Abstract
De fleste pre-kliniske analgetisk effekt analyser fortsatt involvere nociceptive testing hos gnagere. Dette til tross for bekymringer som til relevansen av disse testene for å vurdere smerte-forebyggende egenskaper narkotika. Mer hensiktsmessige metoder vil målrette smerte heller enn nociception, men disse er for øyeblikket ikke tilgjengelig, så det er fortsatt ukjent om dyret smerte tilsvarer den negativt affektive og subjektive /følelsesmessige tilstand det fører hos mennesker. Musecancermodeller er vanlig til tross for sannsynligheten av betydelig smerte. Vi brukte kondisjonerte sted Preference (CPP) testing, vurdering av termisk hyperalgesi og atferd for å fastslå sannsynligheten for at MBT-2 blærekreft påvirker negativt på mus velferd, for eksempel ved å forårsake smerte. Det var ingen CPP til saltvann, men morfin preferanse i tumorbærende mus skredet det man ser i tumorfrie kontroller. Dette skjedde opptil 10 dager før studien endepunktet sammen med redusert kroppsvekt, utvikling av hyperalgesi og atferdsendringer. Disse effektene er angitt mus opplevd en negativ velferds tilstand forårsaket av
utilpasshet plakater (hvis ikke smerte) før avlivning. På grunn av kompleksiteten i de vurderinger som trengs for å demonstrere dette, er det usannsynlig at denne tilnærmingen kan brukes for rutinemessig velferd vurdering på en studie-by-studie basis. Men våre resultater viser mus i tilstrekkelig tilsvarende studier er sannsynlig å dra nytte av mer intensiv alvorlighetsgrad vurdering og revurdering av endepunkter med sikte på å iverksette hensiktsmessige avgrensninger. I dette tilfellet ville en avgrensning ha vært å ha euthanased mus minst 7 dager tidligere eller muligens ved bestemmelse av end-stage smertelindring. CPP-testing ble funnet å være en nyttig metode for å undersøke responsen til mus til smertestillende, muligens på en subjektiv nivå. Disse funnene og de andre nyere studier viser det kan være en verdifull metode for screening kandidat analgetika for effekt mot kreftsmerter og eventuelt andre smerte eller sykdomsmodeller
Citation. Roughan JV, Coulter CA, Flecknell PA, Thomas HD, Sufka KJ (2014) The kondisjonerte sted Preference Test for å vurdere velferds Konsekvenser og mulige spesifiseringer i en mus blærekreft Model. PLoS ONE 9 (8): e103362. doi: 10,1371 /journal.pone.0103362
Redaktør: Bradley Taylor, University of Kentucky Medical Center, USA
mottatt: 10 september 2013; Godkjent: 30 juni 2014; Publisert: 6. august 2014
Copyright: © 2014 Roughan et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Den studien ble finansiert av det britiske nasjonale senter for 3R (NC3Rs): https://www.nc3rs.org.uk/, Grant Number G0900763, PI: JV Roughan. Den Funder hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
en rekke nociceptive tester anvendes for å bestemme den potensielle effekt av nye smertestillende midler, og laboratorie-rotter og mus er overveiende de mest brukte forsøkspersoner. Disse testene er vanligvis klassifisert i henhold til varigheten og intensiteten av det skadelige stimulus og arten av responsen. Akutte eller phasic nociceptive analyser som gjelder varme eller mekanisk stimulering (f.eks halen-flick og Hargreaves tester, von Frey, henholdsvis), på grunn av stor grad refleksive natur svarene innhentet, er mindre egnet enn tonic eller sub-kroniske tester ( f.eks formalin eller karragenan) som lokke fram betydelig og vedvarende betennelse [1]. Imidlertid er utilstrekkeligheten av både kjente [2]. Til tross for utviklingen av dyre simuleringer av vedvarende smertesyndromer (f.eks leddgikt eller nevropatisk smerte), bekymringer råde når det gjelder deres klinisk relevans. Disse siste instans stammer fra en vedvarende mangel på forståelse av hvordan dyret smerte tilsvarer den menneskelige erfaring; å være et flerdimensjonalt fenomen inkludert både sensoriske og affektive følelsesmessige tilstandsendringer (samlet kalt «livskvalitet» endringer). Teoretisk minst, bør dyret smerte og smertestillende analyser som informerer om endringer i disse landene har råd til større translasjonell gyldighet. Dette behovet har drevet de siste samtalene for utvikling av mer klinisk relevant
in vivo
modeller [3], [4] gir en flere systemer basert tilnærming [5]. Denne begrunnelsen forklarer hvorfor affektiv (subjektive) state vurderingen blir i økende grad betraktet som en mer relevant tilnærming til å etablere velferds konsekvensene av modeller der dyr kan utsettes for smerte [6] – [8]. Kreft modeller er en forskningsområde hvor betydelig mer kunnskap om hvor stor utstrekning smerte konsekvenser for velferd kan være lang forfallen.
Et stort og stadig økende antall dyr (hovedsakelig mus) brukes i kreft testing (471 000 i Storbritannia i 2012, en økning på 16% fra året før [9]) med bare minimal kunnskap om potensielt negative virkninger på velferd. Men til de retningslinjer som er ment å minimere lidelse i disse studiene [10], [11] ikke innlemme noen evaluering av endringer i underliggende subjektive tilstand, og skaffe bevis for kreftsmerter hos gnagere har støttet seg tungt på vurderingen av underliggende nociceptive endringer [12 ] – [15], og det synes dette fortsatt er tilfelle i dag [16] – [19]. Vår gruppe har omfattende vurderes endringer i naturalis atferd som et middel til å vurdere postoperativ smerte hos gnagere og andre arter ved hjelp av både manuelle [20] – [26] og automatiserte metoder [27] – [30], eller brukt en kombinasjon av begge deler typer av analyse [31]. Imidlertid har slike atferdsanalyse sjelden blitt brukt til å vurdere virkningene av kreft, og de få studier som siterer «smerteatferd «egentlig betyr nociceptive eller nocifensive atferd (dvs. abstinens eller vokter) snarere enn ekte spontan (f.eks hjemme-bur) atferd ( se for eksempel [14], [32]). Uansett hvilken metode for datainnsamling blir brukt, etablere koblinger mellom utfall og årsakssammenheng i atferdsstudier er vanskelig fordi mange faktorer kan bidra til de observerte endringene. Endringer kan forekomme som en indirekte følge av saksbehandlings påvirkninger (f.eks anestesi, hypotermi, dehydrering) eller forhold knyttet til disse som frykt og tilhørende angst. Likevel, å etablere hvorvidt og når smertene oppstår i kreftstudier ville ha betydelige konsekvenser. For det første vil det stimulere til en mer kritisk tilnærming til etiske beslutninger ved at forskere å bruke kost-nytte mer effektive analyser når man skal avgjøre om endepunktene er berettiget. Bedre velferds standarder på denne måten vil også være gunstig for studier fordi unalleviated smerte kan også true modell gyldighet. Prevensjon av smerte har vist seg å være fordelaktig for gyldighet i det minste en prøve kreft [33] og muligens andre
in-vivo
forskningsapplikasjoner [34]. Kreftsmerter er også et område hvor utviklingen innen menneske behandlinger er presserende behov. Smerte er den vanligste og fryktet konsekvens av kreft og mellom 30-60% av kreftpasienter fortsette å rapportere smerte før, under og etter behandling [35]. Ja, det synes utsiktene er fortsatt dystre tross 40 års forsøk på å løse problemet [36]. Åpenbart må kreftsmertebehandling å være raffinert, og dyr kreft modellene gir en ideell plattform for parallell fremgang på velferd avansement og medisiner. Til tross for dette, er kreft modeller ikke er vanligvis anvendt for å screene potensielle analgetiske midler, med bare få unntak [13], [37]. Dette kan være fordi de fleste kreftstudier har alternative mål, men kan også være på grunn av mangel på egnede vurderingsmetoder; dvs. de som imøtekomme subjektive aspektene.
Betinget Place Preference (CPP) testing er mye brukt til å evaluere psyko (affektive) av legemidler til dyr [38], men som regel å identifisere misbruk ansvar av mennesker. Dyr er betinget av å være innesperret i en «plass» og sammenkobling som med medikamentell behandling, mens i et annet sted de får bare en placebo. Som «steder» har distinkt forskjellige signaler (vanligvis i farge eller tekstur) dyr gradvis knytte stoffer «påvirke med stedet der de opplevde det. Hvis dette er en givende opplevelse, enten på grunn av narkotika «positivt eller negativt forsterkende (smertestillende) effekter, dyr vanligvis tilbringe lenger i, eller besøke narkotika-paret sted oftere. Utdeling av analgesi er en positiv erfaring i smertefulle mennesker, så hvis det samme gjelder dyr så CPP studier har potensial for å vurdere både aversive egenskapene til smerter og smertestillende effekten av narkotika. Tilnærmingen har i økende grad blitt brukt til forskning på smerte etter den første demonstrasjonen som leddgikt årsaker forbedrede CPP til morfin og N-metyl-D-aspartat antagonist MK-801 [39]. Det ble senere vist at en bradykinin B
1-reseptorantagonist har terapeutisk potensiale mot kronisk inflammatorisk smerte [40]. En betydelig tid senere kong et al. viste CPP er også en effektiv metode for vurdering av smertestillende midler mot neuropatisk smerte [41]. Qu et al. illustrert relevansen av CPP for å vurdere subjektive aspektene av nevropatisk smerte i rotter ved å vise at den rostrale fremre cingulate cortex er avgjørende for å mediere smerte påvirke [42]. Rutten et al. var også i stand til å bruke CPP å distansere mellom positivt og negativt givende konsekvensene av analgetika med opioid-lignende påvirker forhold til andre mekanismer i en rotte inflammatorisk (karragenan) modell [43]. Davoody et al. Da viste økt CPP til klonidin (en α-2 agonist) i rotter ved hjelp av ryggmargsskade som en sentralisert smerte modell [44]. Okun et al. benyttet en lignende tilnærming for å vise CPP til flere forskjellige medikamenter i en osteoarthritic modell [45], og sist, Park et al. viste fravær av positiv forsterkning (belønning) til gabapentin i normale mus, men CPP i en polyneuropathic smerte modell forårsaket av antineoplastiske (cisplatin) behandling [46]. Sammen er disse funnene viser tydelig at CPP paradigmet er i stand til å gi dyr med et middel til å rapportere om deres bevissthet om smerte, og så kunne tilby en mer hensiktsmessig metode for å vurdere sin sentralisert (affektiv /subjektive) i motsetning til nociceptive (effektive) egenskaper.
den oppfatningen at smerte kan være så komplisert hos dyr (i hvert fall i pattedyr) som det er hos mennesker understrekes av det faktum at ingen enkelt målekriterium kan (så langt) effektivt vurdere det. Bateson et al. opprinnelig brukt en flere tiltak tilnærming til vitenskapelig problemløsning (senere kalt «triangulering») [47], siterer at selv om «bevis innhentet av ulike tilnærminger var tvetydig», «når hele kroppen av bevis ble ansett, kunne mye større tillit plasseres på en bestemt mening «. I ta opp problemet med dyrs lidelser, og akseptere at «vi ikke kan direkte observere en dyrenes følelser», anbefales Bateson at «vi bør bruke en rekke oppgaver for å få tillit i konklusjonene» [48]. Følgelig studier er nå i økende grad å anvende flere forskjellige tiltak i et forsøk på å karakterisere smerte mer pålitelig [49], [50]. I denne studien har vi tatt et tilsvarende tilnærming ved å vurdere en standard velferds parameter (kroppsvekt) sammen med perifer overfølsomhet testing, overvåking spontan utforskende atferd og gjennomføre CPP testing. Til tross for flere begrensninger, gir hyperalgesi (overfølsomhet) testing fortsatt en verdifull sekundær indikator på smerten av ulike modaliteter inkludert kreft [12], [16], [19]. Atferds endringer er også en vanlig reaksjon på smerte, men datainnsamling og analyser er ofte tidkrevende, spesielt hvis den anvendes i studier som vanligvis vare i flere uker; som vanligvis er tilfellet i studier av kreft. Tolkning av disse data kan også være problematisk fordi, slik det allerede er beskrevet, er det alltid alternative forklaringer for eventuelle adferdsendringer som blir funnet. Et ofte sitert mulighet er at tegn på manglende evne hos gnagere kan være skjult som en adaptiv respons for å redusere sannsynligheten for rovdyr; men så vidt vi vet har dette aldri vært vist utvetydig. For å i det minste delvis overvinne tidsbegrensningen vi brukte automatisert atferd registreringsprogrammet (HomeCageScan; Clever Systems Inc., VA, USA (HCS)). Dette anerkjenner et område ( 20) mus atferd med sammenlign nøyaktighet til manuell analyse av en trenet observatør [27], [28]. I denne studien kontras vi funn på hyperalgesi og adferd endres med resultatene av CPP testing for å vurdere konsekvensene av blærekreft på velferden til mus; å anvende konseptet med triangulering. Så langt vi kjenner til, er det ikke gjort tidligere forsøk på å evaluere CPP tilnærmingen som er beskrevet her under svulst utvikling; med påfølgende condition og testing sykluser. Vi har også søkt å måle (i det minste hypotetisk) om dette kan være en nyttig tilnærming til screening av kandidat medikamenter for behandling av kreft smerte hos mennesker. Vi fant kreft mus fått mindre vekt, utviklet hyperalgesi og viste atferdsendringer som ble tids knyttet til økt morfin søker i tumorbærende mus i de 7 dagene før avlivning. Vi konkluderte med at den mest sannsynlige forklaringen på disse endringene var smerte. Hvis ikke på grunn av smerter, i det minste resultatene indikerte negative virkninger på velferd, muligens inkludert
utilpasshet
. Vanligvis mus ville bare bli fjernet fra studier etter denne tiden, noe som indikerer en sannsynlig behov for endepunktet raffinement i denne musemodell av blærekreft. Vår metode for å bruke CPP testing kan også være et potensielt nyttig metode for å teste effekten av smertestillende beregnet for kreft og andre forhold, spesielt de hvor smerte kan eskalere over tid.
Metoder
Etikk Statement
Alt arbeid ble utført i samsvar med dyr (vitenskapelige prosedyrer) Act 1986 og var gjenstand for lokal etisk vurdering. Forsøkene også levd opp til retningslinjene i Utvalget for forskning og etiske problemstillinger av International Association for Study of Pain (IASP). Alle prosedyrer ble godkjent av den britiske Home Office (Prosjekt Licence PPL 60/4431).
Fag og Husbandry
Alle mus ble kvinnelig C3H /høne, veide 25-30 g ved levering (Charles River Laboratories Inc., UK) og hadde fri tilgang til et kommersielt pelletert diett (R . M nr.3 SDS LTD, Whitham, UK) og vann fra springen i grupper på 10 for en uke med akklimatisering. De ble deretter plassert enkeltvis (Macrolon 2 bur, North Kent plast, UK) for en uke før innmelding. Sagflis og spon ble brukt som senger og bur ble supplert med «Sizzle Nest «, en osp tygge-blokk og en papprør (B K Universal). Romtemperatur ble opprettholdt ved 21 ± 1 ° C med 15-20 luftvekslinger per time under en 12-timers lys syklus (lysene av på 19:00 h). All testing ble utført mellom klokken 10 og 15:00
Datainnsamling
Resultatene fra 3 studier med separate grupper av mus er beskrevet.; (1) Hargreaves (nociceptive testing) studie (2) Behaviour studie og (3) Betinget Place Preference (CPP) testing består av en Pilot dose varierer etterforskning og deretter en hovedstudie. De oppnådde på studier 1 og 2 data var fra utforskende studier foretatt av kolleger av den nord Institute for Cancer Research (NiCr) med syngene MBT-2 (mus Blære Tumor) celler avledet fra C3H /høne /J-mus (celler donert av Prof. Michael O’Donnell (University of Iowa, Iowa City, IA, USA) og Dr. William A. Larchian (EMH /Cleveland Clinic prostata Centre, Cleveland, Ohio, USA)). CPP-data ble erholdt fra mus er spesielt oppnådd for testing. Vår kollega mål var; i første omgang å karakterisere vekst profilen til orthotopically implantert blæren svulster (Studie 1) og deretter å avgrense implantatet metodikk (studie 2). Men begge studiene var en mulighet til å samle inn supplerende data om patologiske effekter (muligens inkludert smerte) som ville hjelpe i utformingen av hoved (CPP) studie; og dermed redusere bruk av dyr til et så lavt nivå som mulig.
Hargreaves Study
Dette var en pilotstudie gjennomført for å etablere vekst kjennetegn orthotopically implantert MBT-2 celler som vil informere om eventuell utformingen av CPP studien. Gruppestørrelser ble bestemt av NiCr kolleger basert på deres studiekravene. Mus ble tilfeldig fordelt til tre grupper på 5 som gjennomgikk laparotomi for ortotopisk implantering av 100 ul av Dulbeccos fosfatbufret saltløsning (DPBS), eller det samme volumet av DPBS inneholdende 2 x 10
4 eller 2 x 10
5 MBT -2 celler. En fjerde gruppe på 5 mus ble anestesi bare kontroller. Åtte mus som gjennomgikk kirurgi ble tilfeldig utvalgt for å motta 5 mg /kg meloksikam (subkutant; s /c) for å lindre postoperativ smerte [27], mens resten fikk saltløsning (0,3 mls s /c; n = 7). Anestesi ble indusert med 5% isofluran i oksygen (5 l /min.) I en Perspex kammer. Mus da lå i ryggleie på et varmeteppe for å opprettholde kroppstemperatur mellom 34,5 og 37,5 ° C og anestesi ble opprettholdt med 1,5-2% isofluran i oksygen (500 ml /min.). Dybde ble overvåket ved å observere luftveiene priser og regelmessig vurdere tå-pinch reflekser. Enkel øyesalve (Pliva Pharma Ltd., UK) ble anvendt for å forhindre hornhinnen tørking. Kirurgi var en 0,5 cm midtlinjen snitt i huden og musklene liggende blæren. Når eksponert, ble 0,1 ml av saltløsning eller den passende tumorcellesuspensjonen injiseres intramuskulært i blæreveggen ved hjelp av en insulinsprøyte. Magemusklene og huden ble lukket separat med 5/0 polyglaktin 910 ( «Vicryl», Ethicon Ltd, Edinburgh, UK) og vev lim ( «Nexaband», Abbott Laboratories, Chicago). Anestesi varte ca 10 minutters
Termiske abstinensventetider ble utført ved start og på en time og en dag (24 timer) etter operasjonen, og deretter på dager.; 3, 7, 10, 14, 17, 21 og 24 ved hjelp av plantar Test (modell 37370, Ugo Basile, Italia) i henhold til metoden ifølge Hargreaves [51]. Dyrene ble plassert i klare akryl kamre på en glassgulv og tilvendt i 10 minutter. En infrarød varmekilde ble vekselvis brukt til mid-plantar område av hver bakfot (70% av maksimal varmekapasitet, tilsvarende 253 ± 7 mW /cm
2; 30 andre cut-off). Dette ga et passende utvalg av responsventetider i normal mus (~between 3 og 8 sekunder). Tre reaksjoner ble oppnådd fra hver bakpote med et minimumsintervall på ett minutt mellom ipsilaterale opptak. Data ble bare hentet fra anestesi kontroll mus inntil dag 3 når de ble pålagt andre steder. Kroppsvekt ble registrert daglig til dag 4, og deretter på nociceptive testdager. Som svulster var interne, ble veksten scenen estimert ved daglig palpering av en erfaren tekniker som gradert svulster på et 3 punkts skala; fra 1 (knapt til stede) til 3 (åpenbart uten behandling). Disse inspeksjonene også inkludert en registrering av aktiviteter knyttet til magesmerter hos gnagere [21], [31] og andre tegn på dårlig helse som hematuri, slapphet, dehydrering og dårlig pels og kroppens tilstand.
Behaviour Study
oppførselen data ble samlet inn som en del av en oppfølgingsstudie (igjen uten ytterligere bruk dyr) for å vurdere en potensielt mer raffinert (ikke-kirurgisk) metode for celle implantasjon [52]. Våre kolleger søkt å etablere hvis svulst engraftment kan forbedres med denne metoden, mens vi ønsket å evaluere langsiktige virkningen av kreft vekst på atferd. Som før, gruppestørrelser var pre-bestemt; 20 mus ble allokert til gruppe DPBS og 20 til tumoren gruppen. Anestesi ble indusert som beskrevet tidligere, men i grupper på 5 mus ved hjelp av en skreddersydd åpen maske gassleveringssystem. Implantasjonen er allerede blitt beskrevet, men kort, blæren hos hver mus var tilgjengelig via en 27 gauge kanyle pediatrisk plassert i urinrøret. Urin ble annullert ved forsiktig supra-kjønnshår press og aspirasjon, og blæren slimhinnene betinget med en mild syre skylling (50 ul 0,1 M HCl) i 20 sekunder. Dette ble også aspirert og deretter nøytralisert med 50 ul 0,1 M KOH, og tre vaskinger DPBS. Blæren ble tømt før instilling 50 ul 5 x 10
6 MBT-2-celler, eller det samme volumet av DPBS via en sprøyte bundet til halen. Jo større cellekonsentrasjonen var i påvente av en ukjent cellefraksjon blir annullert i urinen etter utvinning. Celler ble forlatt
in-situ
i 30 minutter, hvoretter musene ble plassert i en inkubator ved 37 ° C i 20 minutter. Daglig svulst utvikling ble overvåket som før og kroppsvekt ble også registrert daglig. Musene ble filmet individuelt i 10 minutter ved hjelp av et videokamera (Sony DCR-HC96, Sony, Japan) plassert på et stativ 30 cm fra fronten av klare «1284»cages (35 × 20 × 14 cm, Techniplast, UK Ltd) som inneholder bare sengetøy (Aspen sagflis). Fremgangsmåten for virkemåten for datainnsamling ble som tidligere beskrevet [28] med unntak av at det var på alternative dager før tumordeteksjon, og deretter daglig. Filming var alltid under den lette fasen, men den tiden av døgnet hver mus ble filmet ble randomisert innen kreft og kontrollgrupper.
kondisjonerte sted Preference Studier
CPP Arbeidet ble utført i 2 trinn. Den første var en pilotstudie for å utforske utviklingen av CPP til morfin etter gjentatte condition og testing sykluser, og for å identifisere en morfindose for hoved CPP studien. Den valgte dose vil være en som støttes bare beskjeden plass preferanse, men beholdt tilstrekkelig smertestillende egenskaper for å lokke fram negativ forsterkning i tumorbærende mus. Tall ble bestemt med en retrospektiv maktanalyse på tidligere morfin CPP resultater på tvers av en rekke doserater i normale mus (1 og 5 mg /kg s /c) [53] som også bør lokke fram signifikante analgetiske effekter [54], [55] . Utvalgsstørrelser på 8 eller 10 ble retrospektivt funnet å oppnå 79% eller 91% effekt i å oppdage betydelig CPP til et stoff (3 eller 5 mg /kg morfin) versus placebo-paret rommet. CPP apparatus besto av svart (stålstang bakoversveis) og hvitt (stål grid floored) avdelinger atskilt med en grå (fast gulv) starter kammeret. Vi brukte 4 identiske test enheter (Med Associates, St Albans, VT, USA; Modell CPP-3013AT) utstyrt med automatisk kontrollerte guillotine dører og lys. Avdelinger plassert infrarøde arrays automatisk ta opp kupé oppholdstider og bevegelser innenfor og mellom 3 rom. En innledende studie ble anvendt for å bestemme grunnlinjen rommet preferanse for hvert dyr. For dette ble de plassert i den sentrale (grå) starter kammer i 1 minutt før du slår på lysene og åpne giljotinen dørene. Preference testing ble alltid gjennomført mellom klokken 10 og 14:00. Den relative tid å utforske de svarte og hvite avdelinger i løpet av en påfølgende 15 minutters prøve ble beregnet som en andel av den totale prøvetiden (se CPP dataanalyse avsnitt). Musene ble tildelt for S + (saltvann eller morfin) condition i rommet der de tilbrakte forholdsmessig minst mulig tid (dvs. deres ikke-foretrukne kammer), men ingen mus viste forholdsmessige innledende kupé preferanser som overstiger 0,6 (CPP analyse avsnitt detaljer preferansen beregningsmetoden). Utformingen ble deretter mot balansert slik at den innledende relative gruppen preferanse ligger så tett som mulig til 0,5 (dvs. like tall ble tilordnet hver gruppe til det svarte (B) eller hvit (W) S + kamre). På dette grunnlag åtte mus ble fordelt til hver av 2 morfin grupper som spenner over sannsynlige effektive smertestillende doserater (1 eller 5 mg /kg s /c) og en representativ gruppe av 4 mus var saltvann kontroller. Når vi har nådd det stadiet av kreft testing visste vi den tradisjonelle CPP tilnærming av repetitive condition prøvelser etterfulgt av en enkelt preferanse test ville ikke være passende. Dette var fordi hvis smertene forekommet; Vi ønsket også å fange sin debut. Informert av dette, alle CPP testing (inkludert i pilotstudien) besto av repetitive 3 dagers blokker, med hver blokk bestående av 2 dager av klimaanlegg før et rusfritt preferanse test hver påfølgende dag (vist i figur 1). For pilotstudien de 4 kontrollene fikk bare saltvann (0,03 ml s /c) under både S- og S + forhold. På grunn av mulig morfin «carry-over» til ettermiddag S + forsøk var det nødvendig at kjøretøy (S-) injeksjoner ble alltid gitt i morgen og S + (morfin eller saltvann) i ettermiddag. Morfin ble oppnådd som morfinsulfat-oppløsning (30 mg /ml; NHS Materialer, UK) og er passende fortynnet med vann for injeksjon (WFI) for å bli administrert subkutant i et volum på 0,03 ml. Alle injeksjoner ble gitt umiddelbart før plassering i den tildelte B eller W rommet for en 45 minutters behandlingsperiode med giljotinen dørene lukket. Musene ble returnert til sine hjem merder umiddelbart etter hver conditioning økt. Fire påfølgende preferanse tester ble gjennomført for pilotstudien (4 test blokker; figur 1). Nettopp etter den metoden som brukes for å bestemme startrommet preferanse
Skiftende blokkene ble hver av de to condition dager hvor mus gikk morgen S- (saltvann) og deretter ettermiddag S + (morfin eller saltvann) behandlinger og ble innesperret i 45 minutter i svart eller hvitt kammeret. Den tredje dagen i hver blokk var et stoff gratis preferanse test, og tre dagers syklus ble gjentatt inntil aktiv dødshjelp.
Hoved CPP etterforskningen startet med en reprise av første preferanse testing. Hver mus ble gitt en B eller W kammeret for påfølgende S- /S + ring på den tidligere beskrevne måte (balansering tall opprinnelig foretrakk B eller W rommet på tvers av kontroll- og tumor-grupper). Som tidligere, ble mus plassert i sine opprinnelig ikke-foretrukne rommet så langt som mulig. Tumor-mus ble implantert igjen via urinrøret med 50 pl DPBS inneholdende 5 x 10
6 MBT-2-celler. Tretti-mus ble orthotopically implantert med tumorceller, og ti ble saltløsningskontrollene. Disse tallene ble informert av våre tidligere funn på antall pode svikt følgende urethral implantasjon. Vi planla å balansere design (og videre bevare dyrebruk) ved å tildele slike feil å kontrollere grupper, men bare hvis det var ingen opplagte eller andre tegn på svulst utvikling etter 21 dager. Tumor fravær ble også bekreftet
post-mortem.
Når kliniske inspeksjoner bekreftet tumorvekst, begynte hver mus CPP kondisjonering og behandling matchet ikke-tumorkontroll gikk inn i studien samtidig. 3 dagers serie condition og testøkter deretter fortsatte frem til mus ble euthanased (se avsnittet om sluttpunktbestemmelse). Eksperimentelle grupper dannet derfor en 2 (Drug) × 2 (Behandling) faktoriell design som kombineres condition til morfin eller 0,9% saltvann i tumor eller ikke-tumor mus. Vi valgte en mellomliggende dose morfin (2 mg /kg s /c) for hoved studie basert på resultatene av pilotstudien. I hoved CPP studie preferansetester var også 45 i stedet for 15 minutter, men metodikken var ellers identisk med den som brukes i pilotstudien. På grunn av tidspress og potensialet forvirre av plassering i andre ukjente miljøer (effektivt andre «steder»), ble atferd og hyperalgesi vurderinger ikke gjennomføres som CPP studien kommet. Imidlertid ble effekten av sent stadium smertestillende behandling på atferd vurdert som en potensiell raffinement alternativ. Dette betydde at for eutanasi dager mus ble filmet i 20 minutter før og etter injeksjon av det kondisjone dose av morfin (2 mg /kg s /c) og identiske registreringer ble gjort fra et tilsvarende antall kontroller på den siste dagen av studien.
Slutt-punktbestemmelse
Kliniske inspeksjoner ble gjennomført i alle studier for å finne ut om tumorbærende mus trengs for å bli trukket tilbake. Disse var i samsvar med publiserte retningslinjer [10], [11] og med råd fra erfarne dyr omsorg ansatte. Avlivning var uunngåelig når dyrene hadde en stor håndgripelig svulst eller mer enn 15% av kroppsvekten tap, og hvis en av disse sammenfaller med betydelig hematuri (angitt med blod farget pels og /eller sengetøy). Alle mus inkludert kontrollene gikk palpasjon. De ble behersket på den måte som er vanlig for en intraperitoneal injeksjon. Blæren regionen ble deretter forsiktig palpated mellom tommel og pekefinger, men med tilstrekkelig press for å bestemme den tidligste tiden av utbruddet av svulst utvikling så pålitelig som mulig.
Data Analysis
Hargreaves studien.
Som respons ventetider var innledningsvis lik mellom venstre og høyre bakben-poter, ble alle verdier i gjennomsnitt til å beregne den samlede gjennomsnittsrespons ventetid på hvert opptak. Dataene oppfylt kravene for parametrisk analyse så ble undersøkt ved hjelp av gjentatte målinger ANOVA med «Time» (10 nivåer) og «Gruppe» (4 nivåer, 2 × svulst, 1 × placebo og anestesi kun) som i og mellom-fagets faktorer henholdsvis .
Post-hoc
individuell tids og gruppe sammenligninger ble gjort og sannsynlighetsnivåer justeres deretter (
Bonferroni
). kroppsvektendring De ble også beregnet som endring fra baseline og de samme statistiske metoder anvendt. For større klarhet, er vektforandringer rives som absolutte verdier ved hver tids-punkt. På grunn av fravær av nociceptive data i de ikke-kirurgi kontroll mus etter dag 3 og kroppsvektdata etter dag fire alle analyser følge disse tider inkluderte kirurgi kun grupper. Til slutt, ble effekten av pre-kirurgi meloksikam undersøkt ved å sammenligne referanseresponsventetider til en times tid punkt i ANOVA; men med «pre-behandling» (meloksikam eller saltvann) som mellom motivets faktor (n = 7 (Saline) versus n = 8 (meloksikam)).
Behaviour studien.
Oppførselen dataene ble behandlet ved hjelp av HCS automatiserte analyseprogramvare. Tiltakene som ble brukt var totale distansen og fem atferd klasser bestående av ulike elementer av de 20 individuelle atferd systemet anerkjent. Disse var: 1) stell (bestående «Rear Up «(både delvis og full tobent forlengelse) gjensidig aktivitet» Come Down»); 2) Aktiv atferd (inkludert gåing, løping, hopping og klatring); 3) Abdominal Grooming, og 5) Hvile (inaktive perioder). Vi oppsummerte forekomster av atferd innenfor hver klasse som den relative størrelsen av klasse elementer var tilstrekkelig uniform.
