Abstract
BTN3A2 /BT3.2 butyrophilin mRNA uttrykk av tumorceller ble tidligere identifisert som en prognostisk faktor i en liten kohort av høy klasse serøs ovarialcancer (HG-EOC). Her vurderte vi den prognostiske verdien av BT3.2 på proteinnivået i prøven fra 199 HG-EOC pasienter. Som den eneste kjente rolle butyrophilin proteiner er i immunregulering, vurderte vi sammenhengen mellom BT3.2 uttrykk og intratumoral infiltrasjon av immunceller ved immunhistokjemi med spesifikke antistoffer mot BT3.2, CD3, CD4, CD8, CD20, CD68 og CD206. Epitel BT3.2 uttrykk var signifikant assosiert med lengre total overlevelse og lavere risiko for sykdomsprogresjon (HR = 0,651, p = 0,006 og HR = 0,642, p = 0,002, henholdsvis) og signifikant assosiert med en høyere tetthet av infiltrerende T-celler, spesielt CD4 + -celler (0,272, p 0,001). Vi har også observert en sterk sammenheng mellom den relative tettheten av CD206 + -celler, som evaluert ved forholdet mellom intratumoral CD206 + /CD68 + uttrykk, og risikoen for sykdomsprogresjon (HR = 1,355 p = 0,044, respektivt). I konklusjonen, er BT3.2 protein en potensiell prognostisk biomarkør for identifisering av HG-EOC pasienter med bedre resultat. I motsetning til dette er høy CD206 + /CD68 + uttrykk forbundet med høy risiko for sykdomsprogresjon. Mens rollen BT3.2 er fortsatt ukjent, vår Resultatet tyder på at BT3.2 uttrykk ved epitelceller kan modulerer intratumoral infiltrasjon av immunceller
Citation. Le Page C, Marineau A, Bonza PK, Rahimi K, Cyr L, Labouba jeg, et al. (2012) BTN3A2 Expression i ovarialcancer er forbundet med stor tumor infiltrere T-celler og en bedre prognose. PLoS ONE 7 (6): e38541. doi: 10,1371 /journal.pone.0038541
Redaktør: Salvatore V. Pizzo, Duke University Medical Center, USA
mottatt: 6 februar 2012; Godkjent: 07.05.2012; Publisert: 07.06.2012
Copyright: © 2012 Le Page et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av en bevilgning fra Cancer Research Society og Fondation Carole Epstein. Dr. Cailhier har en clinicien-chercheur stipend fra Fonds de Recherche en Santé du Québec. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
ovarialcancer (EOC) er en ledende dødsårsaken blant gynekologiske kreftformer [1]. På grunn av sin mangel på symptomer, er denne sykdommen ofte diagnostisert på et avansert stadium (stadium III eller IV) når kreften allerede har spredd seg til sekundære områder. Standard behandling for disse pasientene er kirurgi og platina-basert kjemoterapi, selv om sykdommen ofte utvikler seg selv etter operasjonen og blir motstandsdyktig mot standard kjemoterapi [2]. Følgelig er overlevelsen av pasienter med avansert stadium EOC ekstremt lav ( 40%). Kliniske variabler, som for eksempel sykdom scenen og restsykdom, er prognostisk [3], [4], men i stor grad uninformative for de med avansert stadium sykdommen.
I en tidligere studie [5], vi utført en mRNA uttrykk profilering av høy klasse serøse EOC tumorvev å identifisere molekylære markører for prognose ved hjelp av en Affymetrix-basert genekspresjon microarray plattform. Blant de prognostiske markører er identifisert, fant vi BTN3A2, også kjent som BT3.2 og BTF4, et gen som tilhører BT3 butyrophilin familien, også en B7 underfamilie. BTN3A2 mRNA var den mest robuste biomarkør blant 8 andre som ble testet. Ikke bare gjorde det har en prognostisk betydning i univariate og multivariate analyser, men det viste også den høyeste fareforhold sammenlignet med de andre molekylære og kliniske prognostiske variabler. Høy ekspresjon av mRNA BT3.2 var sterkt assosiert med en god prognose i forhold til sykdomsfri overlevelse og total overlevelse. Som en EOC prognostisk markør den nådde 87% spesifisitet og 77% sensitivitet for å forutsi tidlig tilbakefall ( 18 måneder). I en kohort av 52 pasienter [5]
butyrophilin (BTN) familie inneholder BTN1A1, BTN2A1 , BTN2A2, BTN2A3, BTN3A1, BTN3A2, BTN3A3, og BTN-Som medlemmer. Interessant, disse nye BTN familiemedlemmer dele betydelig homologi med B7 familiemedlemmer, som har en IGV-lignende exoplasmic domeneetterfulgt av en annen exoplasmic IGC-lignende domene. Den cytoplasmaområde inneholder en proteinbinding SPRY /PRY B30.2 domene [6], [7], [8]. I motsetning til andre medlemmer BTN, betyr BT3.2 ikke har et B30.2 domene i den intracellulære regionen [7], [9]. BT3 molekyler (BTN3A1 /BT3.1, BTN3A2 /BT3.2 og BTN3A3 /BT3.3) er kjent for å uttrykkes på endotel-celler [10], i membranlaget som omgir melkefett-sekreterende dråpe fra mammary epitelceller [11] , på immunceller, og på noen tumorcellelinjer [5], [12].
B7-molekyler kan være negative eller positive regulatorer av T-celleaktivering. B7-H1 /PD-L1, B7-H3, B7-H4, B7DC /PD-L2, B7S3, B7S1, BTNL2, BTN1A1 kan BTN2A2 hemme T-celledeling levere en hemmende signal. Omvendt, har B7-H3 vært ansett som en positiv og negativ regulatorisk molekyl i stand til å stimulere eller inhibere CD4 + og CD8 + T-celler, avhengig av den cellulære forbindelse [13], [14], [15], [16]. Tilsvarende har enkelte BTN familiemedlemmer nylig dukket opp som nye regulatorer av immunsystemet. Disse inkluderer BTNL2 [17] – [18] BT1.1, BT2.2 [19], BTNL1 [20], [21], og de BT3 molekyler. For eksempel, Yamashiro
et al.
[22] ble behandlet PMBC med et antistoff mot BT3.3 og det observert en hemming av CD4 + og CD8 + celle-proliferasjon, samt redusert cytokin sekresjon av begge typer av T-celler. I en annen rapport, Cubillos-Ruiz
et al
. viste at BT3 ekspresjon på antigen-presenterende celler (APC) hemmet
in vitro
T-celleformering og Th1 cytokinsekresjon [23]. Selv om disse studier har sett på funksjonen av B7-familien når den uttrykkes på immun komponent, er det ikke klart hvordan disse molekylene kan påvirke immunrespons når de uttrykkes ved andre celletyper. Faktisk støtter publiserte data uttrykk for BT3 på EOC celler i primær vev og metastatisk vev [23]. I tillegg Messal N.
et al
. har nylig rapportert at BT3 virker som et ko-stimulerende molekyl på CD4 + T-celler og NK-celler [24]. Interessant, observerte de en differensial immun-regulerende rolle de ulike BT3 isoformer. Til sammen tyder dette på at komplekse mekanismer kan styre funksjonen av BT3 molekyler. Ytterligere observasjoner er nødvendig for å forstå den eksakte rolle disse molekylene i en kontekst bestemt måte.
For å bedre forstå hvilken rolle BT3.2 i eggstokkreft og mer spesielt å bekrefte vår observerte sammenslutning av mRNA BT3.2 uttrykk med en god pasient prognose [5], utførte vi en immunhistokjemi analyse av BT3.2 protein uttrykk på en stor kohort av 199 høy klasse serøs EOC pasienter og bekreftet foreningen av BT3.2 og prognose for EOC pasienter. Parallelt, analyserte vi tettheten av intratumorale immunceller og fant en positiv korrelasjon mellom BT3.2 ekspresjon av EOC celler og intratumoral infiltrasjon av T-celler, mens en høy CD206 + /CD68 + ekspresjon forholdet var forbundet til kortere sykdomsfri overlevelse. Disse resultatene tyder på en rolle BT3.2 i svulsten infiltrasjon av immunceller.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
Etikk godkjenning ble innhentet av lokale institusjonelle Etisk Råd (Comité d’éthique de la recherche du Centre hospitalier de l’Université de Montréal). Tumorprøver ble samlet inn og banked følgende passende skriftlig samtykke fra pasienter som gjennomgår kirurgi i Onkologisk avdeling ved Senter Hospitalier de l’Université de Montréal fra 1993 til 2010.
Pasienter og vevsprøver
Tumor prøvene ble samlet inn og banked følgende passende samtykke fra pasienter som gjennomgår kirurgi i Seksjon for gynekologisk onkologi ved Centre Hospitalier de l’Université de Montréal fra 1993 til 2010. en uavhengig patolog scoret svulst klasse og scene og en gynekologisk onkolog scoret svulst restsykdom etter til kriterier fra International Federation of Gynekologer og Fødselsleger [25]. Mindre enn 10% av prøven ble ekskludert på kvalitet, og dette ble ikke korrelert til alder av prøven. Kliniske data på progresjonsfri intervall ble definert i henhold til skanne bildebehandling og nivå av blod ca125 [26]. Total overlevelse ble definert som tiden fra kirurgi for å dø av kreft i eggstokkene. Pasienter som er kjent for å være fortsatt i live på tidspunktet for analyse ble sensurert på tidspunktet for deres siste oppfølging. Pasient sykdomsfri overlevelse (DFS) ble beregnet fra tidspunktet for operasjonen til den første progresjon. Kriteriene for inklusjon i studien var som følger: ingen pre-operative kjemoterapeutisk behandling for eggstokkreft, platina-baserte postoperativ kjemoterapi behandling, høye svulster klasse, serøs histopatholgy subtype og fullført informert samtykke. Alle pasientene fikk en platina-basert kjemoterapi som en innledende behandling etter kirurgi med unntak av pasienter som døde kort tid ( 3 måneder) etter operasjonen. Pasienter som døde av annen sykdom ble sensurert ved siste oppfølging. En gynekologisk onkolog anmeldt kliniske data for alle pasienter. For sykdomsfri progresjon studien ble bare pasienter med klinisk oppfølging av minst 18 måneder eller til tilbakefall av sykdommen inkludert. Karakteristikk av svulster og pasientenes prognose for prøvesettene er oppsummert i tabell 1.
cellekulturer og Cell Pellets i Histogel
For å verifisere specifity av BT3.2 antistoffer , TOV-112d celler og avledede cellelinjer ble dyrket i OSE medium (50:50 blanding av 199 og 105 Sigma medier) supplert med 0,5 ug /ml amfotericin B, 50 ug /ml gentamycin og 10% FBS (føtalt bovint serum). Avledede celler media ble også supplert med 0,5 ug /ml puromycin. Celler ble opprettholdt i en inkubator fuktet ved 37 ° C med en atmosfære inneholdende 5% CO2 i det vesentlige som beskrevet [27]. Celler pellet innebygd i parafin ble preparert som tidligere beskrevet [28].
Plasmider
BT3.1, BT3.2 og BT3.3 sekvenser ble subklonet i pef6v5 vektorer og var en sjenerøs gave av Dr. Rhodes (Cambridge, UK) [7]. Alle plasmider ble verifisert ved sekvensering. De BT3 isoform sekvenser PCR forsterket og subklonet i pENTR ™ /D-TOPO® (Invitrogen, Carlsbad, California) og deretter saman i pLenti-CMV /TO-puoDest (Abgene) [29]. Lentiviral partikler produksjon og celle infeksjon ble gjort som tidligere rapportert [30].
Tissue microarray
Områder i svulsten ble valgt basert på gjennomgang av en hematoksylin-eosin-farget lysbilde. FFPE- tumorvev ble deretter vevsprøve ved hjelp av en 0,6 mm diameter vev arrayer og resulterende kjerner ble kledd inn i et rutenett i en mottaker parafin blokk. Vevet utvalg besto av 260 eggstokkreft prøver og 11 prøver av områdene fra normale egglederne av kreftpasienter. Etter gjennomgang av kliniske data 61 pasienter ble ekskludert fra den endelige analysen som de ikke oppfyller inklusjonskriteriene. Dette vevet rekke ble deretter seksjonert, farget med hematoksylin-eosin og fikk en annen patologi gjennomgang for å bekrefte svulst innhold.
Immunohistochemistry (IHC)
formalinfiksert parafin innebygde svulster ble delt på 4 pm og lysbilder var farget manualy på benken eller bruker benchmark XT automatiserte Stainer (Ventana Medical System Inc.). For den manuelle metoden, ble vevssnitt kort oppvarmet ved 50 ° C i 15 minutter, deparaffinized i toluen og rehydrert i en etanol-gradient. Objektglass ble neddykket i Tris-EDTA-buffer (10 mM Tris-base, 1 mM EDTA justert til pH 9,0) og trykk kokt i 15 minutter å avsløre antigener. 0,6 eller 3% H
2o
2 behandling ble brukt til å eliminere endogen peroksidase aktivitet. Seksjonene ble blokkert med en blokkerende protein serumfritt reagens (DakoCytomation Inc., ON, Canada) og inkubert med forskjellige antistoffer i 60 eller 120 minutter ved romtemperatur. Den optimale konsentrasjon for hvert primært antistoff ble bestemt ved seriefortynninger. Antistoffer og IHC forholdene er oppført i tabell S1. Vev ble inkubert med en geit anti-mus HRP-konjugert antistoff (1:150) (sc-2005, Santa Cruz Biotechnology, CA, USA). For BT3.2, ble vevene inkubert med et sekundært biotinylert antistoff (DakoCytomation Inc., ON, Canada) i 30 minutter etterfulgt av inkubasjon med et streptavidin-peroksydase-kompleks (DakoCytomation Inc., On, Canada) i 30 minutter ved romtemperatur. Reaksjonsprodukter ble utviklet ved hjelp av diaminobenzidin som inneholder 0,3% H
2o
2 som en peroxydasesubstrat. Kjerner ble kontra med hematoksylin. Med automatisert Stainer, ble antigen gjenfinning for CD206 og CD4 utført med Cell Conditioning 2 (VMSI; # 950-123). Prediluted antistoff ble automatisk dispensert, og objektglassene ble inkubert ved 37 ° C i 30 minutter. Ultra DAB deteksjon kit (VMSI; # 760-091). Lysbilder ble kontra med hematoksylin (VMSI; # 760-2021). Alle seksjonene ble observert ved lysmikroskopi ved 400 x forstørrelse. Substitusjon av det primære antistoff med fosfat-bufret saltløsning tjente som en negativ kontroll.
Immunofluxorescence (IF)
formalinfikserte parafin innleiret tumorer ble farget manualy etter antigen gjenfinning i Tris-EDTA (10 mM Tris base, 1 mM EDA justert til pH 9,0) i 15 min i pressur komfyr. Seksjonene ble blokkert med en blokkerende protein serumfritt reagens (DakoCytomation Inc., ON, Canada) og inkubert med anti-CD68-antistoffer i 90 minutter ved romtemperatur. Vevene ble deretter inkubert med et geit anti-mus Cy5 (1/200) i 45 min. Mus IgG-antistoffer ble deretter blokkert over natten med M.O.M. ™ reagens (Vector Laboratories, Burlingame, CA). Anti-CD206 antistoff ble inkubert i 90 minutter ved romtemperatur. Vevene ble deretter inkubert med geite-anti-mus Alexa Fluor A488 (1/250) i 45 minutter før vasking og behandling med 0,1% Sudan svart B i 10 min for å redusere autofluorescens. Lysbilder ble kontra med ProLong® gull antifade fluorescerende montering media med DAPI (molekylære prober). Lesningen ble utført av mikroskop analyse ved høy effekt og deretter dual immunoflourescent farging ble evaluert for validering.
Farging Kvantifisering
tumorsnitt ble skannet og digitalt visualisert. For BT3.2, ble epitelceller soner innlegg i henhold til den fargeintensitet av den epiteliale membran (verdi fra 0 til fravær, en for svak, 2 til moderat, 3 for høy intensitet) som illustrert i figur 1. I kjerner hvor flekker var av variabel intensitet gjennomsnittlig intensitet ble rapportert. Kvantifisering av infiltrerende lymfocytter ble utført ved å telle antallet av nukleerte celler med positiv farging i intraepitelial holmer. Resultater ble deretter kategorisert som 0 (ingen celler), 1 (0 n 10), to (10 n 90) og 3 (n 90) tilsvarende av antall celler tellet. Kvantifisering av makrofager ble utført ved å evaluere prosentandelen av fargede celler i intraepitelial området. Den relative tetthet av CD206 + celler ble beregnet ved forholdet CD206 + /CD68 + fargede celler. Hver matrise ble uavhengig analysert i en blind studie av to uavhengige observatører. Inter-rating var korrelasjonen 75%. Når sterke forskjeller i score mellom de to observatører (mer enn 1 enhet per kjerne) inntraff kjernen ble re-evaluert for å nå en konkordant scoring mellom de to observatører. Gjennomsnittet av alle kjerner med cancer fra den samme pasient ble anvendt for analyse.
A. Western-blot analyse av totale proteinekstrakter fra TOV112D cellelinje infisert med PLenti (vektor kontroll), BT3.1, BT3.2 eller BT3.3 virus konstruksjoner. Ekstraktene ble lastet inn i triplikat på 10% SDS /PAGE-gel og membraner ble hybridisert med anti-CD277 (eBioscience), anti-BT3.3 (Atlas antistoffer) og anti-BT3.2 (SDIX Inc.) som indikert ved bunnen av figuren. B. Immunohistokjemi analyse av parafininnstøpte celle pellets fra TOV112D cellelinje infisert med enten PLenti (vektor kontroll), BT3.1, BT3.2 eller BT3.3 virus konstruksjoner. Bare celler transfektert med den BT3.2 konstruksjonen farget positivt med anti-BT3.2 (SDIX Inc.). C. Immunohistokjemi av xenografttumorer fra TOV112D transfektert med enten tom vektor eller BT3.2 konstruere. Bare celler infisert med den BT3.2 konstruksjonen farget positivt med anti-BT3.2 (SDIX Inc.). D. representant farging for immunhistokjemi av BT3.2 på en høyverdig serøs EOC TMA. Fra venstre til høyre:. Negativ, lav, moderat og høy intensitet
Western blot analyse
Celler ble lysert med kald lysebuffer (10 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT /1 mM NaF /0,5% NP-40 /og protein-inhibitorer) og sentrifugert i 10 minutter ved 13 000 rpm. Klare lysater ble deretter kokt i ladningsbuffer, separert ved 10% SDS-PAGE, og overført på en nitrocellulosemembran. Membranene ble mettet med 5% melk /PBS /0,1% Tween 20 immundeteksjon ble utført som beskrevet i protokollen for ECL (Amersham Pharmacia): dvs. inkubert i 2 timer ved romtemperatur eller O /N ved 4 ° C med det spesifikke antistoff, vasket med PBS /Tween 0,01% og inkubert i ytterligere 30 minutter ved romtemperatur med peroksidase-konjugert antistoff (i Santa-Cruz Biotechnology Inc.). Western-blot analyse ble utført med beta-aktin AC-15 (ab6276 fra Abcam inc. MA, USA), anti-CD277 /BT3.1 (# 14-2779 fra eBioscience, San Diego, CA, USA), anti-BT3 0,2 (SDIX, Newark DE, USA), anti-BT3.3 (HPA007904, Atlas Antistoffer, Stockholm, Sverige). Forsøkene ble gjort i tre eksemplarer.
Statistical Analysis
Pearson korrelasjon test (tosidige) ble brukt til å beregne korrelasjon med klinisk-patologisk variabler og markører som kontinuerlige variabler. Overlevelseskurver ble plottet ved hjelp av Kaplan-Meier kurve analyse og log-rank test ble brukt til å teste for signifikante forskjeller. Mottaker operative karakteristiske (ROC) kurver ble anvendt for å bestemme grenseverdien for hver markør som svarer til den beste følsomhet og spesifisitet for pasient progresjon før 18 måneder (tidlig sykdomsprogresjon) eller etter 20 måneder (sen sykdomsprogresjon) fra første diagnose (p 0,05 og området 0,60) som allerede rapportert [5]. Univariate og multivariate Cox proporsjonal fare modeller ble brukt for å estimere hasardratio for hver markør som kontinuerlige variabler. Multivariat analyse ble gjort ved hjelp av en fremover trinnvis risikomodell på univariat analyse er nødvendig for oppføring i modellen. Bare fire variabler ble inkludert i multivariat Cox regresjonsmodell for å unngå over-fitting. Multivariat analyse ble utført ved hjelp av en angi fare modell. Utvalgsstørrelse (n 100 hvor n = 10 k /p) og normalfordeling av BT3.2 uttrykk ble vurdert før påføring av Cox modell. Alle statistiske analyser ble gjort ved hjelp av statistikkprogrammet for samfunnsvitenskap programvare versjon 11.0 (SPSS, Inc.), og statistisk signifikans ble satt til
P
. 0,05
Resultater
uttrykk for BTN3A2 /BT3.2 i EOC Vev
for å undersøke sammenhengen mellom av BT3.2 uttrykk i EOC celler og pasient overlevelse, utførte vi en immunhistokjemi analyse i en kohort av 199 høyverdig serøs eggstokkreft kreftpasienter. Først vurderte vi spesifisitet av tilgjengelige antistoffer mot BT3 isoformer. Vi fant 3 forskjellige antistoffer kommersielt tilgjengelige: anti-CD277 (eBioscience Inc.), anti-BT3.3 (Atlas) og anti-BT3.2 (fra SDIX Inc.). Antistoffer ble testet av western-blotting på cellulære ekstrakter fra TOV112D eggstokkreft cellelinje infisert med enten BT3.1, eller BT3.2 eller BT3.3 retroviruspartikler. Som vist i figur 1A, anti-CD277 anerkjent BT3.1 og BT3.2 isoformer. Som forventet, anti-BT3.3 antistoff utelukkende anerkjent BT3.3 isoformen og anti-BT3.2 spesielt anerkjent BT3.2 isoformen. For å bekrefte spesifisiteten til anti-BT3.2 antistoff på parafin innleiret vev, vi også analysert farging av parafininnstøpte cellepelletene og xenograft vev fra 112d TOV celler transfektert med enten tom vektor eller BT3 isoform konstruksjoner. Som vist i figur 1B og 1C, anti-BT3.2 antistoff var i stand til å farge bare de BT3.2 cellepellet og BT3.2 xenograft tumor.
Membran og cytoplasmisk ekspresjon av BT3.2 i eggstokkreft vev ble observert og avsluttet i henhold til intensiteten av fargingen som fraværende, lav, moderat eller sterk (0, 1, 2, 3 henholdsvis) (figur 1D). Tilstedeværelse av BT3.2 protein ble observert på epitelceller og i noen vev kjerner, kan det også bli funnet i stroma. Nesten alle EOC kjerner (n = 193, 97,5%) viste uttrykk for BT3.2. På epitelceller ble både cytoplasma og membranen farging sett (figur 1D) og varierte fra fraværende til sterk (figur 1D, tabell 1). De epitel BT3.2 uttrykk nivåer var ikke signifikant korrelert med pasientens alder ved diagnose eller svulst klasse. I motsetning til pasienter med høyere nivå av epiteliale BT3.2 tendens til å ha lavere nivå av restsykdom og nedre fasen sykdom (p = 0,058 og p = 0,043, respektivt, tabell 2).
BT3. 2 Protein Expression er assosiert med total overlevelse og Sykdomsfri Progresjon
Vi har tidligere undersøkt forholdet mellom BT3.2 mRNA uttrykk og eggstokkreft pasient prognose. Kaplan-Meier og Cox proporsjonal risikomodell ble brukt til å estimere sammenhengen mellom BT3.2 mRNA og prognose som definert av total overlevelse eller sykdomsfri overlevelse (DFS) innen 18 måneder etter operasjonen [5]. I den foreliggende studien undersøkte vi hvorvidt BT3.2 protein kan også være av prognostisk verdi. For dette formålet, ble protein uttrykk for BT3.2 analysert i 199 høyverdig serøs pasienter og statistiske analyser ble utført med hensyn på total overlevelse og DFS. Kohorten egenskaper er beskrevet i Tabell 1.
Kaplan-Meier-kurver viste at det var en sterk sammenheng mellom høy uttrykk for BT3.2 protein og økt generell pasient overlevelse (p = 0,014; log rank = 6,03) ( Figur 2A). Gjennomsnittlig overlevelse intervall var 85 måneder for pasienter med høyere BT3.2 sammenlignet med 59 måneder for pasienter med lavt nivå av BT3.2. Tilsvarende pasienter med høyere uttrykk av BT3.2 hadde en gjennomsnittlig progresjon intervall på 86 måneder sammenlignet med 55 måneder for pasienter med lav uttrykk for BT3.2 (p = 0,002, log rank = 9,65) (figur 2B).
Kaplan-Meier-kurver for total overlevelse (A) og sykdomsfri overlevelse (B) i 194 og 171 pasienter, henholdsvis. Signifikans (p) er angitt med log rank.
I univariate Cox regresjonsanalyse ble kontinuerlig nivå av BT3.2 protein vurderes å reflektere forholdet mellom økende grad av BT3.2 uttrykk og forbedret prognose . I denne analysen ble økt ekspresjon av BT3.2 forbundet med en forholdsvis høy farerisiko (HR) for overlevelse (HR = 0,651, 95% CI 0,479 til 0,884, p = 0,006, tabell 3). Tilsvarende økte BT3.2 uttrykk var signifikant assosiert med senere sykdomsutvikling (HR = 0,642,% 95CI 0,483 til 0,853, p = 0,002) (tabell 3).
I multivariat Cox regresjonsanalyse, når standard prognostiske variabler ble foretatt (alder, scene og restsykdom), forble BT3.2 en uavhengig variabel forutsi en høy risiko for overlevelse (HR = 0,597,% 95CI 0,415 til 0,859, p = 0,005) og sen progresjon risiko i denne multivariate modellen (HR = 0,675,% 95CI 0,487 til 0,935, p = 0,018) (tabell 3).
Forholdet mellom BT3.2 Expression og Immune Infiltrere
Vi antok at forholdet mellom epitel BT3. 2 uttrykk og en god prognose var på grunn av påvirkningen på tumor infiltrerende immunceller, siden det er kjent at B7 familie molekyler har co-regulatoriske funksjoner på T-celler. I tillegg er graden av intratumoral immuncelleinfiltrasjon vært knyttet til prognose av ovarialcancer pasienter [31]. For å undersøke denne hypotese, vurderte vi ved immunohistokjemi tilstedeværelse av T-celler ved CD3 +, CD4 + og CD8 + farging i samme TMA anvendt for BT3.2 analyse. Vi vurderte også viktigheten av intratumoral B-celle (CD20 +) og makrofag (CD68 +) infiltrasjon. To klasser av makrofager er blitt beskrevet, anti-tumoral (M1) og pro-tumoral (M2). Siden i de fleste tumorer, tumorassosierte makrofager (TAM) har en M2-fenotype [32], [33], bestemt vi tettheten av infiltrerende CD206 + -celler som en surrogatmarkør for alternative pro-tumorale M2 makrofager, siden de har en tendens til å uttrykke høyere nivå CD206 markør enn M1 makrofager. For å bekrefte spesifisiteten av CD206 uttrykk av makrofager i EOC svulster, utførte vi en kontroll dobbel immunfluorescens farging på et begrenset antall vev (figur S1). CD206 ekspresjon nesten alltid samlokalisert med CD68 ekspresjon tyder på makrofag-uttrykk.
Som vist i figur 3 og 4A-B, immun infiltrasjon av T-celler, B-celler og TAM ble observert i vev EOC på ulike tettheter i de intraepitelial områder. Den intraepitelial infiltrasjon av T-celler, CD3 +, CD4 + eller CD8 +, var sterkt korrelert med tilstedeværelse av CD20 + B-celler (P 0,001) og CD68 + makrofager (P 0,001), blant annet CD206 + celler (tabell 4). Den intraepitelial infiltrering av B-celler ble også assosiert med tilstedeværelse av CD68 + og CD206 + -celler (r = 0,364 og r = 0,171, p 0,001 og p = 0,022, respektivt). Interessant, andelen av CD206 + celler i forhold til den totale tetthet av CD68 + makrofager, idet forholdet CD206 + /CD68 + ekspresjon, ble inverst korrelert til tilstedeværelsen av CD3 + T-celler og hadde en tendens til å korrelere med nærværet av B-celler (r = -0,216, p = 0,005 og r = -0,141, p = 0,063, respektivt) (tabell 4).
Betydelig, ble ekspresjonen av BT3.2 ved EOC celler korrelert med intraepitelial infiltrering av CD3 + celler (r = 0,174 , p = 0,018), blant annet CD8 + -celler (r = 0,176; p = 0,018) og CD4 + -celler (r = 0,272, p 0,001). Ingen signifikant korrelasjon mellom BT3.2 ekspresjon og tilstedeværelsen av CD20 + celler eller makrofager ble observert (p = 0,137, tabell 4).
høy og lav tetthet av CD3 + (T-celler), CD4 + (T-celler), CD8 + (T-celler) og CD20 + (B-celler) er vist på venstre og midtre paneler. En forstørrelse i høy infiltrasjon området er vist på høyre panel for hver farging.
Association of intratumoral lymfocytter, makrofager og EOC Pasient prognose
Som rapportert av andre [ ,,,0],31], nærværet av CD4 + celler, ble også omvendt korrelert med tidlig utvikling av sykdommen (r = -0,187, p = 0,021, tabell 5). Kaplan-Meier kurve analyse og log rank test bekreftet at høy intraepitelial tetthet av CD4 + var assosiert med en bedre prognose (tabell S2). Den midlere progresjon intervall på pasienter med høye intra-epitelial CD4 + -celler var 69 måneder, sammenlignet med 59 måneder hos pasienter med lav intraepitelial CD4 + tetthet (p = 0,011, log rank = 6,5). Vi har imidlertid ikke observere noen signifikant sammenheng mellom intraepitelial tetthet av CD3 + eller CD8 + celler og pasient prognose (tabell 5 og tabell S2). Vi fant en signifikant sammenheng mellom CD20 + celleinfiltrasjon og total overlevelse (log rank p = 0,039), mens bare en trend mot et bedre sykdomsfri overlevelse ble oppnådd (log rank p = 0,0677). Men foreningen med total overlevelse ble ikke sett når CD20 + ble ansett som en kontinuerlig variabel i univariate Cox regresjonsmodellen (p = 0,21).
Mens vi ikke observere en sammenheng mellom tettheten av CD68 + eller CD206 + celler og pasient prognose (tabell 5), et øket forhold av CD206 + i forhold til CD68 + celler ble positivt korrelert med sykdomsprogresjon (r = 0,157, p = 0,049, tabell 5). Dette forholdet ble bekreftet av Kaplan-Meier kurve analyse (p = 0,005, log rank = 7,83, figur 4D, Tabell S2) og univariate Cox regresjonsanalyse (HR = 1,355, 95% KI 1,223 til 5,332, p = 0,044). Videre CD206 + relativ tetthet tendens til å assosiere med dårlig total overlevelse (log rank = 3.53, p = 0,06) (figur 4C, Tabell S2) med en hasardratio på 2,077 (% KI 95, 0,947 til 4,558, p = 0,068).
høy og lav tetthet av CD68 + (tumor-assosierte makrofager, TAM) (A) og CD206 + (M2 subtypen av TAM)-celler (B). Forstørrelse i høy infiltrasjon området er vist på høyre panel for hver farging (øverst). C og D. Kaplan-Meier-analysen av forholdet mellom infiltrerende intraepitelial CD206 + /CD68 + celler som representerer den relative tettheten av CD206 + M2 TAM i den totale tettheten av CD68 + intraepitelial infiltrerende makrofager. Kaplan-Meier-kurver for total overlevelse (C) og sykdomsfri overlevelse (D) i 180 og 174 pasienter, henholdsvis. Signifikans (p) er angitt med log rank.
Diskusjoner
I denne studien, immunhistokjemi avslørte BTN3A2 /BT3.2 flekker i høyverdig EOC serøs svulster fra 199 pasienter. Ekspresjon ble påvist ved høy frekvens (97,5%) i samsvar med tidligere data analyse av mRNA-ekspresjon i serøse EOC vev [5]. Det viktigste med denne studien er bekreftelsen av BT3.2 som en potensiell prognostisk markør for høyverdig serøs EOC på proteinnivå. Den innledende undersøkelsen identifiserer BT3.2 mRNA som en prognostisk markør var begrenset til et relativt lite sett av 52 tilfeller. Her, ikke bare vi bekreftet forholdet mellom BT3.2 og et bedre resultat i en stor årsklasse, men også på proteinnivå ved immunhistokjemi. Dette utgjør en lettere transponerbart teknikk i en klinisk patologi avdeling enn mRNA deteksjon som Q-PCR. Pasienter med høy epithelial farging av BT3.2 hadde 1,53 ganger mindre risiko for å dø av sykdommen enn pasienter med lav grad av BT3.2 uttrykk. Foreningen av BT3.2 til overlevelse og sykdomsutviklingen var et selvstendig parameter i en multivariat Cox-regresjonsanalyse (tabell 3). Kombinasjon med andre uavhengige molekylære markører kan forbedre sin kliniske resultatene som til dags dato ingen individuelle markør har vist tilstrekkelig sensitivitet og spesifisitet.
En begrensning av vår studie er det lave antall pasienter uten restsykdom (n = 23) , som ikke tillater oss å analysere dem som en uavhengig kohort. Optimalt debulked pasienter, samlet har bedre prognose enn pasienter med restsykdom [34] som en prognostisk biomarkør kan være mindre informativ.
