Abstract
Veksten og veiledning av mange aksoner i utviklings nervesystemet krever Netrin-mediert aktivering av Slettet i tykktarmskreft (DCC) og andre fortsatt ukjente signal signaler. Kommissurale axon veiledning defekter er mer alvorlig i
DCC
mutant mus enn
Netrin-en
mutante mus, noe som tyder på ytterligere DCC aktiverende signaler foruten Netrin-en er involvert i riktig axon vekst. Her rapporterer vi at interaksjons skjermer på ekstracellulære proteiner microarrays som representerer over 1000 proteiner entydig identifisert cerebellin 4 (CBLN4), et medlem av den C1q-tumor nekrose faktor (TNF) familie, og Netrin-en som ekstracellulære DCC-bindende partnere. Immunfluorescens og radio-ligandbindende studier viser at Netrin-en konkurrerer med CBLN4 binding på en overlappende område innenfor membran proksimale fibronektin domener (FN) 4-6 av DCC og binder seg med ~ 5 ganger høyere affinitet. CBLN4 binder også til DCC homolog, Neogenin-1 (NEO1), men med en lavere affinitet sammenlignet med DCC.
CBLN4
-null mus viste ikke en defekt i kommissurale aksoner i utviklingsryggmargen, men gjorde vise en forbigående økning i antall vandrende axoner i plexus brachialis, i samsvar med en rolle i axon veiledning. Totalt sett stivner data CBLN4 som en bona fide DCC ligand og styrker sin innblanding i axon veiledning
Citation. Haddick PCG, Tom jeg, Luis E, Quiñones G, Wranik BJ, Ramani SR, et al. (2014) Definere ligand spesifisitet av Slettet i tykktarmskreft (DCC) Receptor. PLoS ONE 9 (1): e84823. doi: 10,1371 /journal.pone.0084823
Redaktør: Brian Key, School of Biomedical Sciences, University of Queensland, Australia
mottatt: 9 juli 2013; Godkjent: 20 november 2013; Publisert: 06.01.2014
Copyright: © 2014 Haddick et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. All finansiering for denne forskningen ble levert av Genentech, et medlem av Roche-gruppen. Den Funder har roller i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, og utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Forfatterne har lest journalen politikk og har følgende konflikter: Alle forfattere er eller har vært ansatt i Genentech /Roche og kan eie aksjer i selskapet. Alle midler til denne forskningen ble gitt av Genentech /Roche. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Forlengelse av axoner mot sitt endelige mål er en viktig forutsetning for en god utvikling av nervesystemet. Axoner støter veiledning signaler langs sine vekst ruter, inkludert fire store kanoniske signalveier: DCC-Unc5-Netrin-en, Slit-rundkjøring (Robo), Semaphorin-Plexin-Neuropilin, og Efrin-Ef [1] – [3]. Det er imidlertid voksende forståelse at ytterligere molekyler bidrar til denne prosessen så vel [4], [5]. For bedre å forstå axon vekst og veiledning, vil det være viktig å bestemme repertoaret av proteiner som binder og samhandle med disse viktige signalkomponenter.
Her har vi fokus på å identifisere samspill proteiner for DCC. DCC er et 175-190 kDa medlem av Ig-superfamilien som består av et enkelt transmembrandomene og et stort ekstracellulært domene (ECD) inneholdende fire C2-lignende Ig-domener og seks FNIII domener [6] – [8]. DCC er nylig blitt rapportert å binde det utskilte liganden Draxin i mediering av aksonal utvekst inhibering [9]. Imidlertid er den beste karakterisert ligand av DCC er Netrin-1, et utskilt protein som består av et kuleformet domene VI, et domene V med tre EGF gjentas, og et C-terminalt domene av ukjent funksjon [10]. Selv om den nøyaktige stedet for Netrin-en binding til DCC ikke er kjent, er den femte FNIII gjentakelse av DCC nødvendig [11], [12].
I
Drosophila
, mutanter av DCC homolog
uryddig
føre til mer alvorlige axon midtlinjeveilednings defekter enn
netrinAB
mutanter og dette er delvis reddet av
commissureless
uavhengig av netrin og tyder på en ytterligere uryddig ligand [13 ]. Tilsvarende knock-out av enten
DCC
eller
Netrin-en
i mus fører til en svikt i kommissurale axoner å krysse ryggmargen midtlinjen, men alvorlighetsgraden av kommissurale axon defekter i utvikling ryggmarg er større i
DCC
knock-out mus sammenlignet med
Netrin-en
mutante mus [14], [15]. Selv om det ikke er et pattedyr homolog av
commissureless
, disse funnene støtter forslaget om at det er flere ligander som regulerer DCC aktivitet i virveldyr.
Her rapporterer vi, ved hjelp av en objektiv storskala protein- mikromatriseskjerm, som i tillegg til Netrin-1, er CBLN4 en svært spesifikk ligand for DCC. De fire medlemmer av familien CBLN, CBLN1-4, utskilles, glykosylerte proteiner som inneholder en C-terminale globulære domene C1q karakteristisk for C1q-TNF-superfamilien [16], og de er uttrykt i utviklingsland og voksne hjernen [17] . CBLN1 og CBLN2 er de best forståtte CBLN familiemedlemmer, og har blitt funnet å stabilisere synapser ved å virke som en trans-synaptisk kobling, binding med Beta-Neurexins av granule neuroner og delta-2 glutamatreseptorer av Purkinje-celler i lillehjernen [18] – [21]. Men lite er kjent om den funksjonelle rollen CBLN4 og det er ingen obvert atferds fenotype i en
CBLN4
knock-out mus [22]. Nylig, en uavhengig studie også identifisert DCC som CBLN4 bindende protein ved hjelp av en mer begrenset kandidat-basert skjerm [22]. Vi har videre karakterisert DCC-CBLN4 samhandling og identifisert en forbigående vandrende-axon fenotype i plexus brachialis i murine
CBLN4
knock-out.
Materialer og Metoder
etikk Uttalelse
Genentech Institutional Animal Care og bruk komité godkjente alle dyrestudier.
Kloning og protein uttrykk
Expression konstruksjoner ble generert ved hjelp av standard PCR-metoder ved hjelp av en in-house klone samling eller cDNA kjøpt fra Origene som mal og subklonet inn pRK5 vektor som inneholder den riktige N-terminal eller C-terminal epitop tag. Mutanter for DCC domenekartleggingsstudier ble gjort ved hjelp av Quick-Change II XL seterettet mutagenese kit (Stratagene). Alle konstruksjoner var sekvens kontrollert før bruk. N-terminal flagg-merket (MGGTAARLGAVILFVVIVGLHGVRGKDYKDDDDKLE), full-lengde og sletting konstruksjoner for mennesker DCC er som følger: Flag-DCC full lengde (H26-I1442); Flag-DCC Ig1-4 (H26-S425-BamH1-L1098-I1442); Flag-DCC FN1-6 (S426-I1442), flagg DCC FN4-6 (E722-I1442). Protein ekspresjonskonstruksjoner ble samlet for oppløselig (C-terminale domenet er slettet) [7] human Netrin-1 (G25-K453) med en N-terminal gD-tag (MGGTAARLGAVILFVVIVGLHGVRGKYALADASLKMADPNRFRGKDLPVLLE), human CBLN4 (M1-L201) med en C-terminal Fc tag og ekstracellulære domenet til humant DCC (M1-N1097) med en C-terminal Fc tag. Fullstendige aminosyre-sekvenser er gitt i tabell S1.
Proteiner ble uttrykt i kinesisk hamster-ovarieceller (CHO) celler og renset som beskrevet tidligere [23]. Kort sagt ble proteinene renset fra transient transfeksjon medier ved satsvis adsorpsjon på anti-Flag eller anti-gD agarose-harpiks, fulgt av pakking av harpiksen i kolonner for standard kromatografi. Fc-merkede proteiner ble renset ved lasting på en protein A-Sepharose (Amersham Biosciences) kolonne. Etter vasking med fosfatbufret saltvann (PBS) til grunnlinjen, ble proteinene eluert med 0,1 M eddiksyre pH 3 og nøytraliseres umiddelbart med 1,5 M Tris pH 8,6. En sekundær gelfiltreringskolonne ble kjørt som en avsluttende polering trinn. Protein renhet ble undersøkt ved hjelp av SDS-PAGE farget med Coomassie blå og var . 90% ren
Protein Mikromatriser
Protein mikromatriser ble bygget på epoksysilanet belagt glassplater (Schott) som tidligere beskrevet [ ,,,0],24]. To utskilt protein bibliotekene ble anvendt. Bibliotek 1 består 1,334 rensede prøver, som representerer 686 utskilt eller ekstracellulære domener av single-transmembrane proteiner [25]. Den andre utskilte protein-bibliotek, Library 2, besto av 624 prøver, som representerte 562 gener (92 gener var til stede i begge biblioteker) (tabell S2). Detaljer av screeningsmetoder er tidligere blitt beskrevet [24]. Kort fortalt ble flerverdige protein-A mikroperler (Miltenyi Biotech) fremstilt av en 01:01 blanding av DCC-Fc og Cy5-merket-Higg og inkubert med microarray lysbilder ved hjelp av en automatisert aHyb hybridisering stasjon (Miltenyi Biotech). Platene ble vasket med PBS-T (PBS + 0,1% Tween 20), ble tørket og deretter skannet for Cy5 fluorescens ved hjelp av en GenePix 4000B scanner (Molecular Devices). Slides ble analysert ved hjelp GenePix Pro 6.0-programvare (Molecular Devices). Rapporterte signalintensiteter ble normalisert av den gjennomsnittlige fluorescerende signal på tvers av alle prøvene på objektglasset.
bindingsforsøk
COS-7-celler (ATCC) ble transfektert med cDNA som koder for DCC eller, som kontroll, Nogo reseptor (NGR) med PolyFect (Qiagen) i henhold til produsentens anbefalinger. Etter inkubering ved 37 ° C i 48 timer, ble cellene vasket to ganger i bindingsbuffer (1% varme-inaktivert normalt geiteserum (hings), 0,05% natriumazid, 2 ug /ml heparin i PBS) og inkubert med 20 nM alkalisk Phasphatase (AP), CBLN4-AP, eller Nogo 66-AP fra kondisjonert medium i 90 min i bindingsbuffer ved romtemperatur. Cellene ble deretter vasket tre ganger i bindingsbuffer, løst i 7 minutter i 4% paraformaldehyd (PFA) i PBS, vasket tre ganger i HEPES-bufret oppløsning (HBS -20 mM HEPES, pH 7,0, 150 mM NaCl), varme-inaktivert etter 30 minutter ved 65 ° C, og vasket tre ganger i buffer alkalisk fosfatase (AP buffer -100 mM Tris, pH 9,5, 100 mM NaCl, 50 mM MgCl
2). AP-signalet ble utviklet med nitroblått tetrazoliumklorid (NBT) /5-brom-4-klor-3′-indolyphosphate p-toluidin salt (BCIP) stamoppløsning (Roche) fortynnet 50 ganger i buffer AP i mørket for at minst en time inntil AP avhengige dannelsen av blå NBT /BCIP bunnfall ble visualisert.
overflate-plasmonresonans
overflate-plasmonresonans (SPR) ble utført på en Biacore 3000 (GE Healthcare) hos 25 ° C ved hjelp av en CM5 sensorbrikke i 0,01 M HEPES, pH 7,4, 0,15 M NaCl, 0,005% P20 Surfactant (HBS-P) buffer ved en strømningshastighet på 30 mL /min. Full-lengde N-terminalt HA-merket CBLN1 og CBLN2 ble kjøpt fra R 15,082 respons enheter) og negativ kontroll Robo3-Fc (høyre; 9,833 respons enheter) med CBLN1, CBLN2, CBLN3 og CBLN4 injiseres som analytter på 10 mikrogram /ml. Robust binding ble påvist å CBLN4 (svart kurve), mens ingen binding signal ble oppdaget for de andre cerebellin familiemedlemmer (grå spor). B) En radio-lignad analyse ble brukt for å bestemme affiniteten av CBLN4-Fc (venstre) og gD-Netrin-1 (høyre) for å DCC transient transfektert inn i HEK293T celler.
125I-merket ligand ble tillatt å binde transfekterte celler i nærvær av økende mengder av umerket ligand. Beregnet
K
D
verdier er angitt på grafene og er representative for 3 uavhengige eksperimenter.
Identifisere CBLN4 Binding Partnere
For å finne ut om det var andre CBLN4 reseptorer i tillegg til DCC, ble en protein-mikromatriseskjermen utføres i omvendt hvor CBLN4-Fc ble brukt som agn, men ble ingen klare treff funnet (data ikke vist). Merkelig, DCC selv ble ikke identifisert som en hit. Tidligere studier indikerer at proteinene i stor grad er aktive på microarray substratet [24], selv om det er en mulighet for at DCC er følsom for denne type immobilisering. Deretter fjorten neuronale proteiner, er kjent for å koordinere nevron aksonal bane finne lik DCC funksjon, ble screenet ved anvendelse av en cellebindingsanalyse. Binding av CBLN4-Fc ble evaluert mot COS-7 celler transfektert med kloner som tilsvarer umerkede helaftens kandidat gener. Det skal bemerkes at et negativt resultat ikke nødvendigvis utelukker kandidaten interaksjonen siden protein uttrykk var ubekreftet. Kvantifisering av den fluorescerende intensitet for CBLN4-Fc-farging til disse transfekterte kloner identifiserte DCC og to andre potensielle ligander, Netrin-1 og NEO1 (figur 4A). Signalet observert for Netrin-1-binding, men holdt seg konstant uavhengig av endringer i CBLN4 konsentrasjon og også med sekundært antistoff påvisning alene (data ikke vist), en indikasjon på en falsk positiv i skjermen. NEO1 interessant, er en DCC paralogue og fungerer også som en Netrin -1 reseptor [29]. Både DCC og NEO1 har lignende domene strukturer og dele 54% identitet over ECD regionen. For å vurdere kvalitativt bindende styrker for å Netrin-en og NEO1, DCC-uttrykke COS-7 celler ble vurdert individuelt med en titrering serie synkende CBLN4-Fc. Samspillet mellom CBLN4 og NEO1 kunne påvises ved CBLN4-Fc-konsentrasjoner på 25 ug /ml (280 nM) eller høyere. I motsetning til dette, CBLN4-Fc-binding til DCC-uttrykkende celler viste sterke signaler med konsentrasjoner helt ned til 0,78 ug /ml (8,7 nM) (figur 4B). Disse data tyder på at binding av NEO1 til CBLN4 representerer en mye lavere affinitet interaksjon sammenlignet med DCC binding CBLN4. For ytterligere å karakterisere CBLN4-NEO1 interaksjon, ble NEO1 forbigående uttrykker HEK293T celler analysert for binding til CBLN4-Fc-protein ved strømningscytometri og radio-ligand bindingsanalysen ved hjelp av
125I-merket CBLN4. Imidlertid CBLN4 interagerer ikke med NEO1 uttrykkende celler med en av disse metodene, sannsynligvis på grunn av en meget lav affinitet (data ikke vist).
A) kvantifisering av CBLN4-Fc-binding til COS-7 celler transfektert med de angitte axon veiledning proteiner. Data representerer tre uavhengige replikate plater, som hver inneholder triplikatbrønner og Feilstolpene representerer standardfeil av gjennomsnittet. B) Flag-DCC og Flag-NEO1 ble transient uttrykt på overflaten av COS-7 celle som påvist ved hjelp av anti-Flag-farging (øvre panel). Den nederste panelet viser en titrering serie CBLN4-Fc-binding til DCC eller NEO1. Tredoble uavhengige eksperimenter ble utført og feilfelt representerer standard feil av gjennomsnittet.
CBLN4 binder seg til FN4-6 regionen DCC
DCC er en enkelt transmembrane protein inneholder fire Ig gjentar og seks FNIII gjentar i ECD. For å vurdere hvilke domener i DCC er nødvendig for CBLN4 bindende, ble sletting konstruksjoner av DCC generert og transfektert inn i COS-7 celler for binding analyse. Fire DCC konstruksjonene ble testet, som utgjør enten hele ECD (DCC.FL), gjentar Ig1-4 (DCC.Ig), gjentar FN1-6 (DCC.FN1-6), eller bare den C-terminale FN4-6 repetisjoner (DCC.FN4-6). Den Ig1-4 gjentar (DCC.Ig) viste ingen binding til CBLN4-Fc, noe som tyder på at primære bindings er avhengig av FN-domener (figur 5A-B). I samsvar med denne tolkningen, uttrykk for bare FN gjentar (DCC.FN1-6) eller bare de siste tre FN-domener (DCC.FN4-6) beholdt sterk CBLN4-Fc bindende. Disse resultatene viser at DCC-FN4-6 er tilstrekkelig til å formidle binding til CBLN4.
A) en skjematisk fremstilling av DCC er vist med Ig-domener i sort og Fn-domener i grønt. Representative fluorescerende bilder vises for CBLN4-Fc-binding til COS-7 celler som uttrykker full lengde DCC, DCC Ig1-4, DCC FN1-6, DCC FN4-6, og negativ kontroll APP. Påvisning av CBLN4-Fc-binding var gjennom anti-human Alexa Fluor-488 (grønn). Påvisning av celleoverflate-ekspresjon av alle flaggmerkede DCC delesjonsmutanter ble bekreftet med en Alex Fluor-647 merket anti-mus IgG (rød). B) kvantifisering av CBLN4-Fc binding til DCC domene sletting konstruksjoner. Tredoble uavhengige eksperimenter ble utført og feilfelt representerer standard feil av gjennomsnittet.
Netrin-en konkurrerer med CBLN4 Binding
Tidligere publiserte rapporter implisere FN4-6 regionen DCC i Netrin-1-binding [11], [12]. Vår observasjon at CBLN4 binding kartlagt i samme region på DCC ledet oss til å undersøke om Netrin-en og CBLN4 konkurrere om DCC binding eller hvis alle tre proteiner kan danne et trefoldig kompleks. Ved hjelp av co-immunoutfellingsstudier, har det nylig blitt rapportert at binding til CBLN4 DCC kan bli konkurrert med Netrin-1 [22]. For å bekrefte disse resultatene, benyttet vi en følsom radio-ligand basert tilnærming. Dataene viser at
125I-merket CBLN4-Fc (300 pM) bindes spesifikt til DCC uttrykker HEK293T celler og at binding ble blokkert ved pre-inkubering av cellene med Netrin-1 (1 uM) sammenlignet med ingen behandling kontroll ( figur 6A). Ufullstendig blokkering av
125I-merket Netrin-1 (52 pM) med CBLN4-Fc (2 uM) ble observert i motsatt eksperimentet og sannsynligvis kan tilskrives den ~ 5-ganger forskjell i affinitet for CBLN4 og Netrin- en for DCC. En titrering med økende konsentrasjoner av Netrin-1 viste tydelig forskyvning av en fastsatt konsentrasjon av
125I CBLN4-Fc for å DCC uttrykker HEK293T-celler (figur 6B). Våre data viser at CBLN4 og Netrin-en bindingssteder tilordnet samme FN-regionen i DCC og sterisk overlapping.
A) kvantifisering av mengden
125I-radiomerket CBLN4-Fc eller GD-Netrin- 1 bundet til DCC uttrykker HEK293T celler eller ikke-transfekterte kontrollceller, preinkubert med umerket gD-Netrin-1 eller CBLN4-Fc, respektivt. Data fra fire uavhengige eksperimenter er vist. Hver søyle representerer 3 tekniske replikater uttrykt som betyr ± SD. Ensidige Student
t
test ble brukt: *,
P
0,05; **
P
0,01; ***,
P
0,001. B) forskyvning tomten, representant fra tredoble uavhengige eksperimenter, er vist for GD-Netrin-en konkurrerer med bindingen av
125I-radiomerket CBLN4-Fc til DCC uttrykker HEK293T celler.
Karakterisering av CBLN4 funksjon under embryonal utvikling
det er tidligere vist at DCC og Netrin-en er nødvendig for riktig veiledning og vekst av aksoner under embryonal utvikling [7], [15]. For å undersøke bidraget CBLN4 kan ha i DCC-Netrin-en signalering, ble de nevrale projeksjoner av
CBLN4
knock-out mus undersøkt. Generering av
CBLN4
knock-out mus inkludert en knockout i en LacZ uttrykk kassett som gjør at β-galaktosidase farging av
CBLN4
+/-
mus til å visualisere lokalisering av CBLN4 uttrykk. Den β-galaktosidase uttrykk mønster i
CBLN4
+/-
mus er forskjellig, blant annet til uttrykk i dorsal lem knopper på E11.5 og motorstammen i ryggmargen på E13.5 (figur 7A ). En av de store roller for DCC og Netrin-1 er å sikre riktig midtlinjen kryssing av kommissurale aksoner i den tredje ryggmargen. For å undersøke om CBLN4 spiller en rolle i midtlinjen veiledning, ble pre-krysset kommissurale axoner visualisert ved TAG-en farging i tverrgående deler av E11.5 mus (figur 7B
)
. Mens kommissurale axoner kan sees nå og krysset gulvplate i villtype mus, svært få, om noen, kommissurale axoner nå og krysse gulvplate i
Netrin-en
– /-
mus. TAG-1-farging av kommissurale aksoner av
CBLN4
– /-
mus viser at de når og krysser aksonene ligner villtype og det er ingen merkbar forskjell i immunfarging mellom
Netrin-1
– /-
;
CBLN4
+ /+ Hotell og
Netrin-en
– /-
;
CBLN4
– /-
mus eller
Netrin-en
+/-
;
CBLN4
+ /+ Hotell og
Netrin-en
+/-
;
CBLN4
– /-.
Mus
A) Lac-Z reporter uttrykk for CBLN4 i E11.5
CBLN4
+/-
mus (øverst paneler) viser karakteristiske uttrykk i lemmene inkludert rygg lem uttrykk. Lac-Z reporter farging av CBLN4 i E13.5
CBLN4
+/-
mus (nedre paneler) viser uttrykk i ryggmargen motorstammen. B) kommissurale aksoner av E11.5 ryggmarg visualisert med TAG-en farging i kombinasjoner av
CBLN4 Hotell og
Netrin-1
genotyper. C) Representative bilder og kvantifisering av vandrende axoner (hvite piler) i plexus brachialis av E11.5
CBLN4
– /-
mus. Tukey kontraster; **
P
0,01; ***,
P
0,001; n er venstre og høyre forbena nestet i mus; n = 4
CBLN4
+ /+
; n = 5
CBLN4
+/-
; n = 6
CBLN4
– /-
uttrykk for CBLN4 i å utvikle lem knopper ledet oss til å evaluere banen motor neuron axoner på dette stadiet.. Disse aksoner uttrykke DCC [7] og navigere fra motorstammen i ryggmargen til sine endelige mål innervating musklene i lem [30] og er kjent for å være lydhør overfor Netrin-1 [31], [32].
