Abstract
MITOSTATIN
, en roman antatt tumorsuppressorgen indusert av decorin overekspresjon, er uttrykt i de fleste normale menneskelige vev, men er markert nedregulert i avanserte stadier av melke og blære carcinoma . Mitostatin påvirker negativt cellevekst, induserer celledød og regulerer uttrykket og aktiveringsnivå Hsp27. I denne studien demonstrerte vi at ektopisk ekspresjon av Mitostatin i PC3, DU145 ikke, og LnCap prostatakreftceller bare induserte en signifikant reduksjon i cellevekst, men også hemmet migrering og invasjon. Videre Mitostatin hemmet kolonidannelse i bløt agar av PC3 og LNCaP-celler, samt tumordannelse av LNCaP-celler i nakne mus. Motsatt, rettet mot endogen Mitostatin av siRNA og anti-sense strategier i PC3 og DU145 prostatakreftceller forbedret ondartede fenotype i begge cellelinjer. Etter avtale av disse anti-onkogene roller, oppdaget vi at Mitostatin var fraværende i ~35% (
n
= 124) av prostata tumorprøver og dens samlede reduksjonen var assosiert med avansert kreft stadier. Samlet våre funn tyder på at
MITOSTATIN
kan fungerer som en tumor suppressor genet i prostata kreft og gi en ny mobilnettet og molekylære mekanismen for å bli ytterligere utnyttet og dechiffrert i vår forståelse av prostatakreft progresjon.
Citation: Fassan M, D’Arca D, Letko J, Vecchione A, Gardiman MP, McCue P, et al. (2011) Mitostatin Er nedregulert i Human prostatakreft og Undertrykker Invasive Phenotype av prostata kreft celler. PLoS ONE 6 (5): e19771. doi: 10,1371 /journal.pone.0019771
Redaktør: Hava Karsenty Avraham, Beth Israel Deaconess Medical Center, USA
mottatt: 31 januar 2011; Godkjent: 04.04.2011; Publisert: 06.05.2011
Copyright: © 2011 Fassan et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble delvis støttet av Sidney Kimmel Foundation for Cancer Research, Benjamin Perkins blærekreft Fondet og Martin Greitzer fondet (til RB), National Institutes of Health gir RO1 CA39481, RO1 CA47282 og RO1 CA120975 (til RVI), RO1 DK068419 (til AM). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Prostatakreft er den viktigste årsaken til kreft dødsfall hos menn i de fleste utviklede land, og den vanligste kreftformen hos amerikanske menn. I USA, vil man over åtte menn utvikler prostatakreft i løpet av livet og over 27 360 mennesker er forventet å dø av sykdommen i år [1].
Molekylær genetikk studier av prostatakreft har identifisert mutasjoner, strykninger eller tap av tumorsuppressorgener ekspresjon i undergrupper av pasienter med prostatakreft [2]. Men på grunn av heterogeniteten av prostatakreft i seg selv og det sentrale arten av onkogenet /tumorsuppressorgen forandringer, forblir rollen til disse genene i prostata cancer utbruddet og den diagnostiske og /eller prognostisk verdi av slike gener endringer usikker [2].
Tap av heterozygositet (LOH) påpeker tilstedeværelsen av suppressor gener på spesifikke kromosomale regioner i svulster. Flere allelotyping studier rapporterte telomeric del av kromosom 12 som skal slettes i en rekke solide svulster [3] -. [11], inkludert prostata kreft [12]
MITOSTATIN
er en roman antatte tumorsuppressorgenet lokalisert ved 12q24.1 [13] – [15] nylig karakterisert ved vårt laboratorium [13]. Vi har tidligere vist at denne decorin-induserte 62-kDa-proteinet er uttrykt i de fleste humane vev; det påvirker prostatakreft cellevekst og celledød ved å regulere nivået og aktivering av Hsp27 [13]. Vi har også analysert ved hjelp av immunhistokjemi ekspresjonen av Mitostatin i en serie av primære blære og brystsvulster, og det observert en reduksjon av Mitostatin proteinnivåer i avanserte tumorstadier. I tillegg har Kim og kolleger nylig identifisert en rammeskifte mutasjon av
MITOSTATIN
genet i en magekreft med mikro ustabilitet [14].
Selv om den biologiske funksjonen til Mitostatin i prostatakreft er ikke ennå karakterisert, forholdet til decorin og Hsp27 antyder en rolle for Mitostatin i kreftutvikling. For å studere tumor suppressor funksjon Mitostatin i prostatakreft, vi over-uttrykt og utarmet endogen Mitostatin protein av antisense og siRNA strategier i prostatakreftcellelinjer utvunnet.
I denne studien, gir vi den første bevis for en rolle Mitostatin i å hemme cellemigrasjon, invasjon og tumorgenisiteten av prostatakreftceller. Videre våre data indikerer at Mitostatin er nedregulert i avansert stadium menneskelige prostata kreft. Dermed Mitostatin kunne fungere som en klassisk tumorsuppressorgen og analyse av dens uttrykk kan vise et nyttig klinisk markør for diagnose og prognose i denne felles menneskelig kreft.
Resultater
Mitostatin Over-uttrykk i prostata kreft celler Hemmer Colony Forming
Som en første tilnærming til å etablere Mitostatin uttrykk i prostata vi utnyttet celle ekstrakter fra fjorten forskjellige prostata-deriverte celler, inkludert både normale og maligne prostataceller. Ved hjelp av immunoblotting med en Mitostatin-spesifikt antistoff [13], oppdaget vi at alle cellelinjer analysert, men en (
dvs
. 1542CP
3TX), uttrykte Mitostatin protein på ulike nivåer (Figur 1a). Spesielt, LNCaP cellene vises det høyeste uttrykk og 1532CP
2TX viste en nesten-detekterbare nivåer av endogen Mitostatin (figur 1A). Av notatet, 1542NPTX celler som uttrykker Mitostatin, er de «vanlige» kolleger av de Mitostatin-negative ondartede 1542CP
3TX celler
A:. Western blot analyse: Mitostatin er forskjellig uttrykt i menneskelig prostata kreft celle linjer. Protein lasting ble bekreftet ved reprobing membranen med antistoff mot p-aktin. B: Western blot viser uttrykk for Mitostatin i PC3, DU145 og LNCaP cellelinjer benyttet i denne studien
Deretter fokuserte vi på å undersøke den biologiske funksjonen til Mitostatin i prostatakreftceller av stabilt transfeksjon PC3. og LNCaP-celler med en V5-merket cDNA Mitostatin ekspresjonskonstruksjon og PC3 og DU145-celler med en anti-sense-cDNA-konstruksjon. Vi har også plassert Mitostatin kodende sekvens i en selv-inaktiverende retrovirusvektor under kontroll av en induserbar promoter Drosophila HPS70 for å infisere DU145-celler. Vi fikk fem kloner stabilt over-uttrykker Mitostatin (PC3 B2, DU145 Mitostatin, LNCaP B1A, LNCaP B3a og LNCaP A3A) og to kloner som viste reduserte nivåer av endogen Mitostatin protein (PC3 M2 og DU145 M2) (figur 1B). I tre uavhengige kolonidannelsen assays, alle Mitostatin-overuttrykkende cellelinjer viste en reduksjon i antallet og størrelsen av kolonier etter 15 dager (Figur 2 A-C) sammenlignet med enten den parentale eller V5-transfekterte celler. DU145 Mitostatin, som også er klonen med den høyeste ekspresjon av Mitostatin sammenlignet med foreldrecelle uttrykket (4,2 gangers økning, jf fig 1B), viste den høyeste inhibering av kolonidannelse (figur 2 B). Av interesse, celler som uttrykker en Mitostatin antisens-konstruksjon viste enten et lignende (DU145 M2, figur 2 B) eller høyere (PC3 M2, figur 2A) antall kolonier i forhold til foreldre eller mock-transfekterte celler.
Mitostatin over-uttrykk i prostatakreftcellelinjer utvunnet [PC3, A; DU145, B; og LNCaP, C] nedsatt evne til å danne kolonier etter 15 dager, mens celler med uttømming av endogent Mitostatin protein viste en lignende (DU145 M2) eller høyere (PC3 M2) antall kolonier sammenlignet med foreldreceller. Kolonner, gjennomsnitt per tallerken fra tredoble eksperimenter;
barer
, SEM. *
P
0,05; **
P
. 0,01
Mitostatin Over utfoldelse Hemmer Migrering av prostata kreft celler
Det er vel etablert at decorin og Hsp27 er involvert i celle migrasjon. Den tidligere har blitt vist å utøve en anti-trekkende virkning på forskjellige cellelinjer som involverer ulike signalveier [16] – [19], mens den sistnevnte er involvert i aktin omstilling når cellene danner lamellipodia [20]. Siden vi tidligere har oppdaget Mitostatin i decorin-over-uttrykke celler og viste at Mitostatin hemmer uttrykk og fosforylering av Hsp27 i prostata kreft cellelinjer [13], forsøkte vi å finne ut om Mitostatin kan regulere cellemigrasjon i prostatakreftceller. Derfor gjennomførte vi
in vitro
migrasjons analyser ved hjelp av ulike Mitostatin-overekspresjon eller Mitostatin-utarmet prostata kreft celler. I alle cellelinje testet, Mitostatin over-uttrykk hemmet evnen til cellene til å migrere (figur 3A) som indikerer at Mitostatin regulerer migrasjon av prostata kreft celler negativt. I Mitostatin-over-uttrykkende kloner LnCap den hemmende effekten av Mitostatin migrasjons var direkte korrelert til mengden av protein (
dvs. product::. LNCaP A3A-klone med det høyeste Mitostatin ekspresjonen var den langsomste i migrasjon analyse). Omvendt, prostata kreft celler som endogent Mitostatin ble nedregulert ved enten antisense strategi (PC3 M2 og DU145 M2) eller Mitostatin siRNA (PC3 celler) viste økt cellemotilitet (figur 3A).
En
og Selge B: Mitostatin over uttrykke kloner viste redusert trekkende egenskaper i forhold til foreldre celler. Migrasjon ble vurdert gjennom migrasjon (A) og sårheling analyser (B). Celler med nedregulering av det endogene proteinet Mitostatin (PC3 M2, PC3 Mitostatin shRNA, og DU145 m2) viste en økt malign oppførsel. Data er uttrykt som prosentandel av migrasjon
versus
parentale celler.
Kolonner
, representative bilder av tre paralleller fra tre uavhengige forsøk;
barer
, SEM. *
P
0,05; **
P
. 0,01
Deretter vi bestemt evne Mitostatin å hemme migrering av prostata kreft celler ved hjelp av en
in vitro
«wound- healing «motilitet analyse [21]. I motsetning til parentale celler og PC3 V5 kontrollceller (data ikke vist), PC3-celler B2 over-uttrykker Mitostatin viste en betydelig nedgang i migrering inn i det utarmede område, både ved 4 og 8 timer etter at såret (figur 3B). Vi utførte det samme eksperiment på LNCaP og DU145-celler og observert at i alle cellelinjer. I hovedsak Mitostatin over-uttrykk induserte en nedgang i cellemotilitet forhold til foreldrenes eller mock-transfekterte celler (data ikke vist).
Mitostatin Over utfoldelse Hemmer Invasion og celle adhesjon
Oppkjøpet av kreftceller i invasiv fenotype er et kritisk trinn for tumorprogresjon. Matrigel-belagte filtre er mye brukt for å undersøke invasiv migrasjon gjennom en tredimensjonal ekstracellulære matriks [21]. Derfor gjennomførte vi
in vitro
invasjon analyser evaluere muligheten for prostata kreft celler til å invadere gjennom Matrigel i 5% serumholdig medium. Mitostatin over-uttrykk hemmet cellular invasjon i alle cellelinjene som ble testet (figur 4A). I LNCaP over-uttrykkende kloner den inhiberende effekt av proteinet på migreringen var direkte korrelert til mengden av protein (LNCaP A3A har den laveste evnen til å invadere). Videre observerte vi en økt i celle invasjon i PC3 M2 og DU145 M2 antisensprimere kloner, og PC3 Mitostatin siRNA celler
A:. Mitostatin hemmer invasive egenskaper av prostata kreft celler. Celler med nedregulering av det endogene proteinet Mitostatin (PC3 M2, PC3 Mitostatin shRNA, og DU145 m2) viste en økt malign oppførsel. B: Mitostatin overuttrykk påvirker celle evne til å feste seg til laminin. Data er uttrykt som prosentandel av migrasjon
versus
parentale celler.
Kolonner
, representative bilder av tre paralleller fra tre uavhengige forsøk;
barer
, SEM. *
P
0,05; **
P
. 0,01
Overholdelse av ekstracellulære matrise er et karakteristisk trekk ved en invasiv og metastatisk fenotype og trekkende cellene danner forbigående vedlegg til den ekstracellulære matrise. Spesielt er laminin-en den viktigste komponenten av Matrigel. Derfor utførte vi vedheft analyser og belagt ulike Mitostatin-overekspresjon eller Mitostatin-utarmet prostatakreftceller på laminin-belagte plater. Celler ble tillatt å holde seg til laminin i 2 timer, og antallet festede celler ble deretter beregnet. Antallet celler som klebet til laminin var signifikant lavere i celler overuttrykkende Mitostatin i forhold til parentale celler i DU145 og PC3 cellelinjer (figur 4B), som indikerer at Mitostatin inhiberer celleadhesjon til laminin. Etter avtale med denne konklusjonen, Mitostatin-utarmet PC3 celler viste en økt kapasitet til å følge laminin (figur 4B). På den annen side, kan mangelen på signifikante forskjeller i celle adhesjon til laminin observert i LNCaP cellene delvis forklares med deres dokumentert lav lim evne
in vitro product: [22], [23].
til sammen tyder våre resultater at Mitostatin ikke bare hemmer den vandrende evnen til prostatacancerceller, men også evnen til å invadere en kompleks tredimensjonal grunnmasse, slik som Matrigel, og å følge laminin grunnen.
Mitostatin Over-uttrykk Hemmer Anchorage uavhengig vekst og tumorgenisiteten
For ytterligere å undersøke hypotesen om at Mitostatin kan spille en direkte rolle i prostata kreftutvikling, utførte vi forankringsuavhengig vekst analyser og en
in vivo
tumorigenicity forsøk i nakne mus. PC3 B2 celler med høy Mitostatin uttrykk ikke danner kolonier, mens PC3 M2 med lav Mitostatin nivå viste en økning i antall kolonier (figur 5A). Videre er de fleste av koloniene i PC-3 celler M2 var større enn de i kontrollceller (data ikke vist). I LNCaP-celler (Figur 5A-B), reduksjon i antall og dimensjon av koloniene direkte korrelert med Mitostatin ekspresjonsnivåer
A.: Data fra triplikate kulturer av foreldre PC3 og LNCaP, og kloner PC3 V5, PC3 B2, PC3 M2, LNCaP V5, LNCaP B1A, LNCaP B3a, og LNCaP A3A sådd ut i myk-agar genererende kolonier som er større enn 0,2 mm i diameter. Kloner som over-uttrykker Mitostatin viste en redusert evne til å danne kolonier, mens den Mitostatin nedregulert klon, PC3 M2, viste et høyere antall kolonier sammenlignet med foreldreceller. Koloniene ble tellet etter 21 dager. *
P
0,05; **
P
0,01 B:. Representative kolonier av LNCaP foreldre celler (til venstre), er LNCaP B1A (midten), og LNCaP A3A (høyre) vist etter 21 dager (forstørrelses × 200)
In vivo
eksperimenter viste at xenografter avledet fra Mitostatin-over-uttrykker LNCaP cellene var betydelig mindre enn de som fremkalles av LNCaP foreldre celler og LNCaP V5 kontrollceller (Figur 6A-B). Tumorer avledet fra LNCaP B1A og LNCaP B3a nådde et gjennomsnittlig volum 50% og 25% mindre enn de tumorer avledet fra parentale celler. Immunhistokjemisk analyse av parafininnstøpte tumorer og immunoblot-analyse av frosne tumorxenografter (figur 6C-D) viste høy ekspresjon i Mitostatin LNCaP B1A og LNCaP B3a xenotransplantater, sammenlignet med basalnivå Mitostatin ekspresjon er vist i parentale celler. Mitostatin uttrykk i transfekterte celler ble også bekreftet av immunhistokjemiske analyser ved hjelp av anti-V5 tag antistoff (figur 6C)
A:. Xenografter etablert av sub injisering av LNCaP, LNCaP V5, LNCaP B1A og LNCaP B3a celler i atymisk (BALB /c
nu /nu
) ble dyrket i 65 dager. B: Tumor volum i dyr injisert med celler over-uttrykker Mitostatin ble markert redusert sammenlignet med svulster hos dyr injisert med kontrollceller. Grafen viser fordelingen i tumorstørrelser dannet i BALB /c
nu /nu
mus gjennom 65 dager. *:
P
0,05. C, D: Immunhistokjemisk og immunoblot analyse av Mitostatin uttrykk i LNCaP og avledede tumorxenotransplantater. Immunhistokjemi ble utført ved hjelp av både anti-V5 (øvre paneler) og anti-Mitostatin (nedre paneler) antistoffer. Skala:. 50 mikrometer
Sammen er disse funnene tyder på at Mitostatin er direkte involvert i en doseavhengig måte å kontrollere en av de mektigste
in vitro
egenskapene til ondartede celler , slik som forankringsuavhengig vekst, samt
in vivo
tumorgenisitet. Dermed er Mitostatin en viktig negativ regulator av transformert fenotype i prostatakreft.
Mitostatin Expression er redusert i Advanced Prostate Kreftsvulster
Vi har nylig vist at Mitostatin er allestedsnærværende uttrykt i normale menneskelige vev, men nivåene er markert svekket i avanserte stadier av brystkreft og blære kreft [13]. For å undersøke Mitostatin uttrykk i prostatakreft, evaluert vi ved QRT-PCR-analyse 10 matchet normal kreftprøver og ved immunhistokjemi (IHC) tre microarray består av 293 eksemplarer inkludert 124 prostatakreft og 43 normale kolleger. Mitostatin mRNA nivåene var signifikant nedregulert i kreft motpart (figur 7A;
P
= 0,029). Disse data ble ytterligere bekreftet ved IHC. Mitostatin ble uttrykt hovedsakelig i cytoplasma i basalcellelaget i normal prostata epitelet (figur 7B), og en sterk positivitet ble observert i den såkalte prostatakjertelen atrofi (figur 7C). Alle pre-neoplastiske lesjoner (
dvs.
: PIN) viste en mild til moderat Mitostatin farging (figur 7D), mens det meste av adenokarsinom viste enten fokus farging (figur 7E, F) eller ingen flekker i det hele tatt ( Figur 7G). Som forventet, muskelceller og blodkar «endothelia viste en Mitostatin moderat positivitet. Av interesse, fem neoplastiske tilfeller hadde utelukkende atom positivitet. Totalt 44 av de 124 tumorprøver var helt negative (~35%), 65 viste en mild til medium positivitet (52,4%) og bare 15 prøvene viste sterk Mitostatin positivitet (12,1%). I univariat analyse, en redusert Mitostatin immunhistokjemiske poengsum korrelert med tumorstadier (
P
= 0,046), pkt økning (
P
= 0,040), og tumor volum (
P =
0,045). Ingen kliniske-patologiske parametere resulterte uavhengig statistisk signifikant assosiert til Mitostatin uttrykk i multivariat analyse. . Disse funnene ytterligere underbygge forestillingen om at tap av Mitostatin gjennom mutasjoner eller protein degradering kan bidra til prostatakreft progresjon så vidt prostatakreft prøvene vurderes ovenfor stammer fra avanserte prostatakreftpasienter
A: Relativ fold av Mitostatin mRNA nivåer i normale prostata vevsprøver (N, svart), og Gleason 7 prostatakreft prøver (K, lys grå). Mitostatin viste en konsekvent nedregulering i kreftvevet (
P
= 0,029). Kolonner, representative bilder av tre paralleller; barer, SD. B-G: Immunhistokjemisk påvisning av Mitostatin i menneskelig prostata. Mitostatin proteinet er lokalisert i cytoplasma av normal (B) og atrofisk (C) prostatakjertler. Høyere nivåer av Mitostatin-protein ble observert hos PIN-lesjoner (D) og i noen tumorer (E). F: I tillegg til en svak farging, Mitostatin ble også påvist i kjernen i noen få tilfeller av adenokarsinom. G: Mitostatin uttrykk er til stede i en atrofisk kjertel (sort pil) i kontrast med de omgivende negative neoplastiske kjertler. Skala: 50 um
Diskusjoner
Selv om prostata kreft er en av de vanligste kreftformer, svært lite er kjent om de molekylære mekanismene som bestemmer malign transformasjon av prostata epitel.. Under prostatakreft progresjon, kreftceller blir mer bevegelig og skaffe invasiv kapasitet. De fleste dødsfall fra prostatakreft er ikke på grunn av den primære svulsten, men heller til sekundære metastaser til fjerne organer. Av denne grunn er det av grunnleggende betydning for å studere mekanismene som driver prostatakreft invasjon og metastaser. Det kromosomale region 12q er vist å bli slettet i et stort utvalg av faste avanserte tumorer [3] – [12], og dermed tyder på tilstedeværelsen, i denne regionen, av ett eller flere tumorsuppressorgener som er involvert i prosessen med progresjon av kreft.
Vi har tidligere identifisert Mitostatin genet, lokalisert ved 12q24.1, i ferd med screening for vekst arrestert gener som induseres fra leucin-rike proteoglykan decorin [13]. Decorin er medlem av den lille leucine-rik proteoglykan genet familie som nylig har blitt et fokus på flere områder innen kreftforskningen [20]. Dette løselig protein er involvert i en rekke cellulære prosesser inkludert matrisesammenstillingen, fibrillogenese, og kontrollen av celleproliferasjon [18], [24] – [33]. Decorin har vist seg å hemme migrering [16] – [19], [34], invasjon [18], og tumorgenisitet [19], [29], [33], [35], [36] fra en lang rekke transformerte celler. Videre induserer apoptose decorin gjennom aktiveringen av caspase-3 [36], [37]. Derfor er det sannsynlig, at decorin-induserte proteiner som kan være effektorer av tumoren undertrykkende virkningen av denne proteoglycan.
Vi har tidligere vist at Mitostatin er ubikvitært uttrykt i normale humane vev. Imidlertid er dens protein nivåer markert svekket i avanserte stadier av primær bryst og uroteliale svulster [13]. Vi videre viste at Mitostatin over-uttrykk negativt påvirker cellevekst og induserer celledød i blæren kreft cellelinjer [13], noe som tyder på at Mitostatin kunne oppføre seg som en klassisk tumor suppressor genet i andre former for kreft. I foreliggende studie benyttet vi tre brukte prostata-karsinom-cellelinjer, nemlig, PC3 og DU145 kastrerings-resistente celler, og LnCap androgen-avhengige celler, og anvendes transgen og immunologiske strategi for å fastslå funksjonen av Mitostatin i disse cellene. Våre resultater bekrefter vår prediksjon av Mitostatin tilhører tumorsuppressorgenet familie i den grad overekspresjon av Mitostatin hemmet koloni formasjon, mens undertrykkelse av endogene Mitostatin forårsaket det motsatte effekter.
Cell migrasjon og invasjon er grunnleggende komponenter av tumorcellemetastaser . Som økt celle migrasjon og invasjon er kjennetegnene ved metastatisk fenotype, og dermed et mål på aggressivitet, denne studien gir resultater som implisere Mitostatin som et viktig protein for å bestemme en aggressiv cellulær fenotype. Faktisk Mitostatin over-uttrykke kloner viste en signifikant nedgang i motilitet, og
vice-versa
av nedregulere endogen Mitostatin med enten antisens eller siRNA strategier vi utløste det motsatte resultatet. En direkte rolle Mitostatin fremme cellemigrasjon er også tydelig fra våre sårhelende studier, bekreftet i alle cellelinjer analysert.
Våre resultater viser at Mitostatin regulerer både cellular motilitet og evnen til prostata kreft celler til å invadere gjennom en 3D-matrise via en mekanisme som ennå ikke er klarlagt. Mitostatin forandret celle vedheft egenskaper til laminin, som er den første nødvendige skritt for å invadere Matrigel membran. Dette funnet er i samsvar med den rollen som decorin spiller som en negativ regulator av celleadhesjon til laminin [19]. Andre tumorsuppressorgener har vist seg å påvirke flere kreftceller egenskaper (migrasjon, invasjon, vekst, predisposisjon til apoptotiske stimuli) som virker på viktige cellulære proteinkomplekser [38] – [40]. Dermed vil våre fremtidige innsats være fokusert på å identifisere Mitostatin protein partnere og på å studere mulige kaskade signaler innblandet i Mitostatin biologi.
For å undersøke en mulig direkte rolle for Mitostatin i prostataceller transformasjon vi utførte forankringsuavhengig vekst analyser og en
in vivo
tumorigenicity i nakne mus. Begge studiene bekreftet rolle Mitostatin som en negativ regulator av transformasjon. I begge forsøkene Mitostatin uttrykk korrelert godt med aggressivitet av kreftceller.
I denne studien har vi observert en reduksjon i Mitostatin uttrykk i to prostatakreftcellelinjer utvunnet (1542CP
3TX og 1532CP
2TX ; 16,7% av kreft-avledede cellelinjer) og i ~35% av en serie av 124 prostatakreft. Av interesse, i normale prøver, den øvre epithelial prostata lag var gjennomgående negative for Mitostatin epitoper, mens det nedre lag viste en sterk positivitet, noe som tyder på tilstedeværelsen av en annen cellulær satsing i Mitostatin uttrykk. En sterk positivitet ble alltid observert i den såkalte prostatakjertelen atrofi (en vanlig prosess typisk, men ikke utelukkende funnet i eldre pasienter), mens en moderat positivitet ble observert i alle de pre-neoplastiske lesjoner, med en reduksjon i den mest avanserte prostatakreft etapper. I primær prostatakreft, Mitostatin nedregulering ble statistisk assosiert med avanserte kreft stadier og økt størrelse (eller direkte omfang) av primærtumor ved patologisk undersøkelse (
dvs. product:: PT), som bekrefter vår forrige observasjon i bryst og blærekreft [13]. Disse resultatene tyder på at nedregulering av Mitostatin i løpet av de senere stadier av prostata tumorigenesis kan fremme kreft progresjon. Vi fant ikke noen sammenheng mellom Mitostatin uttrykk og andre kliniske parametre som brukes for å vurdere prostatakreft dårlig prognose, slik som Gleason grad, selv om dette punktet gjenstår å bli undersøkt i en større serie av tilfellene.
I konklusjonen, Denne studien gir den første bevis for at Mitostatin kan spille en betydelig rolle som tumor suppressor i prostata svulst utvikling og progresjon gjennom sin hemmende effekt på celle migrasjon, invasjon, forankringsuavhengig vekst, og
in vivo
tumorigenesis. Videre er Mitostatin nivå redusert i fremskredne stadier av primær prostatakreft. Samlet utgjør disse dataene støtter videre hypotesen om at Mitostatin fungerer som en
bona fide
tumor suppressor og foreslå at ytterligere undersøkelser av Mitostatin som et nyttig klinisk markør for diagnose og prognose i prostatakreft er garantert.
Materialer og metoder
Cell Kultur og generasjon av Stabile Clones
prostatakreft cellelinjer utvunnet 2220, 2221, 11609, 11610, 11611, Tgup, 1532CP
2TX, 1535CP
1TX, 1542CP
3Tx, LNCaP, DU145 og PC3 og prostata udødelig normale avledede cellelinjer 1535NPTX, og 1542NPTX ble oppnådd fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) og opprettholdt som anbefalt. -Celler ble transfektert som tidligere beskrevet [13], [41] (Data S1), og som er valgt i medium supplementert med enten G418 (400 ug /ml) eller puromycin (0,75 ug /ml) i 3 uker.
Mitostatin genet Slå
Gene stanse all menneskelig Mitostatin ble oppnådd ved siRNA strategier bruker validerte SureSilencing Mitostatin siRNA og kontroll plasmider (SuperArray Bioscience Corp, Frederick, MD). PC3 celler ble transfektert med bil (DEPC-behandlet vann), kontroll siRNA (kryptert), eller siRNA rettet mot Mitostatin (100 pmol /L) med Oligofectamine ™ reagens (Invitrogen, Carlsbad, California) etter produsentens protokoller. Tjuefire timer etter transfeksjon, ble PC3 cellene sultet i serumfritt medium (SFM) i 12 timer og ble deretter behandlet og analysert for migrering og invasjon som beskrevet nedenfor. Ekspresjon av Mitostatin protein ble påvist ved immunoblotanalyse (Fig S1).
Colony Forming og migrering Analyser
Celler ble sådd ut i en tetthet på 400 celler /100 mm skål. På dag 15 ble cellene fiksert i 10% formalin [100% formaldehyd er 37%, således 3,7% er 10% formalin,
ie
: PBS-formaldehyd], og farget med krystallfiolett for kolonitelling [21] . Celler ble serum sultet i 24 timer. Celler (2,5 x 10
4 i 200 ul) ble deretter sådd ut i Boyden kammere (øvre kammer) (BD BioCoat, Bedford, MA). Nedre kammer inneholdt 500 ul av enten SFM eller 1% eller 5% serum. Etter 10 timer ble overført cellene telles under mikroskop etter å fikse og farging i Coomassieblå som beskrevet [42], [43].
Migrasjon, Invasion og heft Analyser
Celler ble sådd ut 35 mm plater i serumholdig medium til sub-konfluens og deretter overført til SFM. Etter 24 timer ble platene skrapet med en tynn engangs spiss for å generere et sår i cellemonolaget [42]. Cellene ble inkubert i ytterligere 72 timer i 1% eller 5% serumholdig medium og analysert og fotografert med et Zeiss Axiovert 200 M celle levende mikroskop (Carl Zeiss Inc., Thornwood, NY) ved anvendelse av Metamorph Image Acquisition og Analysis programvare (Universal Imaging, Downing, PA) på Kimmel Cancer Center konfokalmikroskopi Kjerne Facility. Celle invasjon gjennom en tredimensjonal ekstracellulær matriks ble vurdert ved en Matrigel invasjon analyse ved bruk av BD Matrigel Invasion Chambers (BD BioCoat) med 8,0-um filtermembraner som tidligere beskrevet [42], [43]. For adhesjons-analyser, 96-brønners plater, belagt med laminin mus (BD BioCoat), ble inkubert ved romtemperatur i 1 time med 1% bovint serumalbumin (BSA) (Sigma, St. Louis, MO), for å blokkere uspesifikk binding. 100000 celler /brønn ble sådd i tre paralleller, og tillates å følge i 2 timer ved 37 ° C og ikke-adherente celler ble deretter fjernet med to vaskinger. Adherente celler ble farget med CyQUANT NF celleproliferasjonsanalyse settet (Invitrogen) og absorbansen ble avlest ved 490 nm. Bakgrunnsnivåer av celle adhesjon i brønner belagt med BSA alene ble trukket fra verdiene oppnådd ved laminin.
Anchorage uavhengig Vekst og tumorgenisiteten Analyser
For myk agar assay ble cellene suspendert i 0,2% agarose i DMEM 10% FBS medium, utplatet med en tetthet på 10
3-celler i en 60-mm skål belagt tidligere med 0,4% agarose, og holdt ved 37 ° C °. På dag 21, kolonier 0,2 mm i diameter ble talt og analysert [21]. Tumorgenisitet analyser ble utført i det vesentlige som beskrevet [44], i henhold til protokoller som er godkjent av Thomas Jefferson Animal Care Committee og bruk. Immunsvikt, atymiske nakne (BALB /c
nu /nu
) mus ble injisert subkutant i bakre flankene med 2 × 10
6 celler i 200 ul Matrigel basalmembran matrix (BD Biosciences). Tumorvekst ble overvåket daglig i 65 dager.
Etikk uttalelser
Alle pasienter som er involvert i QRT-PCR studie ga sin skriftlig informert samtykke.
