrykk.
Resultater
CCHCR1 er uttrykt i SCC i forbindelse med EGFR, cyclin-D1, og Ki67
for å studere rollen til CCHCR1 i KC spredning og transformasjon, undersøkte vi CCHCR1 protein uttrykk ved immunhistokjemi i ulike hudkreft i forhold til EGFR, nedstrøms mål cyclin- D1, og hyper Ki67. CCHCR1 positive celler var tilstede i 20/22 SCCS studert. Proliferative kreftceller ved invasiv fremre uttrykt CCHCR1 (figur 1 A, D, G, S1, figur 2A, C, E), mens de kohesive kreftceller i midten var CCHCR1 negativ. Infiltrerende utvekst var typisk for CCHCR1 positive områder, men de atypic cellene var heterogen for CCHCR1 uttrykk (Figur 2A). CCHCR1 ekspresjon i SCC var assosiert med positiv EGFR farging i alle prøvene (figur 1A, C, D, F). De CCHCR1 positive kreft reir i de lavere dermis var cyclin-D1 positive så vel (Figur 2C-F). Celler positive for hyper Ki67 ble plassert hovedsakelig i de samme områdene som CCHCR1 positive celler (figur 1B, E, 2B). Men i klasse III SCCS Ki67 var mer rikelig tilstede også i sammenhengende kreft områder som var blottet for CCHCR1 uttrykk (data ikke vist). For sammenligning er en normal hud eksemplet vist med basal KCs positiv for CCHCR1 og EGFR, og spredt positivitet for Ki67 (figur 1 H-J).
seriesnitt av klasse I SCC (A-C) og normal hud (H-J) ble immunostained med antistoffer mot CCHCR1, Ki67, og EGFR. Høyere forstørrelse av A-C er også vist (D-F, respektivt). CCHCR1 farging (G) i en tilstøtende seksjon av EGFR farging (F). CCHCR1 protein (A) blir uttrykt i formerende kreftceller i invasiv forsiden av dermal cancercelleøyene en SCC i forbindelse med hyperproliferasjon Ki67 (B) og EGFR (C). De Ki67 positive celler (E) uttrykke CCHCR1 (D). EGFR flekker (F) forbinder med CCHCR1 flekker (G) i tilstøtende seksjoner. Normal hud prøvene uttrykke CCHCR1 (H) og EGFR (J) i basal KCs, mens Ki67 uttrykk (I) er mer sparsom. Piler peker på illustrerende stillinger.
Scale barer: product: (A-C) 50 mikrometer; (D-G) 12,5 pm; (H-J) 25 mikrometer.
Serie deler av klasse III (A, B) og klasse II (C, D) SCC ble farget med de angitte antistoffer. Høyere forstørrelse av en annen klasse II SCC (E, F). I klasse III SCC (A, B), er uttrykk for CCHCR1 heterogen: mange, men ikke alle, kreftceller uttrykker både CCHCR1 (A) og Ki67 (B). De innfellinger viser lavere forstørrelse av det samme region, påpeker stjerne ut en kreftcelle med negativ CCHCR1 og Ki67 uttrykk. I klasse II SCC (C, D), er infiltrerende utvekst CCHCR1 positive (C), og de CCHCR1 positive kreft reir er også cyclin-D1 positive (D). Tilstøtende deler av klasse II SCC (E, F) viser foreningen av CCHCR1 og cyclin-D1 positive celler. Pilene viser tilsvarende områder.
Scale barer: product: (A, B, E, F) 12,5 mikrometer; (C, D, innfellinger) 50 mikrometer.
CCHCR1 uttrykkes ved palisading kreftceller i BCC
I BCC, ble CCHCR1 uttrykt spesielt i cytoplasma av palisading kreftceller av de veldefinerte carcinoma øyer (figur 3A, C). Tre av 15 BCC prøver var skleroserende, men CCHCR1 ikke var mer tallrike i dem (data ikke vist). CCHCR1 ble uttrykt i en granulær mønster i syv prøver (figur 3A, C) co-lokaliserende med EGFR (figur 3B, D). Alle fem prøvene som ble studert var cyclin-D1 positiv: imidlertid dets ekspresjon var ikke så sterk som hos CCHCR1 og mer konsentrert til midten av tumor reirene (data ikke vist). Cytoplasmatiske uttrykk for CCHCR1 i basal KCs i normal hud i tilknytning til BCC området varierte mellom prøvene. EGFR uttrykk var høyere i basal KCs av normal hud enn i palisading celler i de fleste prøvene.
Serie deler av BCC (A, B) ble farget med antistoffer mot CCHCR1 og EGFR. Høyere forstørrelse av A og B er også vist (C, D, henholdsvis). CCHCR1 protein blir uttrykt i en granulær mønster i cytoplasma av palisading kreftceller av en knute BCC (A, C). CCHCR1 uttrykk (C) co-lokaliserer med EGFR farging (D). CCHCR1 og EGFR er også uttrykt i basal KCs (A, B). Pilene viser tilsvarende stillinger.
Scale barer: product: (A, B) 50 mikrometer; (C, D) 25 mikrometer.
For å undersøke om CCHCR1 og EGFR co-Localize også på cellenivå, vi transient transfektert HaCaT celler med en CCHCR1 konstruere og visualisert CCHCR1 og EGFR uttrykk med immunfluorescens. CCHCR1 uttrykket ble oppdaget som et ringformet, cytoplasmatiske mønster, mens EGFR uttrykk var mer eller mindre membranbundne og ikke co-lokalisere med CCHCR1 farging (figur 4A-D). Transfektert og ikke-transfekterte celler viste lignende EGFR-ekspresjon, noe som tyder på at CCHCR1 ikke påvirker EGFR-ekspresjon eller lokalisering (figur 4B).
CCHCR1 transfektert HaCaT-celler (A-D) farget med antistoffer mot CCHCR1 (A) og EGFR (B). Overlapping av A og B er vist i (C), og DAPI farging som viser cellekjerner i (D). Celler som uttrykker CCHCR1 (grønn) var også positive for EGFR (rød), men de to proteinene ikke ko-Localize (C). CCHCR1 positive (pil) og negative (pil hodet) celler viser lignende EGFR uttrykk som tyder på at CCHCR1 overekspresjon ikke påvirker EGFR uttrykk (B).
CCHCR1 uttrykk i keratoacanthomas er assosiert med lymfocytt infiltrasjon
keratoakantom (KA), histologisk en ondartet svulst, men oppfører seg på en godartet måte, blir ofte betraktet som en «forløper» lesjon til SCC. KAs viste generelt positivt CCHCR1 farging spesielt i KCs av skyve grensen i områder med et fremtredende lymfocytt infiltrat som omgir svulsten (figur 5A, C). EGFR-positive celler var tilstede i de samme områdene i de undersøkte prøvene (Figur 5B, D). I CCHCR1 positive område, var Ki67 uttrykk også påtruffet i alle tre prøver, men med mindre intensitet enn i SCCS (figur 5E, F).
seriesnitt av KA (A, B, E, F) var farget med antistoffer mot CCHCR1 og EGFR (A, B) eller mot CCHCR1 og Ki67 (E, F). Høyere forstørrelse av A og B er vist (C, D, henholdsvis). Den presser grensen av en KA er CCHCR1 positive (A) co-lokalisere med EGFR (B). En annen prøve er vist (E) med en fremtredende lymfocytt infiltrere og cytoplasma CCHCR1 uttrykk for kjøregrensecellene. Flere knappe Ki67 uttrykket (F) er definert til de samme områder, men ikke nødvendigvis til de samme celler. Pilene viser tilsvarende stillinger.
Scale barer: product: (A, B, E, F) 50 mikrometer; (C, D) 12,5 mikrometer.
Bowens sykdom og aktiniske keratoser uttrykke CCHCR1 i spongiotic og inflammatoriske områder
spongiose, inflammatorisk infiltrere, og kapillær spredning var assosiert med CCHCR1 uttrykk i 11 /21 Bowens sykdom (SCC in situ) prøver (figur 6A, B). Områder mangler betennelse og spongiose uttrykte mindre CCHCR1 (figur 6C), heller ikke var CCHCR1 uttrykk forbundet med KC atypi. I Bowens sykdom, ble cytoplasma CCHCR1 farging oppstått basalt og suprabasally i dermal papiller (figur 6B) ligner CCHCR1 farging av psoriasis angrepne hud (figur 6E), spesielt i hypertrofiske prøver. Også EGFR uttrykk i Bowens sykdom lignet uttrykket mønster av CCHCR1 (figur 6D). I psoriasis, CCHCR1 uttrykk var mest intens i områder med mindre Ki67 positive KCs (Figur 6F). Åtte av 11 studerte aktiniske prøver keratose (AK) hadde CCHCR1 positiv basal eller suprabasal KCs (figur 6G). CCHCR1-positive celler ble ofte påtreffes i regioner med spongiose eller betennelse.
Deler av Bowens sykdom (A-D) immunfarget med antistoffer mot CCHCR1 og EGFR som angitt. Serie deler av psoriasis (E, F) ble farget med antistoffer for CCHCR1 og Ki67. AK prøver (G, H) ble farget med CCHCR1 antistoffer. I Bowens sykdom (A, B), spongiose, inflammatorisk infiltrat, og kapillær proliferasjon er forbundet med CCHCR1 uttrykk mens områder som mangler betennelse og spongiose uttrykke mindre CCHCR1 (C). EGFR uttrykk (D) i basal og suprabasal KCs av dermal papiller forbinder med CCHCR1 uttrykk (B). Også i psoriasis (E), er CCHCR1 uttrykt basalt eller suprabasally (piler) ligger over den dermale papiller (dp), mens betong- rygger (RR) som rager inn i dermis er nesten negativ for CCHCR1. I motsetning til dette Ki67 uttrykket (F) lokaliserer til regioner som er nesten negativ for CCHCR1 celler (pilspisser). AK prøver (G) uttrykker CCHCR1 basalt og suprabasally i forbindelse med KC heterogenitet, spongiose eller betennelse men tilstøtende områder med mindre betennelse eller spongiose (H) flekk bare svakt.
Scale barer:
(A-D) 50 mikrometer; (E, F) 25 pm; (G, H) 12,5 mikrometer.
Expression of CCHCR1 er oppregulert og korrelerer med Ki67 ekspresjon i kutane SCC cellelinjer
Neste, vi sammenlignet mRNA uttrykk profiler av CCHCR1 , EGFR, Ki67, og cyklin-D1 i forskjellige kutane SCC cellelinjer (fem primære og tre metastatisk), ved å utføre Affymetrix eksperimenter. Oligonukleotidet mikromatrisebasert ekspresjonsprofilen viste at CCHCR1 genet blir uttrykt i SCC-celler (Figur 7A). Signalnivåene for de CCHCR1 sonde settene var opp til 80% høyere i kutan SCC-cellelinjer (n = 8) enn i den normale human epidermal KCs (n = 5), men det var ingen tydelige forskjeller i CCHCR1 ekspresjonsnivåer mellom primær og metastatisk SCC linjer. Ekspresjonsnivåene i SCC cellelinjer var variabel, men de gjennomsnittlige nivåer viste en svak økning (30%; p 0,05) sammenlignet med normal KCs ved kvantitativ sanntids RT-PCR (TaqMan®) (figur 7C). Signalnivåene for de Ki67-probe settene var 3-4 ganger høyere i SCC cellelinjer enn hos normale epidermale KCs (figur 7A). Denne observasjonen ble også bekreftet av TaqMan PCR (figur 7D). Viktigere, uttrykk nivåer av CCHCR1 korrelert med nivåene av Ki67 i microarray data (figur 7B). En svak korrelasjon (r = 0,46) mellom de CCHCR1 og Ki67-mRNA-nivåer ble observert i TaqMan data, samt (figur 7E). Uttrykket nivåer av EGFR-mRNA i SCC cellelinjer var mellom 80% og 180% av den normale KC ekspresjonsnivåer i 4 av 8-probe-sett (figur 7A). Begge cyklin D1-probe settene var til stede i alle cellelinjer, og de midlere signalnivåene var opp til 60% høyere i SCC cellelinjer sammenlignet med normal KCs. CCHCR1 hadde en svak negativ korrelasjon med EGFR ekspresjonsnivået, men ingen korrelasjon mellom CCHCR1 og cyclin-D1 ble påvist (data ikke vist).
A) Ki67, EGFR, cyclin-D1 og CCHCR1 genekspresjon profilen fem normal epidermal KC og åtte kutane SCC cellelinjer (heatmap). Signalverdier av sonden settene ble sammenlignet med de midlere signalverdiene av hver sonde ligger i KCs. Fargingen er basert på log2 verdier av endringen i signalverdiene. De oppregulert genene er vist i rødt og ned-regulert gener er vist i grønt. B) Sammenheng mellom CCHCR1 og Ki67 probe sett ble beregnet mellom signalverdiene av en CCHCR1 og en Ki67 sonde satt i HG-U133 Plus 3.0 array. Pearsons korrelasjonskoeffisient R = 0,88. C) CCHCR1 og D) Ki67 mRNA uttrykk nivåer i normale KCS og kutane SCC cellelinjer som målt ved QRT-PCR (TaqMan). Ekspresjonsnivåene av CCHCR1 og Ki67 i de normale KCS og SCC-cellelinjer ble analysert ved QRT-PCR og korrigert for den p-aktin mRNA-nivåer i de samme prøvene. E) Sammenheng mellom CCHCR1 og Ki67 probe sett ble beregnet mellom signalverdiene av CCHCR1 og Ki67 mRNA nivåer. Pearsons korrelasjonskoeffisient R = 0,46.
okadasyre og menadione downregulate CCHCR1 mRNA uttrykk i HaCaT celler
For å finne ut om ulike bioaktive stoffer endre CCHCR1 mRNA uttrykk, behandlet vi HaCaT celle kulturer med tumorpromotere, oksidativt stress indusere og agenter involvert i psoriasis betennelse. Okadainsyre (OA) og menadion, begge forbindelser vist seg å fremme tumorer in vivo og indusere oksidativt stress, downregulated CCHCR1 mRNA-nivåer i HaCaT-celler inntil 10 ganger med økende dose (OA) og tre ganger (menadion) (figur 8A) . EGFR og Ki67 mRNA nivåer av OA og menadione behandlet HaCaT celler ble nedregulert i tillegg (Figur 8B, C). Menadion eller OA behandlinger ikke vesentlig forandre ekspresjon av hus-holde-genet GAPDH i HaCaT-celler, noe som antyder at disse midler ikke påvirker levedyktigheten av cellene. De tumorpromotere 12-phorbol-13-myristat-acetat (PMA) og staurosporin eller anti-østrogen tamoxifen, H
2o
2 produserer oksidativt stress, leptin, IL-6 eller stafylokokk-endotoksin B, activin eller anisomycin , ikke signifikant påvirker CCHCR1 mRNA-nivåer (data ikke vist).
CCHCR1 (A), Ki67 (B), og EGFR (C) mRNA-ekspresjonsnivåer (Taqman) i HaCaT-celler etter behandling med tumorpromotere OA og menadione. CCHCR1 (D), Ki67 (E) og EGFR (F) mRNA-ekspresjon i HaCaT, A5, II4, RT3, A431, og Fadu celler. De invasive celler II4 og Fadu og metastatisk RT3 celler uttrykte mindre CCHCR1 (D) og Ki67 (E) enn HaCaT og A5 celler. A431-celler (F) uttrykker EGFR mRNA klart mer enn andre cellelinjer. RAS-forvandlet kloner A5, II4, og rT3 og Fadu celler uttrykker EGFR mindre enn HaCaT celler. Kvantitative RT-PCR-resultater er vist i forhold til mRNA-nivåer fra tilsvarende kontrollceller (som er tilordnet verdien 1). Ekspresjonsnivåene av CCHCR1, Ki67, og EGFR i HaCaT-celler ble normalisert til GAPDH mRNA-nivåer i de samme prøvene. * P 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001
CCHCR1 er nedregulert i de mest aggressive kreftcellelinjer
For ytterligere å studere rollen til CCHCR1. i KC transformasjon, sammenlignet vi CCHCR1 mRNA uttrykk i cellelinjer med ulik metastatisk og invasive egenskaper. Basert på kvantitative TaqMan RT-PCR, CCHCR1 og Ki67 uttrykk nivåer var lik i udødelig HaCaT og tumorigent A5 ras-transformerte cellelinjer (figur 8D, E). Men med stigende tumorgenisiteten i ras-transformasjon, invasiv II4 og metastatiske RT3 cellene uttrykte mindre CCHCR1 mRNA, og denne trenden ble også sett med ondartede A431 celler (figur 8D). Tilsvarende Fadu celler som er mer omfattende enn HaCaT og A431-celler [13] uttrykt mindre CCHCR1, Ki67, og EGFR (figur 8D-F). Også Ki67 og EGFR uttrykk redusert med ras-transformasjon (figur 8E, F). Interessant, A431-celler var de eneste celler som uttrykker EGFR til betydelig mer enn HaCaT-celler (figur 8F), Ki67 og CCHCR1 ekspresjon igjen ved et lavere nivå (figur 8D, E).
CCHCR1 mRNA-ekspresjon nedregulert ved keratinocytter er i en raskt prolifererende tilstand
for å studere CCHCR1 mRNA uttrykk i udødelige, men ikke-tumorigene HaCaT celler av ulike proliferative stadier, utførte vi cellekultur eksperimenter i henhold til strategien for Pivarcsi et al. [14]. I våre eksperimenter sammenflytende HaCaT-celler (kontroller) og konfluente celler etter en en-ukes sultende periode (celler tvunget til quiescence) uttrykt CCHCR1 mer enn HaCaT-celler stimulert til å proliferere ved tilsetning av serum til en ikke-sammenflytende subkultur (figur 9A). CCHCR1 uttrykk redusert spesielt i løpet av de første fire dagene. Statusen til cellene (som bekreftet av Ki67 mRNA uttrykk) spredning korrelerte negativt med CCHCR1 uttrykk (figur 9B): Nedgangen i CCHCR1 uttrykk var assosiert med økning i Ki67 uttrykk. Som cellene reattained konfluens, øket ekspresjonen av CCHCR1 igjen til det opprinnelige nivå (figur 9A). En av de fire eksperimentene ble utført ved bruk av enda lavere antall celler. Her viste vi en intens proliferasjon i løpet av de første tidspunkter (24 h og 48 h) som i forhold Ki67-mRNA-ekspresjon økes til 6 ganger sammenlignet med kontrollceller (to sett av kontrollcellene som gir de to verdier rundt verdi 1). Den negative korrelasjonen av CCHCR1 uttrykk med Ki67-ekspresjon var enda mer dyp som relativ CCHCR1 mRNA samtidig redusert til nær null fra de to kontrollcelle-verdier rundt verdi 1 (figur 9D). Interessant, EGFR mRNA-nivåer fulgt CCHCR1 uttrykksmønster i stedet for Ki67 uttrykksmønster (figur 9C, E). Ved å tvinge HaCaT cellene differensieres med høy kalsium medium, uttrykk for CCHCR1 forble uendret målt med TaqMan PCR (data ikke vist), enige med vår forrige data som CCHCR1 mRNA nivåer var ikke endret hos differensiert normal KCs [1]. Involucrin ble anvendt som en differensieringsmarkør for å bekrefte differensiering status for de HaCaT-celler ved kalsium administrering [15].
A) Relativ ekspresjon av mRNA CCHCR1 (målt ved TaqMan) ved forskjellige tidspunkter (fra 24 timers 8 d) etter utgivelsen cellene fra serum sult og høy tetthet dyrkning. Uttrykk for CCHCR1 ikke skiller mellom sammenflytende (kontroll) celler og hvilende (sultet) celler. Kontrollceller uttrykt CCHCR1 2,5 ganger mer enn proliferativ HaCaT celler (24-48 timer, 3-4 d). Som konfluens ble reattained (8 d), ekspresjonen av CCHCR1 økes til samme nivå av kontrollcellene. B) Sammenheng mellom relativ CCHCR1 og Ki67 uttrykk nivåer. Når CCHCR1 mRNA-ekspresjonsnivåer ble sammenlignet med de av Ki67, ble en negativ korrelasjon sett, noe som bekrefter den proliferative status for HaCaT-celler. C) EGFR mRNA uttrykk korrelert med CCHCR1 mRNA uttrykk. D) Sammenheng mellom CCHCR1 og Ki67 ekspresjon i forsøket med lavere celletetthet. Den negative korrelasjonen av CCHCR1 uttrykk med Ki67-ekspresjon var enda mer dyp som relativ CCHCR1 mRNA ble redusert til nær null i de to kontrollcellene. E) Sammenheng mellom CCHCR1 og EGFR uttrykk i forsøket med lavere celletetthet. Her igjen, CCHCR1 uttrykk korrelert med EGFR uttrykk. TaqMan PCR Resultatene er vist i forhold til mRNA-nivåer fra tilsvarende kontrollceller som er tilordnet verdien 1. Expression nivåer av CCHCR1, Ki67, og EGFR i HaCaT-celler ble normalisert til GAPDH mRNA-nivåer i de samme prøvene. * P 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001
Diskusjoner
Våre resultater som presenteres her viser at CCHCR1, en kandidat genet for psoriasis, ble uttrykt. i de fleste SCCS, BCC og KAs studert, noe som tyder på at CCHCR1 kan ha en rolle ikke bare i KC spredning, men også i transformasjon. EGFR-ekspresjon korrelerte med CCHCR1 uttrykk, og cyclin-D1, en nedstrøms mål av EGFR og en positiv regulator av cellesyklusprogresjon [16], ble også funnet uttrykt i de samme områdene. I normale epidermis er både EGFR og CCHCR1 uttrykt basalt [4], [8] (figur 1). Ekspresjon av EGFR, «en overlevelsesfaktor for tumorceller», er også ansett å være nødvendig for å opprettholde KCs i en proliferativ tilstand [8]. Vi postulere at EGFR kan regulere CCHCR1 uttrykk som vi har nylig vist at EGF stimulering oppregulerer CCHCR1 protein uttrykk [2]. Våre eksperimenter her med transfekterte HaCaT-celler foreslått at overekspresjon av CCHCR1 ikke regulere EGFR-ekspresjon.
I henhold til våre funn transform KCs har en annen CCHCR1 status i sammenheng med hyperproliferasjon Ki67 status sammenlignet med ikke-tumorigen KCs. Til forskjell fra den godartet hyperproliferative uorden psoriasis ([1] Figur 6E-F), uttrykk for den hyper Ki67 ble demonstrert her i de samme områdene som CCHCR1 uttrykk ved invasiv foran SCCS. Vi har tidligere vist at i bryst og lunge adenokarsinomer, CCHCR1 positive celler er Ki67 negative [1], men dette avviket kan skyldes forskjeller mellom adenokarsinom og SCC celler websiden organ for kreft. Den positive korrelasjonen med CCHCR1 og Ki67 ekspresjon i hudkreft ble støttet av uttrykket profilering av kutane SCC cellelinjer. Men det var negativ korrelasjon med CCHCR1 og EGFR-ekspresjon i disse samme cellelinjer, så vel som i invasive Fadu tumorceller [17], som tyder på at EGFR transkripsjon ble hemmet. Dette kan imidlertid reflektere annerledes EGFR-varianter undersøkt, siden spesifikk probe for variant 2 syntes å være mer downregulated enn variant 1 eller sonder gjenkjenne alle varianter.
Til tross for positive CCHCR1 og Ki67 ekspresjon in vivo i hudkreft og i Affymetrix analyse av SCC cellelinjer, viser vi at CCHCR1 og Ki67-mRNA er nedregulert i dyrkede celler med stigende transformasjon og også i ikke-tumorigene HaCaT-celler behandlet med forbindelser som fremmer tumorer in vivo. Metastatisk RT3 og invasive II4-celler uttrykte CCHCR1 og Ki67 mindre enn tumorigen A5 og udødelig HaCaT-celler, noe som tyder på at CCHCR1 og Ki67 ekspresjon øker omvendt proporsjonalt med nivået av ras-transformasjon. Tilsvarende ble EGFR-ekspresjon nedregulert i alle ras-transformerte celler, selv i A5-celler. CCHCR1 mRNA ble også redusert i de invasive Fadu cellene sammenlignet med A431 korrelere med oppregulering av EGFR fra Fadu til A431-celler. Høy EGFR uttrykk i A431 celler sammenlignet med Fadu celler er enig med tidligere studier [17]. Videre i SCCS, den CCHCR1 farging var heterogen i atypic celler – mange atypic celler var også blottet for Ki67
tumorpromotere OA og menadione downregulated uttrykk for CCHCR1, Ki67, og EGFR mRNA i HaCaT celler.. OA inhiberer serin /treonin-spesifikke protein fosfataser, inkludert protein fosfataser 1, 2A, og PP3 [18] og aktiverer cellulære ERK1 /2, JNK og p38 MAPK signalveier og AP-1 transkripsjonsfaktorer [19] – [21], i tillegg for å aktivere Akt-1, et pro-overlevelse serin-treonin-kinase [22]. Menadione hemmer protein tyrosin fosfataser aktive ErbB2 som er overuttrykt i BCC og nedregulert i SCC i forhold til normal epidermis [23]. Interessant nok har EGFR-aktivitet blitt implisert i OA-indusert karsinogenese og menadion-indusert aktivering ErbB2 [24], [25]. Videre er EGFR blitt rapportert å aktivere ERK1 /2 og Akt i SCC [10].
Ultrafiolett stråling er en av de viktigste faktorene som predisponerer for hudkreft og er også kjent for å aktivere EGFR [9]. Vi har ikke funnet signifikante endringer i CCHCR1 mRNA nivåer i HaCaT celler dyrket i ulike perioder etter UVA /UVB-stråling (Suomela, Latonen og Saarialho-Kere, upubliserte data). Vi kunne ikke påvise noen effekt på H
2o
2 (fremstilling av oksidativt stress) på CCHCR1 mRNA ekspresjon heller, selv om også OA samt menadion er kjent for å indusere dannelsen av reaktive oksygenarter og lipidperoksidasjon på udødeliggjort celle linjer [26], [27], noe som tyder på at oksidativt stress var ikke involvert i samspillet mellom OA og CCHCR1.
til slutt viser vi at i HaCaT celler, redusert CCHCR1 uttrykk med spredning, i henhold til vår tidligere rapporter [1], [3], [4]. Etter vekkende spredning i HaCaT-celler som tidligere beskrevet [14], den mer proliferative de ikke-tumorigene HaCaT-celler ble, jo mindre CCHCR1 ble uttrykt. Interessant, EGFR mRNA uttrykk fulgte av CCHCR1 mRNA uttrykk snarere enn Ki67 uttrykk, noe som tyder på en felles up-stream effektor i signalveier. Vi kan imidlertid ikke i denne innstillingen utelukke effekten av celle konfluens alene på CCHCR1 uttrykk som det påvirker også spredning av HaCaT celler.
Ondartet transformasjon av psoriasis angrepne KCs er svært uvanlig tross for ukontrollert KC spredning og co -existence av kronisk betennelse. Grunnen til beskyttelse mot utvikling av kreft er fortsatt uklar. Reduserte AP-1-nivåer i psoriasis KCs har blitt foreslått som en forklaring [28], [29]. AP-1-mediert veien er også involvert i EGFR aktivering fører til KC hyper [5]. Når CCHCR1 transgen risiko mus, med downregulated vitamin D reseptor [30], ble såret og PMA-behandlet, KC spredning ble redusert [3], noe som tyder på mindre aktive AP-en eller STAT3 signalering. Videre, vitamin D, et medikament som brukes i behandlingen av psoriasis, nedregulerer EGFR og cyclin-D1 [31]. CCHCR1 er også blitt foreslått å regulere migrasjon av RNA-polymerase II subenhet 3 (RPB3) [32], som aktiverer den aktiverende transkripsjonsfaktor 4 (ATF4 eller CREB2) [31] assosiere med vekststans [34], [35], og å være i stand til å danne heterodimerer med medlemmer av AP-1-familien. Denne studien impliserer at CCHCR1, en kandidat genet for psoriasis, har en funksjon i KC biologi også i ondartet transformasjon. [14].
