Abstract
Bakgrunn og formål
Ashwagandha er en populær ayurvedisk urt som brukes i indisk tradisjonell hjem medisin. Det har blitt tildelt en rekke helsefremmende effektene av disse mekanismene er fortsatt ukjent. Vi har tidligere rapportert den selektive drap av kreftceller ved blad ekstrakt av Ashwagandha (i-ekstrakt) og renset komponent Withanone. I denne studien undersøkte vi den mekanismen tap-av-funksjon screening (oppheving av i-ekstrakt indusert kreft celledreping) av mobiltelefon mål og gen veier.
metodikk /hovedfunnene
Randomisert Ribozyme bibliotek ble innført i kreftceller før behandling med i-ekstrakt. Ribozymer ble gjenvunnet fra celler som overlevde i-Extract behandling. Gene mål for de valgte ribozymer (som spådd av database-søk) ble analysert ved bioinformatikk og sti analyser. Målene ble validert for deres rolle i i-ekstrakt indusert selektiv avliving av kreftceller ved biokjemiske og molekylær analyser. Femten gen-mål ble identifisert og undersøkt for sin rolle i spesifikke kreftcelledreping aktiviteten i-ekstrakt og sine to hovedkomponenter (Withaferin A og Withanone) ved å gjennomføre den shRNA-mediert genet Slå tilnærming. Bioinformatikk på de valgte gen-mål avslørte involvering av p53, apoptose og insulin /IGF signalveier knyttet til ROS signalering. Vi undersøkte involvering av ROS-signalkomponenter (ROS-nivåer, DNA-skade, mitokondriestruktur og membranpotensiale) og viser at den selektive drap av kreftceller er mediert ved induksjon av oksidativt stress.
Konklusjon
ashwagandha blad ekstrakt og Withanone forårsake selektiv avliving av kreftceller ved induksjon av ROS-signalisering og dermed er potensielle reagenser som kan bli rekruttert til ROS-mediert kreft kjemoterapi
Citation. Widodo N, Priyandoko D, Shah N, Wadhwa R, Kaul SC (2010) Selektiv Killing av kreftceller ved ashwagandha Leaf Extract og dens Component Withanone innebærer ROS signalering. PLoS ONE 5 (10): e13536. doi: 10,1371 /journal.pone.0013536
Redaktør: Vladimir N. Uversky, Indiana University, USA
mottatt: 20 juli 2010; Godkjent: 23 september 2010; Publisert: 21 oktober 2010
Copyright: © 2010 Widodo et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet delvis med tilskudd fra New Energy and Industrial Technology Development Organization (Japan). N. S. er en mottaker av MEXT stipend, Japan. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Indian tradisjonelle hjem medisin system, er Ayurveda kjent for sin eldste historie i verden. Ashwagandha (
Withania somnifera
; solanaceae) urt, stolt kalt dronningen av Ayurveda, er en av de mest brukte planter i Ayurveda for en rekke effekter som spenner fra smertestillende, snerpende, adaptogen, anti-inflammatorisk, anti påkjenningen, krampeløsende, anti-diabetes, immun-stimulerende og kardio [1] – [4]. Utdrag fra ulike deler av anlegget inkludert rot, skyte, frø og bær har vært i bruk i ulike hjem middel oppskrifter; root er spesielt en felles kilde for helsefremmende alkaloider, withanolides og antioksidanter. De viktigste aktive bestanddeler av Ashwagandha bladene er alkaloider og steroide laktoner (vanligvis kjent som withanolides) [5] – [7]. Vi hadde tidligere undersøkt biologisk aktivitet i en alkoholisert ekstrakt av Ashwagandha blad ekstrakt (i-ekstrakt) og vist at den har en sterk anti-kreft aktivitet. Ved kjemisk fraksjonering, ble aktiviteten tilordnet til dets bestanddeler Withanone (i-Factor) som ble vist å forårsake aktivering av p53 tumor suppressor protein i kreftceller eneste [8], [9]. Normale humane fibroblaster viste nedregulering av p53-funksjon og forsinket senescence [10].
I denne studien har vi forventet at den selektive kreftcelle-drepende effekt av i-ekstrakt eller Withanone er sannsynlig å bli formidlet av mer enn én gener /trasé og dermed foretok en objektiv tap-av-funksjon tilnærming der genet knockdown ble oppnådd ved hammer ribozymer. Ribozyme befolkning reddet fra randomiserte Ribozyme bibliotek-infiserte humane brystkreftceller som overlevde i-Extract behandling ble karakterisert. Bioinformatikk, biokjemiske og visuelle analyser ble benyttet for å undersøke de identifiserte genet mål og å avdekke deres engasjement i i-Extract-indusert kreft celle drap. Vi viser at den selektive drap av kreftceller fra i-ekstrakt og dens komponent Withanone innebærer ROS signalering.
Diskusjon
Hammer ribozymer (HH-RZ)
Resultater og er de små katalytiske RNA som besitter konservert hammer som sekundærstruktur. De kaster inn i den aktive konformasjon ved binding til metallioner og hydrolysere fosfodiesterbindinger av RNA-tråder på bestemte områder (NUX, der N kan være en hvilken som helst nukleotid og X kan være A, C eller U) og dermed er kjent som «RNA-saks» [ ,,,0],11], [12]. HH-Rz har vært i bruk som generasjo- Silencing verktøy på grunn av sine funksjoner som høy underlaget bindende spesifisitet, autokatalytisk aktivitet som ikke krever andre enzymer, fleksibel struktur som tillater manipulering og mangel på interferon respons i pattedyrceller [13], [ ,,,0],14]. For å generere et gen spesifikk ribozym, er dens gjenkjenningsarmer (7-9 nukleotider som flankerer målstedet) utformet for å inkludere sekvens som er komplementær til mål-mRNA. Randomisering av disse 7-9 nukleotider i hver arm gir et stort utvalg av ribozym i stand til å sikte på flere mRNA substrater [11]. Et slikt basseng av degenererte ribozymer uttrykt fra et eksogent promoter er blitt brukt som et verktøy for identifikasjon av gener som er involvert i apoptose, migrering, invasjon, differensiering og sykdommer [15] – [20]. For å identifisere den cellulære mål som er involvert i kreftcellen cytotoxity av Ashwagandha blad ekstrakt (i-ekstrakt), infiserte vi MCF7 celler med retrovirus drevet randomisert bibliotek ribozym før behandlingen. Som vist i figur 1, når vektorinfiserte (kontroll) celler behandlet med i-ekstrakt resulterte i celledød, ribozym bibliotek infiserte kulturen viste celleoverlevelse. Ribozymer ble reddet fra disse overlevende cellepopulasjon og karakterisert ved hjelp av kloning og sekvensanalyse. Gene mål for de isolerte ribozym sekvensene ble bestemt ved databasesøk (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). De potensielle genet målene for ribozym sekvenser som ble isolert flere ganger er oppført i figur 1C. For å validere involvering av disse genene i i-ekstrakt indusert kreft celledreping, foretok vi to-veis-analyser (i) genet bestemt shRNA-mediert taushet (ii) bioinformatikk og systembiologi rettet sti etterforskning. Vi forberedte 7 genet (IGF2R, SREBF2, AKAP11, TFAP2A, LHX3, TPX2 og ING1) bestemte shRNAs og undersøkt deres engasjement i i-ekstrakt og komponentene (Withanone og Withaferin A) indusert MCF7- celle drap. Selv under effektiviteten av transfeksjon i området fra 40-60%, som bestemt ved transfeksjon av en GFP-uttrykkende plasmid, tie av fire gener (Gruppe 1 – TPX2, ING1, TFAP2A og LHX3) ble assosiert med betydelig (20-40%) økning i celleoverlevelse etter den i-Extract behandling (figur 2). De tre andre gener (gruppe 2 – IGF2R, SREBF2 og AKAP11) viste bare mindre (2-8%) økning i overlevelse. Videre celler kompromittert for ekspresjon av fire gruppe 1 gener unnsluppet den cytotoksiske effekt av både Withanone og Withaferin A. Disse data antydet at disse fire genene medierer cytotoksisitet i-ekstrakt. De kan imidlertid ikke være kritisk involvert i selektiv toksisitet av i-ekstrakt og Withanone til kreftceller, som beskrevet i våre tidligere studier som viser at involvering av p53 tumor suppressor vei i dette fenomenet [8]. Disse data indikerte at kreftcelledreping av i-ekstrakt ble mediert, i det minste delvis, ved TPX2, ING1, TFAP2A og LHX3. TPX2 er et mikrotubulus-assosiert protein som fungerer som en allosterisk regulator for Aurora-A, et onkogen med essensiell rolle i sentrosomen modning og kromosom segregering under mitose som krever montering og vedlikehold av en bipolar spindel [21] – [23]. Det er overuttrykt i mange humane kreftformer og har vært foreslått som en attraktiv anti-kreft target [24]. TFAP2A spiller avgjørende rolle i tumorvekst og progresjon ved regulering av E-cadherin, MMP-2, c-kit, p21
WAF-en, HER-2, BCL-2, insulinliknende vekstfaktor-reseptor-en og Smad signale [25]. LHX3 er en homeodomain transkripsjonsfaktor og spiller positiv rolle i fosterutviklingen, celle skjebne besluttsomhet og onkogenese [26], [27]. På den annen side, ING1, en ING familie proteiner, er involvert i humane cellealdring, tumor suppresjon og apoptose [28], [29]. ING1 er blitt vist å modulere p53 aktivitet og nedstrøms effektorer, p21
WAF1 og Bax ved acetylering og stabilisering [30]. Til sammen foreslått dataene som kreftcellen drapet av i-ekstrakt kan innebære undertrykking av TPX2, TFAP2A og LHX3, og aktivering av ING1 funksjoner; mekanismen og selektivitet til kreftceller fortsatt remian uklart.
Skjematisk fremstilling av tap-av-funksjon screening ved hjelp av randomiserte Ribozyme bibliotek. Kontrollceller behandlet med i-ekstrakt viste cytotoksisitet (
A
). i-ekstrakt behandlet overlevende celler ble samlet (
B
). Ribozymer ble reddet fra de overlevende celler ved kloning og var preget av sekvensanalyse (
B
). Kandidat genet mål er vist i (
C
).
Celler ble transfektert med vektorer som uttrykker shRNA for angitt gener. Effekten av i-ekstrakt ble evaluert ved analyse av cellenes levedyktighet. Resultatene representerer gjennomsnittet av tre forsøk. Statistisk signifikans ble beregnet ved variansanalyse (ANOVA) test.
For å identifisere viktige cellulære mål, vi neste foretok bioinformatikk og systembiologi tilnærming og undersøkt nettverket /veier av de identifiserte genet målene beskrevet ovenfor (figur 3). Analysene viste involvering av isolerte genet mål i flere typer av biologiske prosesser som, onkogenese, cellesyklus, DNA-reparasjon og nucleic acid metabolism (figur 3A). De to øverste identifiserte trasé var p53 tumor suppressor (gene mål – DDB2, CDKN1A, CDKN2B) og apoptose (gen mål – IGF2R og HSPA9). Av notatet, analysene viste at 33% av de som er involvert i p53 sti og regulering, og 7% av de som er involvert i apoptose gener gener ble identifisert som tyder på at celledreping av i-ekstrakt innebærer vekst arrest eller apoptose, mediert av aktivering av tumor suppressor p53 veien. I tillegg Ras, insulin /IGF, angiogenese og cytoskjelettet regulering trasé som er tett knyttet til apoptose og tumor utvikling ble også identifisert. Resultatene viste at ved å stanse all målgener oppheve i-Extract mediert celledreping ved å beskytte cellene mot DNA-skader, cellesyklus og apoptose. Network interaksjon analyse av målgener unnfanget fire gensamlingene – CDK4, TFAP2A, CDKN1A-p21 og ING1 koblet av p53 og PCNA. Involvering av disse gensamlingene under i-ekstrakt indusert cytotoksisitet tyder på at det kan karakteriseres som cellulære responser, inkludert stressrespons (HSPA9, CDKN1A) og DNA-skade og reparasjon respons (ING1, DDB2 og TFAP2A), som kulminerte i enten cellesyklus arrest eller apoptose (figur 3D). Basert på disse parametrene identifisert av bioinformatikk analyse, spådde vi at i-ekstrakt kan føre til en aktivering av cellulært stress signale av ROS-mediert trasé initiert på to nivåer (i) mitokondrie belastning som fører til endringer i membranpotensial og (ii) DNA-skader belastning som fører til aktivering av DNA-skade og reparasjon av veier (figur 3E). Av notatet, de fleste av de identifiserte genet målene så ut til å passe inn i den anslåtte signalveier (Figur 3E). For å teste denne hypotesen, undersøkte vi om CDKNIA-p21 er kritisk regulator av i-Extract mediert kreftcelle drapet. Som vist i figur 4, ble i-ekstrakt mediert vekstarrest i MCF7-celler (figur 4A) forbundet med en aktivering av CDKN1A-p21 (figur 4B). Vi har også undersøkt for å undersøke om CDKN1A-p21 var en kritisk formidler av i-ekstrakt indusert selektiv kreftcelle drapet. Som vist i figurene 4B og 4C, mens CDKN1A-p21 ble øket i MCF7-celler, forble uforandret hos normale (TIG-3) -celler i respons til enten i-ekstrakt eller Withanone behandling. I motsetning til dette Withaferin A forårsaket cytotoksisitet overfor både kreft og normal celle og ble sett til å aktivere CDKN1A-p21 (figur 4C). Vi undersøkte neste aktiveringen av CDKN1A-p21 i kontroll og i-ekstrakt behandlede MCF7-celler etter transfeksjonene av fire shRNAs som avskaffet i-ekstrakt indusert MCF7 celledreping, i det minste delvis (figur 2). Som vist i figur 4D og 4E, fant vi at i-Extract indusert økning i CDKN1A-p21 uttrykk ble opphevet ved knockdown av hver av disse fire mål gener. Disse dataene viste at CDKN1A-p21 er en kritisk formidler av i-ekstrakt indusert selektiv vekst arrest i kreftceller. Vi endelig testet denne hypotesen ved å ansette isogen p53
+ /+, p53
– /-, p21
+ /+ og p21
– /- HCT116 tykktarmskreftceller. Vi har funnet at mens p53
+ /+ og p53
– /- celler som viste sammenlignbar følsomhet for i-ekstrakt (data ikke vist), de p21
– /- celler som var to til tre ganger mer tolerante overfor i-Extract behandling sammenlignet med det p21
+ /+ celler (figur 4F) som tegner seg at CDKN1A-p21 er faktisk en viktig formidler av de vekststans forårsaket av i-ekstrakt i kreftceller. Dataene var i samsvar med vår modell foreslått i figur 3E.
De biologiske prosessene som var involvert i i-ekstrakt mediert celledød ble spådd å inkludere onkogenese, celledeling og cellesyklus (
A
) og involvert p53, apoptose, og insulin /IGF signalveier (
B
). De fleste dominerende blant disse banene var p53 og apoptose (
C
). Målgenene dukket opp som fire klynger (CDK4, p21, ING1 og TFAP2A) som ble koblet sammen med p53 og PCNA, involvert i cellesyklus, DNA skade respons og DNA-reparasjon genet (
D
). Basert på de valgte genet målene, ble det spådd at i-Extract mediert kreft celledød involvert ROS- mediert skade på DNA og mitokondrie nivå med CDKN1A som en kritisk megler (
E
).
i-Extract indusert vekst arrestasjonen av MCF7 celler skyldtes at de ble arrestert på G2 cellesyklus fase (
A
). En økning i CDKN1A-p21 uttrykk ble sett i MCF7 celler ved behandling med i-ekstrakt og Withanone. Ingen økning i CDKN1A-p21 uttrykk ble sett i normale celler i nærvær av enten i-ekstrakt eller Withanone (
B Hotell og
C
). Knockdown av hver av de fire angitte gener som kompromitterte i-Extract indusert cytotoksisitet også falt i-Extract indusert CDKN1A-p21 oppregulering (
D Hotell og
E
). HCT116 p21
– /- cellene var mindre følsomme for i-Extract i forhold til deres isogen p21
+ /+ celler. Celleviabilitet i respons til serielt økende konsentrasjoner av i-Extract (
F
).
Som spådd av sti-analyse (figur 3E), vi neste undersøkt involvering av DNA-skader og reparasjon-signalveien i i-ekstrakt indusert kreft celle drap. Som vist, MCF7 celler viste induksjon av γH2AX (en tidlig markør for DNA-skade respons) som svar på behandlingen med i-ekstrakt, Withaferin A og Withanone (figurene 5A og 5B). Vi har også undersøkt fosforyleringen av γH2AX ved farging med en fosforylering spesifikt antistoff og funnet at antallet celler inneholdende fosforylert γH2AX var 70% høyere i i-Extract behandlede celler sammenlignet med kontrollgruppen (figur 5B). Mens Withaferin En behandling indusert γH2AX i både normale celler og kreftceller, i-ekstrakt og Withanone indusert γH2AX bare i kreftceller (figur 5A og 5C). Samlet utgjør disse dataene viste at selektiv kreftcelledreping av i-ekstrakt og Withanone ble formidlet av induksjon av DNA-skader og CDKN1A-p21, som spådd i Figur 3E.
DNA-skader foci (
A
), induksjon og γH2AX fosforylering (
B
) -assessed ved farging med fosfor-spesifikt antistoff (100-200 celler per lysbilde ble telt) ble påvist i MCF7 celler behandlet med i-ekstrakt, Withaferin A og Withanone. Normale celler viste DNA-skader respons på behandling med kun Withaferin A (
A Hotell og
C
).
Vi neste undersøkte involvering av stressrespons initiert mitokondriene i i-ekstrakt indusert MCF7- celle drap. Som vist i figurene 6A og 6B, induksjon av ROS i nærvær av i-ekstrakt ble påvist av både immunfarging og fluorescens Probe (HPF) metoder. I samsvar med cytotoksisiteten av de to komponenter (A og Withaferin Withanone) i i-ekstrakt, ble ROS induksjon detektert av begge komponentene i MCF7-celler, og bare ved å Withaferin A i TIG-3-celler. Disse dataene viste at behandlingen med i-ekstrakt og Withanone fører til induksjon av ROS, selektivt i kreftceller, og dermed kunne være ansvarlig for selektiv kreftcelle drapet. Vi neste analysert mitokondriemembranen potensialet som er sterkt påvirket av ROS nivåer. Som vist i figurene 6C og 6D, var det en reduksjon i mitokondriemembranpotensialet i MCF7-celler som ses av både JC-1-farging og Rho-123 utelukkelse analysen. Ved behandling med i-ekstrakt, MCF7 celler viste skifte i JC-1 flekker fra rødt til grønt (figur 6C) og negative for Rho-123 farging. Av notatet, normal (TIG-3) celler var refraktære til disse endringene når de ble behandlet med enten i-ekstrakt eller Withanone (figur 6C). Disse dataene har gjort oss til å tro at i-Extract indusert selektiv avliving av kreftceller involvert ROS stress og mitokondriell skade. For å få mer klare bevis, undersøkte vi ultrastructure av kontroll og i-ekstrakt behandlet MCF7 celler på enkeltcellenivå. Som vist i figur 6E, tak MCF7 celler viste typisk mitokondriell morfologi, karakterisert ved en dobbeltmembran inneholdende en homogen grunnmasse og et system av parallelle cristae. Withanone behandlede celler viste hovne mitokondrier med en endret morfologi som forkorte og reduksjon i antall cristae var tydelige (figur 6E).
MCF7 celler viste induksjon av ROS når de ble behandlet med i-ekstrakt, Withaferin A eller Withanone (
A Hotell og
B
). Normale celler viste ROS-induksjon bare i nærvær av Withaferin A (
A
). Tap av mitokondriemembranen potensial i MCF7 kreftceller, som sett av JC-1 farging ble påvist med i-ekstrakt bare (
C
). Preferensiell induksjon av tap av mitokondriell trans-membranpotensialet i MCF7-celler detektert ved strømningscytometri ved bruk av RHO-123 økte fra 0,2% av befolkningen i kontrollen til 44% av populasjonen ble behandlet med i-ekstrakt (
D
). Mitokondrieskade ble oppdaget i Withanone behandlet MCF7 celler. (
E
), transmisjonselektron mikroskopiske bilder av kontroll og Withanone-behandlet MCF7 celler. Kontrollceller viste normal langstrakt mitokondrie (M) med parallell cristae (a) (forstørret eske bilde,
b
), Withanone-behandlede celler som viser hovne mitokondrier med redusert antall av cristae (c) (forstørret boxed bilde,
d
). N, Nucleus.
ROS er kjemisk reaktive molekyler som har vesentlig rolle i signaltransduksjon, cellevekst og differensiering, regulering av enzymaktivitet og immunrespons inkludert betennelse og cytokin produksjon. Mens en moderat økning i ROS fremmer celle proliferasjon og differensiering, bevirker dens overdreven mengde irreversibel oksidativ skade på DNA, proteiner og lipider som fører til celledød. Kreftceller ofte utviser høy oksidativt stress og økt produksjon av reaktive oksygenarter (ROS) som i forhold til de normale motstykker. Denne høyere nivå av ROS fungerer som en selektiv terapeutisk mål ved å gjøre kreftcellene sårbare for ROS-produserende reagenser, foreslått som kjemoterapeutiske reagenser [31]. Et lite antall studier har presentert bevis for det ROS- mediert selektiv avliving av kreftceller. Disse inkluderer, selektiv apoptose i kreftceller ved avokado ekstrakt [32], beta-fenyletyl-isotiocyanat (PEITC) [33], thalidomid-analoger [34] og MKT077 [35] – [36]. Interessant nok har de fleste av disse reagensene er blitt vist å forårsake mitokondriell dysfunksjon [31] – [39]. Vi har vist, for første gang, at Ashwagandha blad ekstrakt (i-ekstrakt) og komponent, Withanone fungere som ROS-produserende agenter forårsaker DNA og mitokondriell skade discriminately til kreftceller, og dermed er gode kandidater for sikker kreftbehandling.
Materialer og metoder
Cells og randomisert hammer Ribozyme bibliotek screening
Menneskelige normale fibroblaster (TIG-3), brystkreft (MCF7), tykktarmskreft (HCT116- p53
+ /+, p53
– /-, p21
+ /+ og p21
– /-) og mus emballasje celler, PLAT-E ble hentet fra japansk Innsamling av forsknings Bioressurser (JCRB) Cell Bank og dyrkes i Dulbeccos modifiserte Eagles minimale essensielle medium (DMEM) som tidligere beskrevet [8] – [10]. Cellene ble behandlet med i-ekstrakt, Withanone og Withaferin A i 48-72 timer for levedyktighet, biokjemiske og visuelle analyser. Randomisert Ribozyme bibliotek (PMX-puro /Rz) ble fremstilt og infisert i MCF7 celler som beskrevet tidligere [15]. Infiserte celler ble utvalgt i puromycin (2 ug /ml) -supplemented medium i 24-48 timer og ble deretter behandlet med i-ekstrakt. RNA ble dannet, ved hjelp Isogen (Invitrogen), fra overlevende celler etter 4-5 dager når alle cellene i kontroll tallerken hadde dødd. Total RNA (2 pg) ble brukt for RT-PCR. Revers transkripsjon ble utført med lavere primer (5′-TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTG GTA C-3 «) og MMLV transkriptase (42 ° C, 90 min) og RT-produkt ble underkastet PCR-amplifisering ved bruk av øvre (5» -tcc CCG GTT CGA aAC CGG GCA-3 «), og lavere primere (94 ° -52 ° -72 ° /30 sek hver, 20 sykluser). Den forsterkede PCR produkt (~150 bp) ble klonet inn i en TA-kloning vektor (Promega) og sekvensert ved hjelp av T7 primer.
Gene spesifikk shRNA-vektor kloning
shRNA ekspresjonsvektorer for 7 gener (IGF2R, SREBF2, AKAP11, TFAP2A, LHX3, TPX2 og ING1) ble fremstilt som beskrevet [15]. To målsetene ble valgt for hver av genet. Målet sekvenser som er valgt for ING1 var ATATGAAGTTTAAATTCTA og GCCAAGACCTCCAAGAAGA, for TPX2 var GCAAGAAGGATGATATTAA og GGGGAAGAATGGAACTGGA, for TFAP2A var GGAGGAAGATCTTTAAGAG og GATCAAACTGTAATTAAGA, for AKAP11 var GAGTGAAGCTTTATCAAAT og GCACAAACATGGAAAGTCA, for SREBF2 var GCCTCAACCTCAAACTCAG og ATGCAAAGGTCAAAGATGA, for LHX3 var GCGACGAGTTCTACCTCAT og GGGAGAGCGTTTACTGCAA, og for IGF2R var GGCAGAAACCCAAACTGAA og GGAGGAAATACTACATTAA.
Celleviabilitet analysen
Menneske brystkreft (MCF-7) celler ble transfektert med 50 ng av den angitte plasmid DNA. Etter 24 timer ble cellene behandlet med i-ekstrakt (6 ug /ml), Withaferin A (1 uM), Withanone (25 ug /ml) i 48 timer. Tom shRNA vektor ble anvendt som en kontroll. Levedyktighet av celler ble overvåket ved WST-baserte celleproliferasjonsanalyse (Roche). Dosene for i-ekstrakt og Withanone ble valgt basert på selektiv avliving av kreftceller som beskrevet tidligere (8-10). Lavere doser av i-ekstrakt og Withanone ble sett å indusere differensiering av glioblastom og neuroblastom celler [40, og data ikke vist].
Western blotting
Hele cellelysat (10-20 ug) i NP40 lyseringsbuffer erholdt ved sentrifugering ved 10 000 rpm i 20 minutter ved 4 ° C ble anvendt for immunblotting som beskrevet [8]. Antistoffer som ble brukt var p53 (DO-1, Santa Cruz Biotechnology), anti-mortalin [8], p21 (C-19, Santa Cruz Biotechnology) og anti-γH2AX-Fosforylert (Ser139) antistoff (Biolegend)
Immunfarging
Cellene ble vasket med fosfatbufret saltvann (PBS), fiksert med metanol: aceton (01:01), permeabilisert i 0,2% PBST, blokkert med 2% BSA (bovint serumalbumin) /PBS og inkubert med første og andre antistoff fortynnet i 2% BSA /PBS [8]. For γH2AX farging ble cellene fiksert med 4% formaldehyd og permeabilisert med KCM-oppløsning (120 mM KCl, 20 mM NaCl, 10 mM Tris pH 7,5, 0,1% Triton). Blokkering og antistoffpreparat ble utført i Abdil oppløsning (2% BSA, 0,2% gelatin, 150 mM NaCl, 0,1% Triton X-100, 20 mM Tris pH 7,5, 0,1% natriumazid i MilliQ vann).
påvisning av reaktive oksygenforbindelser
de reaktive oksygenforbindelser ble oppdaget av fluorescerende farge bruke bilde-iT ™ LIVE Grønne reaktive oksygen arter (ROS) Detection Kit (molekylære prober Inc, USA). Celler ble dyrket på dekkglass plassert i 12-brønners plater og som ble behandlet med den angitte reagenser i 48 timer og farget for ROS å følge fremgangsmåten som anbefales av produsentene. Kvantifisering av ROS produksjon med FACS-analyse var basert på HPF (2- [6- (4′-hydroksy) fenoksy-3H-xanthen-3-0n-9-yl] benzosyre) fluorescens. Kort sagt ble MCF-7-celler dyrket i 6-cm tallerken inntil 50% konfluens, ble behandlet med i-ekstrakt i 12 timer, etterfulgt av tilsetning av HPF (10 mM). Etter 4 timer ble cellene vasket med PBS, høstet med celleskrape. Cell fluorescens ble målt ved Coulter Epic XL Flowcytometer (Beckman).
Mitokondriell membranpotensialet
Mitokondriell membranpotensialet for kontroll og behandlede celler ble undersøkt av JC-1 og RHO-123 [35] baserte celle-flekker analyser. For JC-1-farging, MCF7-celler dyrket i 24-brønners plater (50-60% konfluens), ble behandlet med i-ekstrakt i 48 timer, etterfulgt av inkubasjon med JC-1 flekk (10 ug /ml) i 15 minutter ved 37 ° C i CO
2 inkubator. Cellene ble vasket med PBS og behandlet for mikroskopi. For RHO-123 analysen ble MCF-7 celle dyrket i 6 cm-tallerken inntil 50% konfluens, ble behandlet med i-ekstrakt i 48 timer. De behandlede celler ble inkubert med Rho123 (1 mM) -supplemented medium i 1 time. Cellene ble vasket med PBS og høstet med celleskrape. Endringer i mitokondrienes membranpotensiale ble overvåket av Coulter Epic XL Flowcytometer (Beckman).
Enkelt celle ultrastructural analyse
MCF7 celler ble sådd ut på dekkglass. Ved 60% konfluens ble cellene behandlet med Withanone i 24 timer. Kontroll og behandlede celler ble vasket med PBS og deretter fiksert med 1,2% glutarldehyde i 4 ° C i 1 time. Etter etterfiksering med 1% OsO
4 ved 4 ° C i 1 time, ble cellene vasket i PBS og dehydrert gjennom graderte etanolkonsentrasjoner med endelig inkubering i n-Butyl glycidyel ether i 15 minutter. Prøvene ble innebygd i Epoxy harpiks (TAAB) og ble skåret i ultra-tynne snitt med en Reichert ultramicrotome (Leica). Seksjonene ble farget med uranylacetat og bly citrate og undersøkt med en Hitachi H-7000 elektronmikroskop. For å evaluere mitokondrie forandringer, ble -50 celler per prøve observert fra to uavhengige forsøk.
Bioinformatikk og statistiske analyser
Pathway analyse og biologisk prosess foreningen ble kartlagt ved hjelp av PANTHER-Expression dataanalyse [41] [42], et konseptuelt enkel binomisk test for å sammenligne klassifiseringer av flere klynger av valgt liste med en referanseliste (NCBI:
Homo sapiens
Gener) til statistisk bestemme over- eller underrepresentasjon av PANTHER klasser. Biologisk prosess resultat ble valgt basert på overrepresentasjon verdi og P-verdi mindre enn 0,5. Protein-protein interaksjoner for målgener ble utført med Osprey basert på general Respository for Interaksjons datasett (nettet) og Gene onthology (GO) [43].
