Abstract
Kombinert målretting av MAPK og PI3K signalveier i kreft kan være nødvendig for optimal terapeutisk aktivitet. For å støtte kliniske studier med kombinasjonsbehandling, 3′-deoksy-3 «- [
18F] -fluorothymidine ([
18F] -FLT) opptaket målt ved Positron Emission Tomography (PET) ble vurdert som en non-invasiv surrogat respons biomarkør i prekliniske modeller.
in vivo
anti-tumor effekt og PK-PD egenskapene til MEK hemmer PD 0325901 og PI3K inhibitor GDC-0941, alene og i kombinasjon, ble evaluert i HCT116 og HT29 menneskelige tykktarmskreft xenograft tumor bærende mus, og [
18F] -FLT PET undersøkt i mus med HCT116 xenografter. Dual målretting av PI3K og MEK indusert markert tumorvekstinhibitering
in vivo
, og forbedret anti-tumor aktivitet ble spådd av [
18F] -FLT PET-skanning etter 2 dagers behandling. Farmakodynamiske analyser ved bruk av en kombinasjon av PI3K inhibitor GDC-0941, og MEK-inhibitor PD 0.325.901 viste at økt virkning er forbundet med en forbedret inhibering av fosforyleringen av ERK1 /2, S6 og 4EBP1, sammenlignet med det som ble observert med enten enkel middel, og opprettholdt hemming av AKT fosforylering. Farmakokinetiske studier indikerte at det var ingen markert PK interaksjon mellom de to medikamenter. Til sammen indikerer disse resultatene at kombinasjonen av PI3K og MEK-inhibitorer kan resultere i betydelig effekt, og demonstrerer for første gang at [
18F] -FLT PET kan korreleres til den forbedrede effekt av kombinert PI3K og MEK-inhibitor behandling.
Citation: Haagensen EJ, Thomas HD, Wilson jeg, Harnor SJ, Payne SL, Rennison T, et al. (2013) Enhanced
In Vivo
aktivitet av kombinasjonen av en MEK og en PI3K inhibitor korrelerer med [
18F] -FLT PET i Human tykktarmskreft Xenotransplantat Tumor-bærende mus. PLoS ONE 8 (12): e81763. doi: 10,1371 /journal.pone.0081763
Redaktør: Seema Singh, University of South Alabama Mitchell Cancer Institute, USA
mottatt: 5 juli 2013; Godkjent: 16 oktober 2013; Publisert: 10.12.2013
Copyright: © 2013 Haagensen et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. HDT, IW, SJH, SLP, TR, KMS, RJM og DRN er finansiert av Cancer Research Storbritannia (CRUK) Drug Discovery, Imaging og legemiddelkjemi opplæringsprogrammer (C240 /A15751 og C29821 /A10348) EJH var en Medical Research Council (MRC) CASE Award Doktorgradsstipendiat støttet av UCB Celltech, Slough, UK. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Alle Forfatterne erklærer ingen interessekonflikt relevante for innholdet av dette papiret med unntak av David R. Newell som er på Advisory Board of Wilex AG styret. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling Cover Letter data og materialer
Innledning
Mange små molekyl hemmere av bestemte signaloverføringsveier har blitt utviklet.; Særlig har den PI3K veien, en større overlevelse vei, og MAPK vei, en stor mitogen vei, vært målrettet i kreft. Men monoterapi klinisk aktivitet med disse hemmere har generelt vært beskjeden, og dermed kombinasjoner blir evaluert [1]. Mange kombinasjoner av PI3K og MAPK hemmere har vist lovende aktivitet
in vitro
men noen av de mest imponerende resultater har blitt sett
in vivo
.
Som en enkelt agent, pan PI3K inhibitor GDC-0941 har beskjeden preklinisk
in vivo
effekt, med doseavhengig aktivitet over området 25-150 mg /kg /dag i U87MG glioblastom xenograft modell [2]. Deretter doser på 75-150 mg /kg er blitt vist å resultere i tumorvekst-inhibering i en rekke humane tumor xenograft-modeller, inkludert tumorer som er
PIK3CA
mutant,
PTEN
null,
EGFR
mutant eller villtype, med en tilhørende reduksjon av AKT-fosforylering og S6 [2], [3], [4], [5], [6]. GDC-0941 vises lovende prekliniske farmakokinetikk med god oral biotilgjengelighet (78% hos mus), og på bakgrunn av disse dataene og den anslåtte farmakokinetikk hos mennesker [2], [7], er nå gjennomgår fase I og II kliniske studier som monoterapi eller i kombinasjon med kjemoterapi [8], [9].
allosterisk MEK hemmer PD 0.325.901 også utstilt lovende selektiv pre-klinisk anti-kreft effekt
in vivo
som en enkelt agent, doser på 10-25 mg /kg forårsaker betydelig tumorvekstinhibitering og i mange tilfeller regresjon, i en rekke murine og humane tumor xenograft modeller, inkludert de som var
BRAF
eller
KRAS
villtype eller mutant [6], [10], [11], [12], [13], [14]. Vekstinhibering oppnådd med høye doser av PD-0325901 var ledsaget av en reduksjon i ERK1 /2 fosforylering, som ble opprettholdt selv når lavere doser på 1,5-3 mg /kg PD 0.325.901 ble anvendt; men disse lavere doser var bare i stand til å forårsake en beskjeden tumorvekstforsinkelse [6], [10], [11], [12]. Oral og intravenøs doser av PD-0325901 ble vist å ha sammenlignbar biotilgjengelighet, var ikke-toksiske ved 100 mg /kg, og resulterte i en doseavhengig inhibering av ERK1 /2 fosforylering i rottelever og lungene på grunn av inhibering av MEK [15]. Men kliniske studier som monoterapi PD 0325901 ble forbundet med okulær og nevrologisk toksisitet, slik som retinal vene okklusjon [16], og dermed kliniske studier med monoterapi PD 0325901 er avsluttet [8].
Som MEK hemmer PD 0325901 dukket lovende som monoterapi, men viste toksisitet i kliniske studier, og tumorvekstinhibitering var beskjeden med PI3K inhibitor GDC-0941 selv ved høye doser, disse og andre PI3K og MEK-hemmere blir nå undersøkt klinisk i kombinasjon studier [8]. For å oppnå dette, er PD 0325901 blir studert i kombinasjon med PI3K /mTOR-hemmer PF-04691502, og GDC-0941 er i en klinisk studie i kombinasjon med MEK hemmer GDC-0973 [8].
in vivo
pre-kliniske studier har vist at kombinasjoner av PI3K og MEK-inhibitorer gående føre til forbedret tumorveksthemning sammenlignet med hvert enkelt middel, og i mange tilfeller forårsake regresjon i en rekke humane tumor xenograft og musetumormodeller med en rekke genetiske bakgrunn, inkludert de med
KRAS
,
BRAF
og /eller
PIK3CA
mutasjoner og /eller
PTEN
slettinger [6 ], [12], [17], [18], [19]. Videre respons observert med kombinasjonsbehandlingen var ofte holdbar, til tross for forholdsvis lave doser av begge inhibitorer som blir anvendt i mange studier. Kombinasjonen av PI3K og MEK-inhibitorer er blitt vist å redusere fosforylering av S6, AKT og ERK1 /2 [12], [19], og intermitterende doserings studier har vist forlengede effekter på nedstrøms markører for proliferasjon og apoptose, for eksempel et vedvarende reduksjon i cyklin D1 og en økning i Bim nivåer, noe som kan være ansvarlig delvis for den forbedrede responsen observert med kombinasjonsterapien [6], [19].
Farmakodynamiske biomarkører av MAPK og PI3K veien modulasjon, såsom de som er nevnt ovenfor, krever gjentatte invasiv biopsier, og kan følgelig ikke være klinisk mulig. Videre har endringer i tumorstørrelse eller stabilisering sykdom, som målt ved volumetriske avbildningsmetoder, slik som CT og MR, kan merkes først etter flere ukers behandling, noe som kan forsinke kliniske beslutningstaking og potensielt resultere i pasienter som feilaktig er igjen på ineffektiv og toksisk behandlinger for lengre perioder. For å møte de begrensningene av konvensjonell volumetrisk bildebehandling, er positronemisjonstomografi (PET) som brukes i pre-kliniske studier og kliniske studier som en funksjonell surrogat respons bilde biomarkør [13], [14].
fluorine- modifisert tymidinanalogen, 3′-deoksy-3 «- [
18F] -fluorothymidine ([
18F] -FLT) er et PET radiotracer som brukes for å detektere anti-proliferative effekter, som opphopning i cellene bestemmes ved ekspresjon og aktivitet av enzymet tymidinkinase 1 og spesifikke nukleosid-transportører, som begge er under kontroll av S-fasen cellesyklus regulatorer [13], [14], [20], [21], [22], [ ,,,0],23]. Videre er opptaket av [
18F] -FLT har vist seg å korrelere med standard sprednings markører, slik som Ki67, TK1 og BrdU-opptak [24], [25], [26], [27], [28] , [29]. Ved hjelp [
18F] -FLT PET, endringer i spredning sammenlignet med utgangspunktet er påvist i en rekke menneskelige tumorxenografter så tidlig som 18, 24 og 120 timer ved hjelp av enten monoterapi GDC-0941 eller PD 0325901 [13], [14], [30], [31]. I tillegg [
18F] -FLT PET har allerede blitt brukt til å forutsi effekten av kjemoterapi og strålebehandling [32], [33], [34] og nylig to kliniske studier har begynt med MEK hemmer AZD6244 som monoterapi innlemme [
18F] -FLT PET [8], [35].
Formålet med de beskrevne i denne rapporten studiene var å finne ut om [
18F] -FLT PET kan brukes som en surrogat respons biomarkør for kombinert MEK og PI3K hemmere, som et forspill til kliniske studier.
Metoder
Etikk erklæringen
Alle forsøkene ble gjennomgått og godkjent av Newcastle University (UK) dyrevelferd komité, og ble utført i henhold til retningslinjene for velferd og bruk av dyr i kreftforskning [36] og nasjonal rett under prosjektet lisens (PPL60 /4442) utstedt av den britiske regjeringen Home Office under dyr ( vitenskapelig prosedyre) handle 1986.
Cellelinjer linjer~~POS=HEADCOMP og amp; Reagenser
HCT116 og HT29 menneskelige kolorektal kreft celler ble oppnådd fra ATCC (American Type Culture Collection). Alle cellelinjer ble dyrket i RPMI-1640-medium (supplert med 10% (v /v) bovint føtalt, 1% (volum /volum) penicillin (50 U /ml) – streptomycin (50 mg /ml) og 2 mM L -glutamine) og ble bekreftet fri for mycoplasma forurensning av regelmessig testing med Mycoalert (Cambrex, Iowa, USA).
hemmere
Den MEK hemmer PD 0325901 ble vennlig levert av UCB Celltech, Slough, Berkshire, UK. Den PI3K inhibitor GDC-0941 ble enten syntetisert i huset [37] eller kjøpt fra Stratech Scientific Ltd, Newmarket, Suffolk, UK. Alle grupper av GDC-0941 ble fullstendig karakterisert ved hjelp av konvensjonelle kjemiske analyser, vist seg å være 99% ren, og genererte biologiske resultater i samsvar med ektheten av det sammensatte. Begge stoffene ble suspendert i 0,5% hydroksypropyl-metylcellulose (vekt /volum) og 0,2% Tween 80 (v /v) i sterilt destillert vann (MCT).
Dyr
Dyrestudier ble alle utføres ved anvendelse av hunn atymiske CD1 nakne mus (Charles River, Kent, UK), implantert med HCT116 eller HT29-xenotransplantater (1 x 10
7-celler i 50 ul media injisert subkutant i høyre flanke), holdes og håndteres i isolatorer i henhold patogenfrie forhold.
Farmakokinetiske (PK) og farmakodynamiske (PD) studier
Mus som bærer HCT116 menneskelig tumorxenotransplantater ble behandlet med enten 1 mg /kg PD 0.325.901, 100 mg /kg GDC -0941 eller en kombinasjon av 1 mg /kg PD-0325901 og 100 mg /kg GDC-0941, og ble tappet for blod ved hjertepunktur henhold terminal bedøvelse ved valgte tidspunkter etter behandling (0.25-24 timer, 3 mus /tidspunkt). Blod ble oppsamlet i hepariniserte rør, og plasma ble separert og lagret ved -20 ° C inntil analyse. Svulstene ble fjernet, hurtigfrosset i flytende nitrogen og lagret ved -80 ° C før PK og PD-analyser, som beskrevet nedenfor.
For PK-analyser, ble medikamentet ekstrahert fra 60 ul porsjoner av prøvene ved proteinutfelling med 9 volumer av acetonitril (MeCN). Prøvene ble sentrifugert ved 3000 g i 5 minutter ved 4 ° C, og 500 ul av supernatanten inndampet til tørrhet under nitrogengass ved 30 ° C ved hjelp av en Zymark Fordamper (Sylinder og Life Sciences Ltd, Cheshire, UK). Prøver ble rekonstituert i 100 ul HPLC mobil fase bestående av 40% acetonitril og 60% (v /v) 0,1% maursyre pH 4,0 (v /v), og 50 ul av supernatanten applisert på en 10 cm Xterra Waters 186 000 436 C18 3.5 mikrometer kolonne (Waters, Hertfordshire, UK) utstyrt med en i nettfilter. Forbindelser ble eluert med den ovenfor angitte mobile fase ved 1 mL /min ved anvendelse av en Waters Millennium Kromatografi system (Waters, Hertfordshire, UK). Analytter ble påvist ved UV-absorbans ved 275 og 315 nm, ved retensjonstider på 6,8-7,3 og 3,9-4,3 minutter for PD 0.325.901 og GDC-0941, respektivt. For analyse av medikament i tumorvev, ble tumorer homogenisert i 3 volumer PBS (w /v) og 50 pl aliquoter ble ekstrahert med 9 volumer av MeCN, og sentrifugert, inndampet og analysert som beskrevet ovenfor. Total (fri og proteinbundet) medikamentkonsentrasjonene ble bestemt ved bruk av standardkurver (0,1-10 ug /ml, r
2 0,98 i alle tilfeller) genereres ved å ekstrahere forbindelser fra de passende matriks, ekstraksjonseffektiviteten er 97% for alle matriser. Paret t tester ble brukt til å sammenligne de forskjellige behandlingsgrupper og forskjeller med ap verdi. 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
For PD-analyser, svulster (2 til 4~2.5 mm
3 stk) var disaggregert i 1 ml PhosphoSafe ™ Ekstraksjonsreagens (Merck KGaA, Nottingham, Nottinghamshire, UK) som inneholder en proteasehemmer cocktail (Pierce, Thermo Scientific, Rockford, Illinois, USA) på produsentens anbefalte fortynning ved hjelp av en Medimachine ™ (BD Biosciences, Oxford, UK), ble sentrifugert, og supernatanten ble fjernet og analysert ved Western blotting. Proteiner ble løst på Novex® 4-12% (w /w) Tris-glysingeler (Invitrogen Ltd, Renfrew, Paisley, UK) og elektrooverført på Hybond C nitrocellulosemembran (GE Healthcare og biovitenskap, Hatfield, Hertfordshire, UK). Membraner ble inkubert med fosfo-4EBP1 (Thr37 /46) (# 2855), fosfo-P44 /42 MAPK (Thr202 /Tyr204) (# 4370), fosfo-Akt (Ser473) (# 4060) eller fosfo-S6 ribosomalt protein ( Ser235 /236) (# 4858) monoklonale antistoffer hentet fra Cell Signal Technology (New England Biolabs (UK) Ltd, Hitchin, Hertfordshire, UK). Antistoffbinding ble påvist ved inkubering med et HRP-konjugert geite-anti-kanin-polyklonalt antistoff (Dako, Glastrop, Danmark). Blottene ble utviklet ved hjelp av Pierce ECL (forbedret chemiluminescence) western blotting substrat (Thermo Scientific, Rockford, Illinois, USA), eller SuperSignal® West Dura forlenget varighet substrat (Thermo Scientific, Rockford, Illinois, USA), og Kodak X-ray film ( genetisk forskning Instrumentation Ltd, Braintree, Essex, UK) på en MediPhot 937 film utvikler (Colenta, Weiner Neustadt, Østerrike), deretter skannet.
Fastsettelse av Anti-tumor aktivitet
Mus bærende HCT116 eller HT29 humane tumorxenografter ble tilfeldig delt inn i behandlingsgrupper for å unngå enhver skjevhet og sikre inter-gruppe konsistens, og deretter behandlet ved oral gavage med enten MCT bærer (10 ml /kg), 1 mg /kg PD 0.325.901, 100 mg /kg GDC-0941 eller en kombinasjon av 1 mg /kg PD 0.325.901 og 100 mg /kg GDC-0941 en gang daglig i 14 dager. Tumor volum ble overvåket av kaliper måling ved hjelp av ligningen
en
2 ×
b Twitter /2, der
en
er den minste måling og
b
den største. Data er presentert som middel relative tumorvolumer (RTV), hvor tumorvolumet i hver mus på den initiale behandlingsdag (dag 0) er tildelt en RTV-verdi på 1. Tiden for å RTV3 og RTV4 for hver enkelt tumoren ble beregnet på grunnlag på en standard punkt til punkt kurve med 1000 segmenter ved hjelp av GraphPad Prism programvare (CA, USA). Mann Whitney U tester ble brukt for å sammenligne de ulike gruppene, dvs. kontroll
versus
hver behandlingsgruppe, de enkle midler
versus
hverandre, og hver agent
versus
deres kombinasjon. Forskjeller med ap verdi. 0,05 ble betraktet som statistisk signifikant
[
18F] -FLT PET studier
Før behandling og etter 2 dager med behandling som beskrevet ovenfor, mus med HCT116 menneske tumorxenotransplantater (7-9 mus /gruppe) ble bedøvet, cannulated
via
halevenen og plasseres i liggende stilling på en skreddersydd oppvarmet seng, som holdt tre mus på en gang, i en MOSAIC PET skanner (Philips, Eindhoven, NL). [
18F] -FLT ble hentet fra PETNET (PETNET, Nottingham, UK), og radioaktivitet ble målt ved hjelp av en Capintec godt teller (Capintec, NJ, USA). Omtrent 10 MBq av [
18F] -FLT ble administrert intravenøst og en 1 time dynamisk PET scan ble utført, som består av ti ett minutt, seks 5 minutt og to 10 minutters tidsrammer. Mus ble gjenvunnet etter skanning og fortsatte å motta behandling i resten av studien. Data ble analysert ved hjelp Imalytics programvare (Philips, Aachen, Tyskland); en 3D-region av interesse ble trukket rundt tumoren og den standardiserte opptak (SUV) ble beregnet ved å dividere vevskonsentrasjon (MBq /ml) av den injiserte dosen (MBq) /g kroppsvekt. Bety SUV-verdier ble deretter plottet mot tid, og arealet under kurven (AUC) og den prosentvise endring i arealet under kurven i forhold til grunnlinjen skanningen ble beregnet. Paret t tester ble brukt for å sammenligne dag 2
versus
de baseline SUV AUC-verdier for hver enkelt mus i hver behandlingsgruppe og forskjeller med ap verdi 0,05 ble betraktet som statistisk signifikant
Resultater.
farmakokinetikk og farmakodynamikk av PI3K og MEK-hemmere, som enkle midler og i kombinasjon, i HCT116 menneskelig tumorxenotransplantater
En enkelt dose PK /PD studien ble utført ved hjelp av PI3K inhibitor GDC-0941 og MEK-inhibitor PD-0325901, som enkle midler, og i kombinasjon, i HCT116 human tumor xenograft-bærende mus, i løpet av et tidsforløp på 0.25-24 timer. Konsentrasjonene av legemidler i plasma og tumorvevet ble målt ved anvendelse av HPLC (Figur 1 og Tabell 1). Konsentrasjoner av GDC-0941 og PD 0.325.901 i plasma redusert i løpet av 24 timer etter en enkelt dose av inhibitor (figur 1). En 10-fold økning i GDC-0941 dose, dvs. 100
versus
10 mg /kg, oppnådde plasma AUC-verdier som var 7 ganger høyere. I tilfelle av PD 0325901, en tilsvarende doseøkning, dvs. 10
versus
1 mg /kg, resulterte i en 15 ganger økning i plasma AUC (tabell 1). Konsentrasjoner av GDC-0941 og PD 0.325.901 i svulsten var mer variabel, og nivåene av PD-0325901 var ikke påvises i plasma ved 24 timer (påvisningsgrense: 100 nM) etter behandling med 1 mg /kg og i tumorvev hos alle tidspunkter (deteksjonsgrense: 0,4 nmol /g tumor materiale eller 100 nm i tumorhomogenat fortynnet fire ganger). Tumor GDC-0941 AUC-verdier (tabell 1), viser at det var en 15-ganger økning i AUC etter en 10-dobling av dosen.
Plasma og tumorkonsentrasjoner av PI3K inhibitor GDC-0941 (GDC ) (A) og MEK-inhibitor PD 0325901 (PD) (B) målt ved hjelp av HPLC i prøver fra HCT116 tumor xenograft-bærende mus ved de indikerte tidspunkter etter en enkelt po dose med enten 100 mg /kg GDC-0941 alene, 1 mg /kg PD 0.325.901 alene eller en kombinasjon av 1 mg /kg PD-0325901 og 100 mg /kg GDC-0941. Data er presentert som gjennomsnittskonsentrasjon fra 3 mus i hver gruppe ± standard feil. Den horisontale stiplede linjen viser
in vitro
GI
50 konsentrasjon (tidligere fastsatt i [38]).
Interessant, foreslår plasma AUC data at det kan være en beskjeden økning i konsentrasjonene av PD-0325901 i plasma etter samtidig dosering med GDC-0941 (tabell 1), og selv om denne forskjellen var begrenset (2-3 ganger), var det et konsistent og statistisk signifikant forskjell mellom de AUC av PD 0.325.901 ved dosering alene på en eller 10 mg /kg PD 0.325.901, eller samtidig med 100 mg /kg GDC-0941 (p 0,01). GDC-0941 administrasjon også ut til å ha en effekt på svulsten oppbevaring av PD 0.325.901, hvor det kan måles (dvs. etter 10 mg /kg PD 0.325.901), så det var igjen en statistisk signifikant forskjell mellom svulsten AUC etter dosering med 10 mg /kg PD 0325901 alene eller sammen med 100 mg /kg GDC-0941 (p = 0,01). Imidlertid, i motsetning til plasma data, følgende kombinasjon behandlingstumorkonsentrasjoner av både PD-0325901 og GDC-0941 var lavere enn de som følger enkelt middel behandling, da ble det observert en signifikant forskjell. Således den forbedrede anti-tumor aktivitet observert med kombinasjonen av MEK og PI3K-inhibitorer (se nedenfor) var ikke på grunn av en farmakokinetisk interaksjon resulterer i økt tumormedikamentnivåer. Totalt sett er PK data viser at det var ingen merkede farmakokinetiske interaksjoner (dvs. 3 ganger endring i AUC). Når GDC-0941 og PD 0325901 ble gitt i kombinasjon
Etter en enkeltdose på 100 mg /kg GDC-0941, alene eller i kombinasjon med 1 mg /kg PD 0.325.901, konsentrasjoner av GDC-0941 i plasma og svulstvev konsekvent overskredet som
in vitro
GI
50 verdi av 1081 nM (tidligere bestemt i [38]) over 6 timer (figur 1A). Tilsvarende, etter en enkelt dose på 1 mg /kg PD 0325901, alene eller i kombinasjon med 100 mg /kg GDC-0941, konsentrasjoner av PD-0325901 i plasma gående overskredet som
in vitro
GI
50 verdi på 21 nM [38] i løpet av de første seks timer; men nivåene var ikke påvises i plasma ved 24 timer og i tumorvev ved alle tidspunkter (figur 1B). Likevel, som deteksjonsgrensen for PD 0325901 i både plasma ( 100 nM) og svulstvev ( 0,4 nmol /g) var større enn
in vitro
GI
50 verdi (21 nM), gjør PK data ikke nødvendigvis at farmakologisk aktive narkotika konsentrasjoner ble ikke oppnådd
Selv etter 1 mg /kg PD 0.325.901, konsentrasjonene var under deteksjonsgrensen i svulsten (. 0,4 nmol /g), denne dose var i stand til å redusere (1 time) og helt ablate (3 og 6 timer) fosforylering av ERK1 /2, med meget lite utvinning av 24 timer. Som ventet var det ingen merkbar effekt av PD 0325901 på AKT, S6 eller 4EBP1 fosforylering (figur 2A). GDC-0941 ved 100 mg /kg var tilstrekkelig til å forårsake en reduksjon i fosforylering av AKT, S6 og 4EBP1 over tidsforløp ble undersøkt, selv om reduksjonen var ufullstendig og graden av hemming varieres innenfor gruppene (figur 2B). Interessant er det var også en reduksjon i fosforylering av ERK1 /2 etter en dose på 100 mg /kg GDC-0941. Kombinasjonen av 1 mg /kg PD-0325901 og 100 mg /kg GDC-0941 forårsaket tidligere fullstendig inhibering av ERK1 /2 fosforylering, sammenlignet med behandlingen med monoterapi MEK-inhibitor, og større hemming av S6 og 4EBP1 fosforylering sammenlignet med behandling med den monoterapi PI3K inhibitor (Figur 2C). Imidlertid var det ingen merkbar forskjell mellom hemming av AKT-fosforylering med kombinasjonen sammenlignet med enkelt middel PI3K inhibitor behandling.
Effekter på MAPK og PI3K /AKT signaltransduksjonsveier etter HCT116 tumor xenograft-bærende mus ble behandlet med en enkelt po dose av enten 1 mg /kg av MEK-inhibitor PD 0.325.901 alene (A), 100 mg /kg av PI3K inhibitor GDC-0941 alene (B) eller en kombinasjon av 1 mg /kg av MEK-inhibitor PD 0325901 og 100 mg /kg av PI3K inhibitor GDC-0941 (C). Etter 0.25-24 timer ble tumorene fjernet og lysatene underkastet elektroforese etterfulgt av Western blotting ved å bruke den angitte fosfo-spesifikt antistoff. Blottene ble deretter strippet og re-probet med det tilsvarende totale protein-antistoff for å bekrefte lik protein lasting. A-C representerer prøver fra de tre mus i hver behandlingsgruppe.
Effekt av PI3K og MEK-hemmere, som enkle midler og i kombinasjon, i HCT116 og HT29 menneskelig tumorxenotransplantater
basert på resultatene av PK /PD-studium, virkningen av 100 mg /kg av PI3K inhibitor GDC-0941 og 1 mg /kg av MEK-inhibitor PD 0.325.901 gitt oralt, som enkle midler, og i kombinasjon, ble vurdert i HCT116 og HT29 human tumor xenograft-bærende mus (figur 3). De individuelle doser av PI3K og MEK-hemmere ble valgt til å være like-aktiv, for å speile
in vitro
betingelser som synergi hadde blitt vist tidligere i disse cellelinjer [38]. I denne studien ble mus behandlet daglig i 14 dager og tumorvolum ble målt tre ganger i uken. Figurene 3A og 3B viser at behandling med 100 mg /kg GDC-0941 og 1 mg /kg PD 0325901, alene og i kombinasjon, forårsaket tumorvekstforsinkelse sammenlignet med vehikkelbehandlede kontroll tumorer, og at vekstforsinkelse var større med kombinasjonen. I tillegg ble kroppsvekten overvåket daglig for å vurdere toleranse av behandlingen, og både monoterapi og kombinasjonsbehandlinger ble funnet å være ikke-toksiske, har dvs. kroppsvekt ikke faller under 90% av utgangsvekten (figurene 3C og 3D).
HCT116 (A, C, E) og HT29 (B, D, F) tumorxenografter ble behandlet med enten bærer-kontroll, 1 mg /kg av MEK-inhibitor PD 0325901 og 100 mg /kg av PI3K inhibitor GDC-0941 alene, eller 1 mg /kg av MEK-inhibitor PD 0325901 og 100 mg /kg av PI3K inhibitor GDC-0941 i kombinasjon, po en gang daglig i 14 dager. [A-B] tumorvekstkurver: Data er presentert som median relativt tumorvolum (RTV), hvor veksten er beregnet for hver tumor i forhold til dens størrelse på dag 0. punkter representerer medianen av 10 mus i hver gruppe. Den stiplede linjen viser det punkt hvor tumorene nådde fire ganger det opprinnelige volum (RTV4). [C-D] effekter på kroppsvekt: Data er presentert som en prosentandel av utgangskroppsvekt. Punktene representerer gjennomsnittet av de 10 mus i hver gruppe ± standard feil. [E-F] Tiden det tar for transplantater for å nå fire ganger det opprinnelige volum (tid til RTV4): Data er presentert som den tid det tar ved hver individuelle tumor i hver gruppe til å firedoble i størrelse, og linjer for å representere middelverdien av musene i hver gruppe ± standard feil. P-verdier er gitt der kombinasjonen er vesentlig forskjellig fra begge substansene alene (p≤0.05).
Tiden for svulstene å firedoble i størrelse (tid til RTV4) ble beregnet (Tall 3E og 3F og tabell 2), og statistiske analyser ved hjelp av en Mann-Whitney test avslørte at det var en signifikant forskjell mellom kjøretøy-behandlet kontroll svulster og kombinasjonsgruppen (p 0,01), og mellom monoterapi hemmer og kombinasjonsgruppene (p≤ 0.01), i begge HCT116 og HT29-tumor xenograft-modeller. I tillegg var det en signifikant forskjell mellom kjøretøy-behandlet kontroll svulster og monoterapi hemmere i HCT116 tumorxenotransplantater (p 0,01), men ikke i HT29 tumorxenotransplantater på 5% nivå (p = 0,06)
.
[
18F] -FLT PET-skanning på dag 2 som et surrogat respons biomarkør av PI3K og MEK hemmer effekten som enkle midler og i kombinasjon i HCT116 menneskelig tumorxenotransplantater
Det har vært foreslått at [
18F] -FLT PET kan brukes som et surrogat biomarkør for tumor respons på behandlingen, og dynamiske PET skanner ble derfor utført etter to dager med behandling, og da var det ingen signifikante forskjeller i tumorvolum mellom kontroll eller noen av de behandlede gruppene. Dessverre, [
18F] -FLT opptak av HT29 svulster var lav og denne svulsten kunne ikke brukes for [
18F] -FLT PET studier. I kontrast, HCT116 svulster var [
18F] -FLT ivrig og 4A-C viser at det var ingen forskjell etter 2 dager i [
18F] -FLT tumoropptak etter behandling med kontroll kjøretøy, 1 mg /kg PD 0325901 alene eller 100 mg /kg GDC-0941 alene, sammenlignet med utgangspunktet. Imidlertid, var det en signifikant reduksjon i [
18F] -FLT HCT116 tumoropptak etter 2 dager med PI3K /MEK-inhibitor kombinasjonsbehandling (figur 4D).
[A-D] HCT116 tumor xenograft [
18F] -FLT opptaket over en time dynamiske PET-scan ved start og etter behandling med enten bærerkontroll (A) 100 mg /kg av PI3K inhibitor GDC-0941 alene (B), 1 mg /kg av MEK-inhibitor PD 0.325.901 alene (C) eller en kombinasjon av 1 mg /kg av MEK-inhibitor PD 0325901 og 100 mg /kg av PI3K inhibitor GDC-0941 (D), po en gang daglig i 2 dager. Data er presentert som middel standardiserte opptak (SUV), hvor vevet konsentrasjonen blir beregnet i forhold til injisert dose og kroppsvekt. Punkter representerer gjennomsnittet av 5-7 mus i hver gruppe ± standardavvik. [E] Prosentvis endring HCT116 tumor xenograft [
18F] -FLT opptak på en time før og etter behandling med enten kjøretøykontroll eller en kombinasjon av 1 mg /kg PD 0.325.901 og 100 mg /kg GDC-0941, p.o. en gang daglig i 2 dager. Data er presentert som prosent endring i arealet under kurven (AUC) i forhold til det tilsvarende grunnlinjen AUC, avledet fra figurene A-D, og stolpene representerer gjennomsnittet av 5-7 mus i hver gruppe ± standard feil. * Angir at [
18F] -FLT SUV AUC i kombinasjonen behandlede gruppen var signifikant forskjellig etter 2 dagers behandling sammenlignet med baseline (p 0,01).
Basert på dataene i figurene 4A-D, den prosentvise endringen i området under [
18F] -FLT SUV
versus
tidskurven (AUC) i HCT116 svulster ble beregnet for hver enkelt mus. Figur 4E viser at det var ingen signifikant forskjell (p = 0,95) mellom [
18F] -FLT opptak ved baseline og etter 2 dagers behandling i kontrollutvalget eller monoterapi PD 0325901- eller GDC-0941-behandlede mus. I motsetning til dette var det en statistisk signifikant reduksjon på 18% i tumor [
18F] -FLT opptaket etter 2 dager i PI3K /MEK-inhibitor kombinasjoner behandlede mus (p 0,005). Disse data viser at forandringer i [
18F] -FLT opptak forut virkninger på tumorvolum, og at [
18F] -FLT PET er en gyldig tidlig surrogat respons biomarkør for deteksjon av forbedret effekt av kombinert PI3K og MEK-inhibitor behandling.
Diskusjoner
Med noen hederlige unntak, for eksempel imatinib i behandling av kronisk myelogen leukemi og vemurafenib
BRAF
-mutant melanom, monoterapi klinisk aktivitet med målrettet terapi er beskjeden, antagelig på grunn av tilstedeværelsen av flere driver genetiske skader og den raske utviklingen av resistensmekanismer. Kombinasjoner av målrettet terapi derfor blir mye undersøkt. Imidlertid, i å utvikle optimale kombinasjoner, har konvensjonell klinisk studie metoden betydelige begrensninger som stort antall medikamenter, pasientantall som kreves, og den tid det tar for respons og overlevelse, endepunktet til nås utelukker rettidig evaluering av alle mulige kombinasjoner.
