Abstract
microvessel tetthet (MVD) som en angiogenese prediktor er ineffektiv per se i kreft prognose. Vi evaluerte prognostiske verdier ved å kombinere intratumoral alfa-glattmuskel aktin (α-SMA) -positivt stromal celletetthet og MVD etter kurativ reseksjon i hypervascular hepatocellulært karsinom (HCC) og hypovascular pankreaskreft (PC). Microarray ble konstruert av svulster i 305 HCC og 57 PC-pasienter som gjennomgikk kurativ reseksjon og analysert for α-SMA og CD34 uttrykk av immunfarging. Prognostiske verdier av disse to proteiner og andre clinicopathological egenskaper ble undersøkt. Både lav α-SMA tetthet og høy MVD-CD34 ble forbundet i HCC med tilstedeværelse av intrahepatisk metastaser og mikrovaskulær invasjon, og de var i slekt med spredning til lymfeknuter og mikrovaskulær invasjon i PC (
p
0,05) . Selv om CD34 alene, men ikke α-SMA, var en uavhengig prognostisk faktor for total overlevelse og residiv overlevelse, kombinasjonen av lav α-SMA og høy CD34 var en prediktor for verste prognosen for begge typer svulster og hadde en bedre effekt å forutsi pasientens død og tidlig tilbakefall (
p
0,01). Videre viser resultatene at fordelingen av de fleste av de α-SMA-positive celler og vaskulære endotelceller overlapper hverandre, som viser større colocalization på vaskulære vegger. Dårlig microvessel integritet, som antydet ved høy MVD, sammen med lav perivaskulær α-SMA-positiv celle dekning er assosiert med tidlig tilbakefall ugunstig metastase, og kort overlevelse etter tumor-reseksjon. Dette funnet understreker betydningen av vaskulær kvalitet i tumorprogresjon, noe som gir en optimalisert supplement til vaskulær kvantitet i prognose av postoperative pasienter
Citation. Wang WQ, Liu L, Xu HX, Luo GP, Chen T, Wu CT, et al. (2013) intratumorale α-SMA Forbedrer Prognostic Styrken av CD34 Associated med Vedlikehold av microvessel Integritet i leverkreft og kreft i bukspyttkjertelen. PLoS ONE åtte (8): e71189. doi: 10,1371 /journal.pone.0071189
Redaktør: Johannes Haybaeck, Medical University Graz, Østerrike
mottatt: 26 januar 2013; Godkjent: 27 juni 2013; Publisert: 05.08.2013
Copyright: © 2013 Wang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Støttet av Foundation National Natural Science of China (81172005 og 81172276), Natural Science Foundation National Shanghai (11ZR1407000), Ph.D. Foundation programmer av Ministry of Education of China (20110071120096), og Chinesisch-Deutsches Forschungsprojekt (GZ 857). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
dysregulering av angiogenese er uunnværlig for tumormetastase, og det er et av kjennetegnene på kreft [1]. Neovascularization leverer ikke bare oksygen og næringsstoffer til proliferativ kreftceller, men fungerer også som kanal for migrasjon [2]. Microvessel tetthet (MVD) er den mest anerkjente indikator for å vurdere angiogenese av solide tumorer. Farging av en vaskulær endotelial celle (EF) markør, slik som CD34, blir brukt til å merke MVD [3] – [6]. Det har blitt rapportert at MVD er en negativ prediktor i flere krefttyper [7], [8], inkludert hepatocellulært karsinom (HCC) [3], [4] og pankreaskreft (PC) [9]. Imidlertid har paradoksale resultater også blitt bemerket [10], [11].
svulstens mikromiljø spiller en avgjørende rolle i tumordannelse og progresjon. Bortsett fra vaskulær EC, karsinom-assosiert fibroblast (CAF) er den største cellekomponenten i dette miljøet [12], [13]. Det er fortsatt kontroversielt hvorvidt stromale celler som er immunopositive for alpha-glatt muskel aktin (α-SMA) representerer aktivert CAF i intra /peritumoral vev [14], [15]. Selv om vi tidligere rapportert at peritumoral α-SMA-positive celler korrelerer med dårlig utfall av pasienter med HCC [16], den prognostiske styrken av intratumoral α-SMA er et åpent spørsmål. Vi har nylig observert colocalization av α-SMA- og CD34-positiv farging i både intra- og peritumoral vev, og vi tror betydningen av funn er verdt å lete.
Nylig, noen kliniske studier har avdekket at suksessen av antiangiogene monoterapi er generelt lite imponerende, med lave objektiv responsrate og ikke-menings overlevelse fordeler [17] – [19]. Andre prekliniske studier har vist at antiangiogenesis hemmer tumorvekst men akselererer metastase [20], [21]. Disse funnene ble trolig sammenheng med et fokus på fartøy kvantum alene, mens forsømme kvaliteten på blodkar, nemlig microvessel integritet (MVI). Med andre ord, kan antiangiogenesis redusere MVD men svekker MVI, og dermed fører til metastase [22]. Egentlig er det tumor vaskulære veggen består av et kontinuum av celletyper, som strekker seg fra EC, vaskulære glatte muskelceller, og pericytes [23], hvorav de to sistnevnte er klassifisert som perivaskulære celler (PVC) [19]. Gitt at MVD er en markør bare for EC, kan det ikke representere integralet vaskulatur. Enda viktigere, har vi funnet en colocalization mønster for α-SMA og CD34, samt ytterligere EU-markører som er beskrevet av andre grupper [19], [24] – [26]. På denne bakgrunn hypotese vi at den felles funksjon av perivaskulære α-SMA-positive celler og ECS i den vaskulære veggen, er å stabilisere tumorkarene og blokkere tumorcellemigrering via intra /ekstravasasjon. Derfor kan en kombinasjon av α-SMA og CD34 som prediktive markører (CD34
+ /α-SMA
+) være nyttig for evaluering av MVI. Mye av akkumulere bevis om MVI i kreft kommer fra prekliniske studier. Dens betydning i klinikken, er imidlertid ukjent.
To vanlige og dødelige kreftformer, som kontrast i form av intra /peritumoral blodkar, er HCC og PC. Vev av HCC er sterkt vaskularisert med lavere stromal innhold [3], mens de av PC er dårlig vaskualisert men med rikelig stroma [13]. I denne studien gjennomførte vi vaskulær integritet analyse av disse to krefttyper, har sterk representasjon. Vi har undersøkt den prognostiske verdi av α-SMA separat og combinatorially med MVD etter kurativ reseksjon av primærtumor, først i HCC og deretter i PC. Resultater i PC bekrefte de som finnes i HCC.
Materialer og metoder
Pasienter, Prøver, oppfølging og Postoperativ behandling
Totalt 305 pasienter (gruppe 1, Tabell S1 i Fil S1) som gjennomgikk kurativ leverreseksjon for patologi utprøvd HCC på Liver Cancer Institute of Zhongshan Hospital, Fudan University, ble undersøkt. Ingen av dem fikk noen preoperativ kreft behandling. Disse pasientene ble observert mellom oktober 2004 og november 2010, med en total oppfølgingstid på 72 måneder. Kriteriene for resectability, innsamling av prøver, bestemmelse av tumorstadium og differensiering, og oppfølgingsrutiner er beskrevet andre steder [27] – [29]. Total overlevelse (OS) og tilbakefall overlevelse (RFS) ble definert som intervallet mellom datoene for kirurgi og død, og mellom datoene for kirurgi og tilbakefall, henholdsvis. Ved tilbakefall ble mistenkt, ble datastyrte tomografi skanning eller magnetisk resonanstomografi utføres umiddelbart; hvis gjentakelse ikke hadde fått diagnosen, ble pasientene observert inntil døden eller siste oppfølging. På det siste oppfølging av studien, 132 pasienter hadde tumorresidiv, og 108 ble funnet å ha dødd. 1-, 3- og 5-års OS priser var 88%, 65% og 64%, henholdsvis; de tilbakefall enn de samme tidsintervall var 25%, 42% og 43%, henholdsvis.
Fra januar 2010 til juni 2011, 179 påfølgende pasienter med patologi utprøvd PC gikk kurativ reseksjon ved vårt institutt, med kirurgi utført av det samme teamet [30]. De resektable kriteriene oppfylt National Comprehensive Cancer Network (NCCN) klinisk praksis retningslinjer i Oncology-kreft i bukspyttkjertelen Guideline 2010 (https://www.nccn.org). Av de PC-pasienter, 57 tilfeller (gruppe 2, Tabell S2 i File S1) tilfeldig hentet fra et prospektivt samlet database ble identifisert som å ha ingen mikroskopisk observerbar resttumor (R0). Ingen av dem fikk noen preoperativ kreft behandling. Hele tumorer ble oppsamlet. Svulster ble iscenesatt i henhold til svulsten-node-metastaser (TNM) klassifiseringssystem [31]. Tumor differensiering ble gradert av NCCN Guideline. Spredning til lymfeknuter ble bestemt ut fra postoperativ patologisk diagnose. Alle pasientene ble fulgt frem til juli 2012, med en median oppfølgingstid på 15,5 måneder. Behandlingsmetoder etter tilbakefall ble administrert også i henhold til NCCN Guideline. Satsene for OS og RFS ble definert som ovenfor. Ved siste oppfølging, 33 pasienter hadde svulst tilbakefall, og 22 døde. De 0,5-, 1- og 2-års OS priser var 98%, 86% og 61%, henholdsvis; og 0,5-, 1- og 2-års tilbakefall i løpet av de samme tidsintervall var 21%, 42% og 58%, henholdsvis. En annen uavhengig test kohort 3, inkludert 52 PC-pasienter behandlet ved vårt institutt, ble også samlet inn for studien (tabell S3 i File S1).
Denne studien ble godkjent av forskningsetiske komiteer av Zhongshan Hospital og Fudan Universitetet Shanghai Cancer Center. Den skriftlige samtykke ble innhentet fra hver pasient før du deltar i denne studien i henhold til de to utvalgenes bestemmelser.
Tissue microarray Construction, Immunohistochemistry, og evaluering
Tissue microarray (TMA) konstruksjon var som beskrevet [28]. Kort fortalt, to kjerner for kohort en og tre kjerner for kohorter 2 og 3, som er boret fra hver representant formalinfiksert, parafininnebygd svulstvev, ble brukt til å lage TMA lysbilder (Shanghai biochip Company Ltd, Shanghai, Kina). To eller tre sylindre fra forskjellige områder av tumorprøver ble oppnådd; følgelig ble totalt fire TMA sjetonger for kohort en og to brikker for kohorter 2 og 3 forberedt.
Den markør som brukes for PVC var α-SMA [13], [19] og CD34 ble brukt som markør for EC [3], [4]. Hypoksi-induserbare faktor 1α (HIF-1α) og karbonisk anhydrase IX (CA IX) ble valgt som tumor hypoksi biomarkør [24], [32], [33]. Immunhistokjemisk (IHC) analyse av disse markørene i TMA seksjoner (4-um tykke) ble utført ved en to-trinns fremgangsmåte som beskrevet [29]. Den primære kanin monoklonale anti-human α-SMA-antistoff (1:100; Abcam, Cambridge, MA), muse-monoklonalt anti-humant CD34 (1:100; Abcam), kanin-monoklonalt anti-humant CA IX (1:150; Abcam ), og muse-monoklonalt anti-humant HIF-1α (1:100; Sigma, St. Louis, MO) ble anvendt. Inkubering med primære antistoffer ble utført over natten ved 4 ° C i et fuktig kammer. Envision-plus deteksjonssystem med et anti-kanin /mus polymer (EnVision + /HRP /Mo, Dako, Glostrup, Danmark) ble anvendt. Reaksjonsproduktene ble visualisert ved hjelp av inkubering med 3,3′-diaminobenzidin. Negative kontroller ble behandlet identisk, men med utelatelse av primært antistoff.
tetthet av positiv farging i hele vis ble målt ved bruk av et datastyrt system bilde sammensatt av et Leica CCD kamera, DFC500, forbundet med en Leica DM IRE2 mikroskop (Leica, Cambridge, UK). Bilder av fem representative feltene ved × 200 forstørrelse ble tatt til fange av Leica QWin Plus v3 programvare. En identisk innstilling ble brukt for alle bildene. For evaluering av vaskulær tetthet, vaskulær integritet, og hypoksi intensitet, areal og integrert optisk tetthet (IOD) av farging i hvert bilde ble målt ved hjelp av Image-Pro Plus v6.2 programvare [28]. Resultatene ble kvantifisert som α-SMA- eller CD34-positive område /areal, og HIF-1α eller CA IX IOD /areal.
immunhistokjemisk farging av seriesnitt
Femten parene (total tretti) av tumor og passet peritumoral prøver (vev tilstøtende til svulsten innenfor en avstand på 10 mm) fra pasienter med HCC og PC ble oppsamlet og brukt for å fremstille serielle parafininnstøpte og frosset vev lysbilder. Parafin delen glass ble anvendt for IHC av α-SMA og CD34. Åtte tverrsnitt fra hver prøve ble utsatt for kvalitativ analyse. IHC-fremgangsmåten ble beskrevet tidligere [29]. Under × 200 forstørrelse, ble bilder av representative felt på samme sted over sammenkoblede seriesnitt med positiv α-SMA og CD34 flekker tatt med en datastyrt bildesystem.
Immunofluorescent Double Farging for α-SMA og CD34
Frosne snitt ble anvendt for immunofluorescerende farging av dobbel α-SMA og CD34. Protokollen var som beskrevet [29]. Etter reaksjon med de primære antistoffer (1:80), og etterfølgende rensing ble snittene inkubert med både Cy3-konjugert geite-anti-kanin og fluoresceinisotiocyanat-konjugert geit-anti-mus-antistoffer (både 1:100; Jackson, West Grove, PA) og kontra med 4 «, 6-diamidine-2»-phenylindole dihydrochloride (DAPI) for å flekke kjerner. Representative bilder ble kjøpt opp av laser konfokalmikroskopi.
Statistical Analysis
Alle statistiske analyser ble utført med SPSS 16.0 programvare. Pearson chi-square eller Fishers eksakte test ble brukt for å sammenligne kvalitative variabler, og kvantitative variabler ble analysert ved
t-
test eller Spearman test. Cutoff point of α-SMA eller CD34 tetthet for definisjon av undergruppene var medianverdien (fig. S1 i File S1). De clinicopathological funksjoner ble sammenlignet mellom de to risikogrupper ved hjelp av en Mann-Whitney test. For overlevelsesanalyse, ble Kaplan-Meier-kurver trukket, og forskjellene mellom kurvene ble beregnet ved Log-rank test. Uavhengig prognostisk betydning av risikofaktorer er identifisert av univariat analyse ble beregnet av Cox modell. Mottaker som opererer karakteristikk (ROC) kurve analyse ble anvendt for å bestemme den logiske verdi mellom parameterne. En verdi på
P
. 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Resultater
Mønstre av perivaskulær α-SMA-positive stromale celler og egenkapitalbevis Distribution
i alle tumorer som er samlet, HCC viste alltid et meget lavt innhold stromal, mens PC inneholdt tallrike stroma (fig. 1). Representative høy og lav α-SMA /CD34-farging det kan sees i denne figur. Gjennomsnittlig α-SMA-positive celletetthet for HCC var 0,0540 ± 0,0611 (median på 0,0389, rekkevidde, 0,000320 til 0,563), og det var 0,232 ± 0,111 for PC (median, 0,202, rekkevidde, 0,0494 til 0,474). (Fig S1A og 1C i File S1). Spesifikk farging av kapillær-lignende fartøy av anti-CD34 ble observert i HCC (gjennomsnittlig MVD-CD34 på 0,116 ± 0,106, median, 0,0877, rekkevidde, 0,00102 til 0,545) og PC (gjennomsnittlig MVD, 0,0217 ± 0,0212, median, 0,0112; range , 0,00103 til 0,0928) (fig. S1B og 1D i File S1). Et rikt innhold av mikrokar ble funnet i HCC, mens innholdet av mikrokar i PC var dårlig (fig. 1). Sammenlignet med den homogene fartøyet mønster i peritumoral normal lever eller bukspyttkjertel vevet, intratumoral vaskulær morfologi var heterogen (figur 1;. Fig. S2 i File S1). Immunhistokjemi av seriesnitt viste en colocalization av α-SMA og CD34-farging fordelinger (fig. 2A og 2B, 2C og 2D), og et lignende utseende ble også funnet i peritumoral vev (Fig. S3 i File S1). Dette fenomenet ble bekreftet av immunfluorescens dobbel farging av α-SMA og CD34, hvor α-SMA-positive celler ble sett til å vikle rundt EC på vaskulære vegger (Fig. S4 i File S1).
Case 85 (HCC ) og PC-kabinettet 36 viste høy α-SMA tetthet (A, G) og MVD-CD34-verdier (D, J); mens, HCC sak 226 og PC-kabinettet 19 viste lav α-SMA tetthet (B, H) og MVD (E, K) (× 200). (C, F, I, L) Gjennomsnittlig α-SMA tetthet og MVD av høye eller lave risikogrupper i HCC og PC.
* Uavhengige prøver
t
testen viste en statistisk forskjell mellom de to gruppene.
(paret A og B, C og D) Immunhistokjemisk farging av seriesnitt viste en koekspresjon mønster av α-SMA og CD34 (× 200).
Korrelasjoner mellom Tumor α-SMA-positive celletetthet eller MVD og Clinicopathological funksjoner
Når medianverdien ble satt som cutoff point for α-SMA og CD34 tettheter, ble pasientene delt inn i undergrupper av høy eller lav risiko (figur 1;. fig. S1 i File S1). Som vist i tabell 1 (vist i detalj i tabellene S4 og S5 i File S1), i HCC, pasienter med en lav α-SMA tetthet var tilbøyelige til å ha nærvær av intrahepatisk metastase og invasjon mikrovaskulær, og lav tumor differensiering; høy MVD var forbundet med stor svulst størrelse, høy serum α-fetoprotein konsentrasjon, tilstedeværelse av intrahepatisk metastaser og mikrovaskulær invasjon, og høy TNM stadium. I PC, ble lav α-SMA relatert til høy lymfeknuteaffeksjon, mikrovaskulær invasjon, lav tumor differensiering, og høy TNM stadium; høy MVD korrelert med store tumorstørrelse, høy lymfe nodal involvering hastighet, og nærværet av mikrovaskulær invasjon. I HCC pasienter med cirrhose (stadium 4;
n
= 72), var det betydelig lavere α-SMA verdier enn hos pasienter uten cirrhose (trinn 1 til 3,
n
= 233; 18,30 % vs 28,95%;
p
= 0,029); MVD ble likt fordelt mellom de to undergrupper (22.88% vs 24,34%;
p
= 0,763)
Prognostic Impact of Tumor α-SMA-positive celletetthet eller MVD på. Postoperativ Survival og Tilbakefall
i univariat analyse av HCC, tumor størrelse, tumor differensiering, tilstedeværelse av mikrovaskulær invasjon og intrahepatisk metastasering, og TNM stadium var assosiert med både OS og RFS; positiv hepatitt B e antigen ble også assosiert med RFS. I PC, ble nærvær av mikrovaskulær invasjon assosiert med både OS og RFS; svulst differensiering ble også assosiert med OS; og lymfeknuteaffeksjon var en potensiell impact factor av RFS (tabell 2). De α-SMA verdier av både HCC og PC var ikke forbundet med OS eller RFS (for HCC:
p
= 0,071 og
p
= 0,079, figur 3A og 3B, for PC.:
p
= 0,072 og
p
= 0,107, fig. 3I og 3J). Median OS og RFS ganger for pasienter med høyt MVD var 26,5 og 16,0 måneder for HCC, og 15,0 og 9,7 måneder for PC, henholdsvis. Disse periodene var betydelig kortere enn hos pasienter med lav MVD (for HCC: 57,4 og 33,1 måneder, både
p
0,001, figur 3C og 3D, for PC. 20,0 og 17,8 måneder,
p
= 0,046 og
p
= 0,008, fig. 3K og 3L).
(A, B, I, J) Den α-SMA tetthet var assosiert med verken OS eller RFS. (C, D, K, L) Low MVD ble korrelert med langvarig OS og RFS. (E, F, M, N) Pasienter i hver årsklasse ble klassifisert i fire grupper etter deres intratumoral α-SMA tetthet og MVD. (G, H, O, P) De prediktive verdier av markør kombinasjon og andre risikofaktorer er identifisert av multivariat analyse ble studert av mottaker operere karakteristisk analyse (se resultater for detaljer). UICC, International Union mot kreft
Risikofaktorer identifisert av univariat analyse ble slått sammen til en multivariat Cox analyse. (Tabell 2, også beskrevet i tabell S6 og S7 i File S1). Resultatene viser at i begge tumortyper, er ikke α-SMA en uavhengig risikofaktor for OS eller RFS. Høy MVD var en selvstendig risikofaktor for OS (for HCC: hazard ratio [HR] = 4,236,
p
0,001; for PC: HR = 3,578,
p
= 0,018) og av RFS (for HCC: HR = 2,585,
p
0,001; for PC: HR = 2,230,
p
= 0,034)
Tar hensyn til tilbakefall. karakteristikker av HCC [34], vedtok vi 24 måneder som grenseverdi for å skille tidlig versus sen undergrupper av tumor tilbakefall. Dessverre ble ingen forskjell mellom pasienter med høy og lav α-SMA enten tidlig tilbakefall (66 av 153 vs. 89 av 152 pasienter,
p
= 0,528, Fig. S5a i File S1) eller sent tilbakefall (87 av 153 vs. 63 av 152 pasienter,
p
= 0,665). Flere pasienter med høyt MVD (sammenlignet med pasienter med lav MVD) hadde en tidlig gjentakelse (110 til 153 sammenlignet med 45 av 152 pasienter,
p
= 0.001 Fig. S5b i File S1) i stedet for en sen gjentakelse (43 av 153 vs 107 av 152 pasienter,
p
= 0,429). For PC, ble 6 og 12 måneder satt som cutoff-verdier for å skille tidlig versus sen tilbakefall [35], henholdsvis; under disse forholdene, ble ingen signifikant forskjell funnet for α-SMA og MVD mellom undergrupper.
For å eliminere påvirkning av tumorstørrelse på pasientens resultater vi videre undersøkt prognostiske faktorer i liten svulst HCC undergruppe (maks diameter på ≤5 cm,
n
= 179); i PC, gjorde tumorstørrelse ikke korrelerer med OS eller RFS. MVD verdier ble assosiert med OS og RFS (
p
0,001 og
p
= 0,001, henholdsvis) i denne undergruppen; mens, ble α-SMA relatert til verken OS eller RFS (
p
= 0,520 og
p
= 0,153, henholdsvis Fig. S6a til 6D i File S1). Detaljerte korrelasjoner av andre faktorer med pasientenes prognose for den lille-tumor HCC undergruppe er oppsummert i tabell S8 i File S1.
prognostisk verdi av Kombinasjon av α-SMA-positive celletetthet og MVD og ROC analyse
Studie pasientene ble delt inn i fire grupper etter deres intratumorale verdiene α-SMA tetthet og MVD: gruppe i (HCC /PC:
n
= 68/14), lav α-SMA og lav MVD; gruppe II (HCC /PC:
n
= 84/15), høy α-SMA og lav MVD; gruppe III (HCC /PC:
n
= 86/13), lav α-SMA og høy MVD; og gruppe IV (HCC /PC:
n
= 67/15), høy α-SMA og høy MVD (se tabell S9 i File S1, de detaljerte clinicopathological funksjonene til pasienter i ulike undergrupper av α-SMA og MVD). Prognostisk analyse viste signifikante forskjeller i OS priser (
p
0,001 og
p
= 0,026 for HCC og PC, henholdsvis) og RFS priser (
p
0,001 for begge) av de fire kombinatoriske gruppene (tabell 2). I HCC Cohort 1, 5-års OS og RFS priser var 88,1% og 70,2%, henholdsvis for gruppe II; men bare 38,4% og 44,2%, henholdsvis for gruppe III (Fig. 3E og 3F). I PC Cohort 2, 2-års OS og RFS priser var 100% og 86,7%, henholdsvis for gruppe II; men de var bare 40,0% og 15,4%, henholdsvis for gruppe III (Fig. 3M og 3N). Resultatene av multivariat analyse viste at kombinasjonen av α-SMA tetthet og MVD var en uavhengig prognostisk faktor for OS og RFS (tabell 2 og tabell S6 og S7 i File S1). Et lignende resultat ble funnet i tidlig tilbakefall HCC (Fig. S5C i File S1) og små-svulst HCC undergrupper (Fig. S6E og 6F, og tabell S8 i File S1), og det ble bekreftet i den uavhengige test PC Cohort 3 ( . fig. 4)
Risikofaktorer faktorer~~POS=HEADCOMP identifisert av multivariat analyse og kombinasjonen av α-SMA og MVD ble vedtatt, og deres prediktive verdier ble bestemt ved ROC-analyse (Tabell 3, beskrevet i tabell S10 og S11 i File S1). Tumor MVD spådd død og tilbakefall (
p
0,05). Selv om α-SMA forutsagt verken død eller tilbakefall, kombinasjonen av α-SMA og MVD nøyaktig forutsagt død og tidlig tilbakefall (
p
0,01 for alle). Bortsett TNM stadium og tilbakefall i HCC, og for tumor differensiering og død i PC, prediktiv verdi av kombinasjon av α-SMA og MVD var større enn andre faktorer. Når verdien cutoff ble angitt som gruppe III (med lav α-SMA og høy MVD) versus andre treere grupper, negativ prediktiv verdi, positiv prediktiv verdi, følsomhet og spesifisitet av HCC kohort 1 var 0,749, 0,616, 0,491, 0,832 for OS og 0,616, 0,558, 0,364, 0,780 for RFS, og av PC kohort to var henholdsvis 0,690, 0,600, 0,409, 0,829 for OS og 0,476, 0,733, 0,333, 0,833 for RFS,. Arealene under kurven av denne kombinasjonen var 0,743 /0,758 (HCC /PC) for død (
p
0,001 og
p
= 0,001, henholdsvis) og 0,615 /0,790 (HCC /PC) for tilbakefall (
p
= 0,001 og
p
. . 0,001, henholdsvis) (fig 3G, 3H, 3o, og 3P)
intensitet av HIF-1α og CA IX Expression i undergrupper av Different MVI
Verdier av HIF-1α og CA IX ble brukt som indikator på svulsten hypoksi, og deres intensiteter ble delt inn i fire grupper etter kombinasjonen av a-SMA og MVD. Den gjennomsnittlige HIF-1α eller CA IX tettheten er størst for combi gruppe I og minste for gruppe IV i HCC Cohort en og PC Cohort 2 (enveis variansanalyse,
p
0,001 og
p
= 0,008 for HIF-1α, og
p
= 0,012 og
p
0,001 for CA IX, henholdsvis fig. 5). Sammenlignet med gruppe I, den HIF-1α eller CA IX av gruppe II var betydelig lavere; sammenlignet med gruppe III, HIF-1α eller CA IX i gruppe IV var også lavere (begge
p
0,05).
indikator på svulsten hypoksi var HIF-1α og CA IX, og deres intensiteter ble delt inn i fire grupper, som beskrevet. Den HIF-1α eller CA IX tetthet var størst i gruppe I og lavest i gruppe IV for begge (A) leverkreft (HCC) kohort 1, og (B) kreft i bukspyttkjertelen (PC) kohort 2; (
p
0,001 og
p
= 0,008 for HIF-1α, og
p
= 0,012 og
p
0,001 for CA IX , henholdsvis).
* Sammenlignet med gruppe I., og
** sammenlignet med gruppe III; både
p
0,05. IOD, integrert optisk tetthet.
Diskusjoner
I denne studien har vi funnet at en lav intratumoral α-SMA-positive celletetthet, sammen med høye MVD-CD34 verdier, er signifikant assosiert med en høy forekomst av intravaskulær tumor blodpropp og dårlig overlevelse etter reseksjon av HCC. Av disse to markører, er bare MVD en uavhengig prognostisk faktor; Men kombinasjonen av de to har større kraft for å forutse pasientens død og tidlig tilbakefall. Videre vårt arbeid viser at lokaliseringen av de perivaskulære α-SMA-positive celler og ECS lapper på vaskulære vegger, og det er større enn 80% colocalization i tumoren interstitium. Dette funnet ble også observert i PC og en uavhengig test PC kohort. Derfor foreslår vi at en kombinasjon av α-SMA og MVD kan til dels være en god indikator på MVI (CD34
+ /α-SMA
+); at MVI er mer kritisk enn MVD alene utvikling av mikrovaskulær invasjon; og at MVI er avgjørende for videre forståelse mulig underliggende mekanismene for antiangiogenesis som en akselerator for tumormetastaser.
En anerkjent menneskelig EC markør er CD34. Det har vært rapporter i en musemodell som a-SMA og CD31 i en av EFs markør kan coexpress i vaskulære vegger [24], [26]; Dette er imidlertid uklart i menneske. Vårt arbeid bekrefter dette α-SMA og CD34 koekspresjon mønster (se prinsippskisse i Fig. S7 i File S1). De perivaskulære α-SMA-positive celler som festes rundt ECS ble identifisert som PVC og PVC tetthet ble anvendt som en indikator på MVI. Før denne studien, en stor utfordring var å velge en passende molekylær markør av PVC. Uttrykk av ulike markører har blitt rapportert i PVCs; det vil si, NG2, blodplate-avledet vekstfaktor-reseptor-beta (PDGFRp), α-SMA, desmin, og RGS5 [23], og deres ekspresjon kan være vevsspesifikke. Til tross for noen PVC markører for HCC og PC har blitt identifisert i dyreforsøk [25], [26], [36], [37], har studiet av deres uttrykk i menneskelige biopsier i stor grad vært uutforsket. Våre resultater tyder på at α-SMA er en egnet markør for MVI, på grunn av sin positive flekker hastighet og colocalized uttrykk med CD34. Derfor våre funn fastslå at det er en markør av VES. Dette er konsistent med feig et al. [13] som mente at a-SMA-positive stromal fibroblaster kan trolig representere PVCs. For selv om NG2 kan være farget positivt i mus prøver [38], gransking av det og andre Predictor molekyler ble sviktet i menneskelig vev som er samlet i vårt institutt (se Fig. S8 i File S1).
Våre resultater viser også at i pasienter med høyt tumor MVD, så lenge deres MVI er også høy, metastatisk sannsynlighet kan være lav, og i dette tilfellet ville den prognose være i orden. I motsetning til dette, kan det være dårlig prognose for pasienter med lav MVD og også lav MVI. Dårlig integritet av skip gir mange muligheter for tumorcelle intra /bloduttredelse fra lekk vaskulær arkitektur, og disse cellene kan transplantere inn i målorganer, noe som resulterer i metastasering. Hva gjør vondt verre, er at i områder med vaskulær kollaps, som følge av dårlig PVC-dekning, kan dramatisk redusert svulst blod perfusjon føre og produsere regional hypoksi [19]. De resulterende hypoksi-utrustet tumorceller ville ha trekkende og invasive egenskapene gjennom HIF-1α-indusert epitelial-mesenchymale overgang [22], [32], [39]. Denne situasjonen ville skape et fiendtlig svulst miljø hvor disse cellene kan lett invadere gjennom unormale årer og danner svulst tromber. Denne hypotesen støttes av en utmerket studie som viser at utarming av pericytes forårsaker svulst hypoksi og metastase [22], og etter vår tidligere studie viser at forbedring av MVI lindrer hypoksi og hemmer metastase [38]. Disse funnene er alle i tråd med våre kliniske observasjoner. Dette arbeidet undersøker også hypoksi biomarkører HIF-1α og CA IX intensiteter ifølge kombinatoriske markør grupper av forskjellig MVI, og vi har funnet sin faktisk presenterer en gradient fordeling. I begge lave MVD gruppene I og II, og i både høye MVD gruppene III og IV er, desto høyere MVI korrelerer med lavere HIF-1α og CA IX. Hvordan MVI er regulert er uklart. Mazzone et al. rapporterte at hypoksi og den HIF-1α /-2α-assosiert protein PHD2 kan skade MVI [24], og det har vist seg at genet målretting av
Phd2
resulterer i forbedret MVI og forbedret tumor respons på kjemoterapi [40 ]. Sistnevnte observasjon tyder på at MVI kan reguleres ved hypoksi /HIF-1α via en tilbakemelding sti. Men vi har ikke et selvstendig prognostisk verdi for PVCs preget av α-SMA, som er forskjellig fra resultatene av Cooke og kolleger [22]. Mulige årsaker til avviket kan være heterogeniteten av forskjellige tumorer, eller den potensielle mangel på spesifisitet av α-SMA. Våre resultater antyder at hensynet til VES alene er ikke nok; det sentrale punkt, heller, ligger i foreningen av PVC med egenkapitalbevis.
Siste nye data, både fra vår gruppe og andre, har avdekket at vaskulær endotelial vekstfaktor eller vaskulær endotelial vekstfaktor reseptor (VEGFR) blokade av sorafenib eller sunitinib fører til forbedret metastase [20], [21], [41]. Det er noen innsikt i mekanismen av dette fenomenet, men det er fortsatt ikke fullt ut forstått. Vi spekulerer i at det er sannsynligvis fordi antiangiogenesis mål både EU og PVC, som sunitinib kan blokkere VEGFR2 og PDGFRs [42]. Tabell S1. Tabell S4. Figur S2. Figur S3. Figur S4. Figur S5. Figur S7.
