Abstract
Formål
Nye legemidler mot kreft som er rettet mot en enkelt celle overflate reseptor, oppregulert eller forsterket genprodukt, eller muterte genet, har møtt med en viss suksess i behandling av avansert kreft. Men pasientenes svulster fortsatt slutt fremgang på disse terapi. Hvis det var mulig å identifisere et større antall målrettbare sårbarheter i en persons svulst, kan flere mål utnyttes ved bruk av spesifikke terapeutiske midler, og dermed muligens gi pasienten levedyktige terapeutiske alternativer.
Experimental Design
i denne utforskende studie, brukte vi neste generasjons sekvensering teknologier (NGS) inkludert hele genomsekvensering (WGS), og der det er mulig, hele transkriptomet sekvensering (WTS) for å identifisere genomiske hendelser og tilhørende uttrykk endringer i avanserte kreftpasienter.
Resultatene
WGS på paret tumor og normale prøver fra ni avanserte kreftpasienter og WTS på seks av disse pasientenes svulster ble gjennomført. En pasient behandling var basert på mål og veier er identifisert ved NGS og pasienten hadde en kortvarig PET /CT-reaksjon med en betydelig reduksjon i sin tumor-relatert smerte. Å utforme behandlingsplaner basert på informasjon fått fra NGS, flere utfordringer ble møtt: NGS rapportering forsinkelser, formidling av resultater til out-of-state deltakere og deres behandling av onkologer, og kjede av varetekt håndtering for nye biopsiprøver for Clinical Laboratory Improve Endringer ( CLIA) mål validering.
Konklusjon
Mens den opprinnelige innsatsen var en langsommere prosess enn forventet på grunn av en rekke problemer, vi demonstrere gjennomførbarheten av å bruke NGS i avanserte kreftpasienter, slik at behandling for pasienter med progresjon svulster kan forbedres
Citation. Weiss GJ, Liang WS, Demeure MJ, Kiefer JA, Host G, Izatt T, et al. (2013) En pilotstudie med Next-Generation Sequencing i Avanserte Kreft: Feasibility og utfordringer. PLoS ONE 8 (10): e76438. doi: 10,1371 /journal.pone.0076438
Redaktør: Patrick Tan, Duke-National University of Singapore Graduate Medical School, Singapore
mottatt: 24 april 2013; Godkjent: 23 august 2013; Publisert: 30 oktober 2013
Copyright: © 2013 Weiss et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Funding var levert av National Foundation for kreftforskning (www.nfcr.org) og Lee T. Hanley Fund for kreft i bukspyttkjertelen forskning (https://www.tgenfoundation.org/netcommunity/page.aspx?pid=1196). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Pasienter med fremskreden kreft ofte eksos behandlingstilbud. De kan delta i fase I eller fase II-studier av nye legemidler mot kreft hvis de møter vanligvis strenge kriteriene og har tilgang til sentre som kan administrere investigational agenter. Når pasienter deltar i disse studiene, nye agenter i gjennomsnitt gi responsrater på mellom 5% og 10% i en fase I innstillingen og 12% i en fase II-innstillingen [1] – [3]. Pasientene har også et alternativ for beste støttebehandling i et forsøk på å løse sine symptomer.
I det siste har det vært en eksplosjon av interesse for å utvikle nye legemidler mot kreft som er mer målrettet, vanligvis mot en celleoverflatereseptor eller en oppregulert eller amplifisert genprodukt eller muterte genet. Denne tilnærmingen er møte med en viss suksess (f.eks trastuzumab mot HER2 /
neu
i brystkreftceller, erlotinib mot EGFR-mutant ikke-småcellet lungekreft, etc.). Men pasientenes svulster fortsatt slutt fremgang på disse terapi fordi de inneholder flere genomiske avvik, og rettet mot en enkelt abnormitet er ikke tilstrekkelig til å hindre utviklingen. Hvis det var mulig å identifisere et større antall mål i en persons svulst der det finnes midler som potensielt kan målrette dem, kunne flere mål tas opp ved hjelp av bestemte terapeutiske midler, og kanskje redusere sjansen for progresjon. Til slutt, de fleste forskere ser for å benytte flere agenter for å treffe flere mål som foreligger i en pasients tumor. Men identifisering og bruk av riktige therapeutics er fortsatt en utfordring.
Vi har tidligere gjennomført en prospektiv multisenterstudie utnytte molekylære profilering av svulster ved immunhistokjemi (IHC), til fluorescerende in situ hybridisering (FISH), og DNA microarray finne potensielle narkotika mål og utvalgte behandlinger tilsvar [4]. Seksti-seks av 84 pasienter ble behandlet basert på molekylær profilering av deres tumor. For 18 av disse 66 pasienter, behandling avledet av molekylær profilering, førte til en progresjonsfri overlevelse forholdet ≥1.3, og dermed tyder på en behandling fordel. Molekylær profilering støttet indikasjon på en ny behandling ikke tenkt å begynne med etterforsker, i en pasientpopulasjon som ble tungt forbehandlet og motstandsdyktige overfor tidligere behandlinger.
For å bygge videre på dette første skritt mot personlig terapi, brukte vi neste- generasjons sekvense teknologier (NGS) inkludert hele genomsekvensering (WGS), og der det er mulig, hele transkriptomet sekvensering (WTS) for å identifisere genomiske hendelser og tilhørende uttrykk endringer i avanserte kreftpasienter. Vi brukte WGS å sekvensere svulst biopsi DNA og matchet germline DNA fra ni avanserte kreftpasienter til å identifisere viktige somatiske endringer. Kimlinje DNA ble tatt prøver fra hvite blodceller og tumor DNA ble tatt prøver fra tumorceller. For seks av disse pasientene har vi også brukt WTS å sekvensere total RNA isolert fra svulsten, sammen med ikke-pasient total RNA kontroller. Fordi genekspresjonsprofiler variere mellom vevstyper, og sunt vev ble ikke vevsprøve fra pasienten for sammenligning, kommersielt innkjøpt normal RNA til det tilsvarende vev ble sammenlignet med RNA isolert fra svulsten. Vi vurderte deretter transcriptomic endringer og utført integrerte genomikk analyser [5] med WGS data for å identifisere potensielle druggable mål. Her viser vi gjennomførbarhet og fremheve de utfordringene ved bruk av NGS teknologier i en potensiell måte i avanserte kreftpasienter.
Metoder
Etikk erklæringen
Studien ble gjennomført i henhold med Helsinkideklarasjonen og ble godkjent av Western Institutional Review Board (WIRB® Protocol # 20101288) (NCT01443390). Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra pasienter, inkludert skriftlig samtykke for offentliggjøring av de kliniske detaljer og bilder.
Study Mål
Det primære målet med denne studien var å identifisere så mange genomisk endringer som mulig i avansert kreft, slik som å utvide utvalget av potensielle handlings mål med behandlinger som var kommersielt tilgjengelige eller kliniske studier. Sekundært mål var å utvikle en arbeidsflyt fra svulst biopsi til behandling; ja, må denne prosessen skje i løpet av kort nok tidsramme for at pasienter å dra nytte av denne tilleggsinformasjonen i å utvikle en behandlingsplan. Dette inkluderte å måle tiden fra biopsi til fullføring og endelig analyse av NGS på pasientens tumor- og ikke-tumorprøver, undersøke den frekvens med hvilken brukbar sekvensdata er oppnådd som en funksjon av prosent tumor engasjement i biopsi, og vurdering av korrelasjon mellom anti -tumor aktivitet av behandlinger som er identifisert av NGS.
studie~~POS=TRUNC
Bakgrunnen for denne studien er at NGS kan brukes til å identifisere ikke bare én, men mange genomiske avvik som kan være målrettet hjelp potensielt tilgjengelig terapi i avanserte kreftpasienter. Dette enkelt senter, prospektiv, enkelt-arm pilotstudie ble utført på pasienter med avansert kreft som progrediert på standard systemisk behandling eller om hans eller hennes tumor type hadde ikke en standard systemisk behandling. Denne studien var utforskende i naturen. For å delta, må pasientene ha vært alder ≥18 og villig til å gjennomgå en biopsi eller kirurgisk inngrep for å få vev, med mindre en frossen svulst samlet mindre enn 8 uker før var tilgjengelig. Interesserte deltakere ble gjort oppmerksom på at å skaffe en ny biopsi kan ikke være en del av pasientens rutine omsorg for deres malignitet. Andre kriteriene inkludert: baseline laboratorium data indikerer akseptabel benmargsreserver, lever og nyrefunksjon, Karnofsky funksjonstilstand ≥80%, og forventet levealder 3 måneder. Deltakelse på en annen klinisk studie med behandling før eller under deltakelse på denne studien var tillatt. Viktigste eksklusjonskriteriene var symptomatiske eller ubehandlede sentralnervesystemet (CNS) metastaser, kjente aktive infeksjoner som krever intravenøs antimikrobiell behandling, gravide eller ammende kvinner, eller svulst som var utilgjengelig for en biopsi. Personer med kjent HBV, HCV eller HCV-infeksjon (er) som krever antiviral terapi ble også ekskludert som denne befolkningen er ofte ekskludert fra første-in-menneske onkologi kliniske studier; dermed begrense mulighetene for potensielle behandlingstilbud for denne gruppen. Alle kvalifiserte pasienter hadde fullblod og en fersk frosset tumorprøve samlet inn og sendt til analyse. Disse metodene og informasjon for rå sekvense data er beskrevet nærmere i Supplerende delen. Vi først antatt ca 100 dager fra den ferske svulst biopsi til ferdigstillelse av NGS. Etter NGS analyse ble utført, de viktigste etterforskere gjennomgått resultatene, og når det er klinisk hensiktsmessig, valgte målene for validering av en CLIA-sertifisert (Clinical Laboratory Improve Endringer) laboratorium. For fem pasientprøver med lav svulst prosent, ble exome sekvense tilsatt for å identifisere potensielle handlings mål. Etter målet validering, ble en rapport gitt til behandlende onkolog med potensielle behandlingsanbefalinger, som kan brukes på hans /hennes skjønn.
Resultater
Pasient Kjennetegn
Alle pasienter ble sett og evaluert for inkludering i denne studien mellom oktober 2010 og februar 2012 på et enkelt senter. For å unngå arbeidsflyt forsinkelser på tilgjengelige NGS maskiner, screening for pasienter ble fordelt slik at ikke mer enn to potensielle kandidater i måneden. Som sentrum gjennomføre undersøkelsen mottar henvisninger fra hele landet for fase 1-studier, noen individer kom fra ut av staten for en planlagt screening og samtykke evaluering, og etter bekreftelse av valgbarhet, fortsatte med en frisk svulst biopsi innen 24 timer. Dette ble gjort for pasienten lettere å tillate reise hjem kort tid etter den første vurderingen. Det skapte logistiske utfordringer med oppfølging og formidle resultater tilbake til behandlende lege. For pasienter som bor i kjøreavstand, registreringsprosessen var lik, selv om biopsi var ikke alltid planlagt for neste dag.
Tabell 1 viser egenskapene til de 11 pasientene som samtykket i denne studien. De fleste pasientene var menn, med en median alder på 59 år (range, 20 til 69 år). Av notatet, på tidspunktet for samtykke, bortsett fra én pasient (pasient 9) hadde kommet på minst én tidligere systemisk behandling ved avansert sykdom (3, range 0-8). Pasient 9, diagnostisert med avansert adenosquamous karsinom i bukspyttkjertelen, gikk systemisk terapi og deretter kommet etter NGS resultater ble tilgjengelig.
Figur 1 detaljer konsern standarder for rapportering Trials (CONSORT) diagram som viser flyten av de 11 pasientene som samtykket og ble vurdert for studien. To pasienter (pasienter 1 og 5) gjennomgikk tumorbiopsi og hadde utilstrekkelig DNA tilgjengelig for NGS analyse, på grunn av mangel på tilstrekkelig tumorcelledannelse observert i de innsamlede prøvene (tabell 1 og tabell S1). For de resterende ni pasienter med fremskreden kreft, utførte vi WGS på både tumor-DNA, så vel som kimlinje DNA isolert fra fullblod for å identifisere både somatiske endringer; henholdsvis. WGS beregninger og sammendrag statistikk for hver av de ni pasientene er vist i tabell S1. Seks pasienter hadde tilgjengelig svulst RNA som ble vellykket analysert av WTS. For de siste tre pasienter (pasienter 9, 10 og 11) som deltok på denne studien, foretok vi en mer involvert biologisk analyse av sammensatte genomiske data å skjelne kjente biologiske mekanismer som kan bli berørt i pasientens kreft å identifisere mulige terapeutiske mål.
* – Prospective berikelse analyse ble utført før diskutere resultatene med pasienten og behandle onkolog for de siste tre pasienter inkludert
av de 9 pasienter med WGS og /eller exome. sekvensering og /eller WTS analyse tilgjengelig, identifiserte vi potensielle mål og trasé for alle unntatt pasient 2 (88,9%) (tabell 1). For våre delmål, median tid fra biopsi til ferdigstillelse og endelig analyse av NGS på pasientens tumor og ikke-tumorprøver var 91 dager (variasjons 46-243 dager). De viktigste årsakene til uteliggere var enten sekvenseinstrumentproblemer eller et resultat av lav svulst prosent i prøven krever exome sekvensering for å identifisere potensielle handlings mål. For protokollen som brukes, exome sekvense krevde mer innspill DNA (3 ug) enn WGS (1 ug) og gitt informasjon om koding regioner og flankerer uoversatt regioner av genomet. For sju av tilfellene ble de innledende tumorprøver sendes direkte til vår institusjon for patologi vurderingen, slik at svulsten prosent kunne fastslås. Minste svulst cellularity innhold for vellykket NGS var 30% (tabell 1).
Hele genomsekvense
For fullstendig pilotstudie, ble sekvensering utført av syntese teknologi og 100 bp parvise end kjemi . Vi generert over 19 milliarder totalt leser fra WGS for gjennomsnittlig kartlagt dekning som strekker seg fra 17 × til 71 ×. SNP (single nucleotide polymorphism) kall ble utført ved hjelp av to separate innringere å redusere falsk negativ rate. For å vurdere den generelle kvaliteten på variant data, ble germline SNPs ringte og overgangen til transversjon og dbSNP (enkeltnukleotidpolymorfi Database) [6] 129 samstemmighet forhold ble beregnet. For alle pasienter, overgang /transversjon forholdstall var i området fra 02/01 til 02/24, og den dbSNP 129 samstemmighet varierte 86,0 til 89,4 (tabell S1). Fra disse analysene ingen skjevheter ble oppdaget med hensyn til nukleotid erstatninger, de SNPs identifisert sterkt korrelert med felles genetiske variasjoner, og høy kvalitet variant kall ble utført. For alle pasientene var det totalt 5778 koding genomiske hendelser identifisert (median = 15,5). Pasient 2, en kvinnelig aldri-røyker med metastatisk lunge adenokarsinom, næret de fleste av disse koding genomiske hendelser (n = 4137) inkludert en nonsynonymous TP53-mutasjon (G226V) med 100% mutant allel bestemt uttrykk, og en interstitiell 8q CNV (kopiantall variasjon) får altomfattende MYC. Pasient 11, en kvinne med metastatisk bronkial karsinoid, hadde færrest koding genomiske hendelser (n = 4). Exome sekvensering ble utført på tumorprøver fra pasienter 6, 7, 8, 10, og 11 med verdier som er gitt i tabell S1. CNV Resultatene er gitt i tabell S2.
Hele transkriptomet sekvense
WTS ble utført i seks pasienter (Tabell 1 og Tabell S1) og tilsvarende ikke-pasient normal RNA vev basert på primærtumor opprinnelse . Fordi normale nærliggende vev ikke ble samlet fra pasienter under biopsi, ble total RNA for det aktuelle vev kommersielt kjøpt. RNA bibliotekene var forberedt på disse prøvene og sekvensert med respektive svulst RNA biblioteker. Tumor WTS data ble sammenlignet med tilsvarende normale vev WTS data for å identifisere uttrykk endringer i tumor biopsier. Hver av de analyserte svulstene hadde gener med signifikante uttrykk endringer med q. 0,05, korrigert for multippel testing (median antall gener forskjellig uttrykt 1731, range 495-2,323) (tabell S3)
Kopier nummer Variasjon
Amplifikasjoner og delesjoner ble påvist ved å identifisere områder hvor det var en delta (+/-) i log2FC (som beskrevet ovenfor) som er større enn 2 standardavvik median log2FC på tvers av armen av kromosom som blir avlest. Delta ble beregnet ved å trekke endepunktene på omtrent 1 MB skyvevinduet. I tillegg til de oppdagede områder som trengs være mindre enn 14 MB i lengde for å bli merket som et samlings hendelse. Tabell S2 inneholder alle brenn hendelser som inneholder COSMIC gener for pasienter 2, 3, 4, 7 og 8. Pasienter 9 og 11 ikke har noen brenn hendelser som inneholdt COSMIC gener. Pasienter 6 og 10 ikke har noen brenn hendelser (se tabell S3 og figur S7)
Prospective Enrichment Analyse
For de siste tre pasienter inkludert, vi utførte berikelse analyse av WGS og /eller exome sekvensering og WTS. Detaljer for den enkelte pasient er som følger:
Pasient 9 adenosquamous karsinom i bukspyttkjertelen
Av de ni pasienter som hadde svulster som ble analysert ved NGS, pasient 9 (adenosquamous bukspyttkjertel kreft) er den eneste personen hvis behandlingen var basert på mål og veier identifisert av NGS. Bare to typer data var tilgjengelige for analyse på denne pasientens vev, enkelt nukleotidvariasjoner (SNV) og WTS. Ingen vesentlige områder av endring ble observert i kopitalldata.
De 20 beste kanoniske kart beriket i WTS data vises i figur S1. Vanlige biologiske mekanismer knyttet til disse topp 20 beriket kart inneholder vedheft, cytoskeletal ombygging og immun /chemotaxis prosesser. Slike anrikninger innebærer en generell aktivering av ekstracellulær matriks remodellering som kan være relatert til fenotype for dette sjelden tumor-typen. To kart av notatet i de tjue sti kart enrichments er spesifikke bukspyttkjertelkreft kart bygget spesielt for å fange prosesser endres i bukspyttkjertelkreft. Disse kartene tittelen, «Tumor-stroma interaksjoner i bukspyttkjertelkreft «og» rolle stel celler i progresjon av kreft i bukspyttkjertelen «, ytterligere markere mulig stromal /ECM samspill innenfor denne svulsten. Den «Role of stel celler i progresjon av kreft i bukspyttkjertelen «kart er vist i Figur S2.
En ytterligere observasjon fra inspeksjon av overliggende WTS data på signaleringskart er det mulig involvering av TGF-beta-mediert epitelial til mesenchymale overgang på denne tumor. The «Utvikling Regulering av epitelial til mesenchymale overgang (EMT) «kart (figur S3), fremhever de WTS data kledde som representeres av termometre ved siden av noder i diagrammet. En rød termometer betyr at genet er overuttrykt og blå betyr at genet underexpressed.
to ligander, TGF-beta 1 og TGF-beta 2 er begge oppregulert sammen med deres kognatreseptoren, TGF-beta-reseptor typen II. Den kombinerte oppregulering av vekstfaktorer /reseptor parene poeng til potensielle betydningen av denne signal par av å være «aktiv» i denne svulsten. Ytterligere bevis knytter TGF beta signale til EMT er markert ved oppregulering av Lef-en, TCF8 og E2A transkripsjonsfaktorer. Disse transkripsjonsfaktorer fungere nedstrøms TGF beta å signalisere for EMT. Ytterligere bevis på deres aktivering er nedregulering av E-cadherin som er et kjennetegn på EMT fenotype. Nærværet av EMT fenotype vil varsle relativ resistens mot mange terapeutiske midler og betegne en metastatisk svulst.
Ytterligere inspeksjon av WTS data avslører overekspresjon av mulige mål for intervensjon. Som nevnt ovenfor, antyder ligand /reseptor-par regulering aktivering og oppregulering av Neuropilin 1 og VEGF-A. Dette kan representere sårbarheter til anti-angiogene terapier. Andre mål som ble oppregulert er ESR1, ABL1, GART, VDR og ErbB2.
Pasient 9 tumor hadde bemerkelsesverdige mutasjoner i KRAS (G12R) og PIK3CA (R93W). Begge disse mutasjonene aktivere system for vekst og spredning. Disse coexistent mutasjoner antyder at kombinerte målretting av MEK /ERK og PI3K /AKT for behandling av denne tumor vil være mer effektiv enn rettet mot bare en av de to mutasjonene. Mens KRAS mutasjon ble godkjent av CLIA testing, regionen inneholder PIK3CA mutasjon var ikke en del av en kommersiell test og dermed ubekreftet henhold CLIA forhold. En annen fremtredende SNV er i genet RAD50 (Q737R), som koder for et protein som er involvert i DNA dobbel tråd pause reparasjon. Defekt funksjon av RAD50 har vært knyttet til sensibilisering til cisplatin og økt følsomhet for PARP-inhibitorer [7].
Pasienten ble først behandlet med cisplatin og gemcitabin og deretter kommet. På den tiden WGS /WTS resultater ble tilgjengelig og pasienten registrert på en fase jeg PI3K hemmer og MEK hemmer kombinasjonsstudie. Pasienten hadde en kortvarig PET /CT svar på undersøkelsen (figur 2), og dette ble også fulgt av en dramatisk reduksjon i sin smerte fra moderat til ingen (4/10 til 0/10 av det visuelle smerteskala).
18-fluorodeoxyglucose positronemisjonstomografi /computertomografi (PET /CT) bilder som viser (A) aksial skive ved baseline og (B) aksial skive etter 30 dager på behandling. Den gule pilen peker på to hypermetabolsk lymfeknuter i B og C. I B, standard opptak (SUV) til venstre lymfeknute er 9.8 og lymfeknute på høyre side er 7,5, mens SUV fra venstre lymfeknute er 3.1 og lymfeknute på høyre side er 3,5 i C.
pasient~~POS=TRUNC 10 metastatisk papillær nyrecellekreft
data for analyse for denne pasient besto bare av SNVs og WTS som ingen kopitall avvik ble identifisert. De 20 beste kanoniske kart avsløre felles temaer rundt cellesyklus, kromosom /spindel funksjon, celle adhesjon, og EMT overgang. En sti av notatet er «Cell syklus spindelenheten og kromosom separasjon» kart (figur S4). En rekke gener involvert med dette kartet er oppregulert i denne svulsten, inkludert druggable målet AURKB (log2ratio = 6,3). Spindelenheten og kromosom separasjon er avgjørende for celledeling med en rekke kreft drug targets forbundet med denne prosessen. To SNVs er også til stede i genene (STAG1 (F802Y) og NUMA1 (L1400P)) i denne veien og foreslå betydningen av disse endringene i denne svulsten.
Andre veier med statistisk signifikans som inneholder viktige observasjoner knyttet til biologien til denne svulsten og til mulige behandlingsalternativer er notert. The «EGF- og HGF avhengig stimulering av metastaser i magekreft «kart avslørte oppregulering av HGF og dens reseptor MET. Dette kartet ble konstruert fra magekreft spesifikk informasjon, men mange kreftformer dele lignende signalveier og molekyler. Å ha både reseptoren og liganden oppregulert antyder en autokrin signalisering mekanisme. Som vist i fig S5, blir a-6 /beta-4-integrin-komponenter oppregulert og funksjon i samspill med MET å aktivere nedstrøms signaltransduksjon. Den mulige involvering av MET er en viktig observasjon som det er i dag et attraktivt onkologi narkotika mål.
Tilleggs inspeksjon av data viste tilstedeværelsen av endringer på RNA nivå av potensielle narkotika mål. Den angiogene signale ligand VEGFA, TOP2A, og bilsportforbund mRNA blir oppregulert. Disse tre gener er mål for dagens kreftmidler. I tillegg MGMT mRNA, noe som er en DNA-reparasjon gen som formidler resistens mot temozolomid, blir nedregulert, noe som tyder temozolomid som en alternativ behandling. Til slutt, har denne svulsten en SNV i genet APTX som koder for et protein som er involvert i DNA-reparasjon som kunne formidle følsomhet for irinotecan [8].
Pasient 11 metastatisk bronkial nevroendokrin kreft
Tre typer av genomisk informasjon som er tilgjengelig for analyse av denne pasientens vev inkludert WTS, CNV (tabell S2), og SNV-data. Bare fire SNVs i to gener, KRT4 og GOLGA6L10, ble identifisert, noe som resulterer i WTS og CNV data kjøring den biologiske fortelling på denne tumor. Figur S6 viser de 20 beste kanoniske sti kart fra anriking analyse av pasient 11 data. Temaene representert ved titlene på disse kartene er ikke så kortfattet som i pasient 10, men igjen, vi observerer cytoskjelettet og lim kart dominerende. Av notatet, er ingen cellesyklus eller kromosom sentriske kart beriket muligens antyder en minimal mitotisk svulst. I form av genet mål, var det flere konkrete overuttrykte gener inkludert KIT, PDGFRB, EGFR, FGFR1 og SPARC. Det bør bemerkes at ingen kopinummervariasjoner ble sett i disse genene.
Diskusjoner
I denne utforskende pilotstudie, bygde vi på vår tidligere erfaring med potensielle molekylære profilering. Siden dette er en ny teknologi, var det forventet og uforutsette utfordringer oppstått i løpet av studien oppførsel. Befolkningen i pasienter evaluert i dette pilot hadde avansert kreft med sykdomsprogresjon og dessverre, for to personer, ble resultatene tilgjengelig etter signifikant klinisk forverring eller død (pasienter 2 og 3). Mens studien pågikk, kostnaden for sekvensefortsatte å synke, og forbedrede verktøy for WTS og integrering av WGS med WTS dukket opp. Dermed WTS ble lagt inn prospektivt fra pasient 7 framover. For pasient 2, WTS var mulig da det var tilgjengelig svulst for RNA ekstraksjon. Tilleggsinformasjonen fra WTS for pasient 2 ble deretter videresendt til behandling av onkolog. Foruten utilstrekkelig svulst DNA (pasienter 1 og 5), teknologien og arbeidsflyten til utvalgets behandling forbedres der vi var i stand til å innlemme exome sekvensering (pasienter 6, 7, 8, 10, og 11) når svulsten innhold andelen var utilstrekkelig fra prøven biopsi . Dette legges til den totale sekvensering og analyse tid for disse pasientene (tabell 1) [9] – [12]. Merk at WGS var den foretrukne modalitet under gjennomføringen av denne studien. WGS gir bedre kopiantall oppløsning, og evnen til å identifisere omleiringer, for eksempel inversjoner som spenner over et enkelt exon fra et tumorsuppressorgen. Med denne type inversjon, er det ingen rammeskifte og tumor suppressor-gen blir uttrykt på normale nivåer. Uten isoformen eller skjøting analyse, vil endringen bli savnet av IHC, fordi det fremdeles er uttrykt på proteinnivået, selv om proteinet er inaktivt på grunn av de manglende aminosyrer [5]. Vi erkjenner at exome sekvensering gir dypere dekning for å identifisere kode mutasjoner. Nyere strategier kan fange det beste av begge WGS og exome sekvensering av blant annet lang sette grunne hele genomer og dyp exome sekvensering for å fange komplekse rearrangements og oppnå en høyere sensitivitet for å fange koding mutasjoner.
En annen utfordring innså etter at studien var pågå var en kjede av varetekt håndtering for ferske biopsiprøver. Fordi de første svulster analyserte ikke gjennomgå DNA /RNA prosessering på en CLIA laboratorium, kan den etterfølgende planlagte validering av mål fra samme frisk prøven ikke verifiseres av en CLIA-sertifisert test. I tillegg omtrentlig 2 uker forsinkelse for CLIA validering kombinert med en median tid på 91 dager for NGS fører til å bli tilgjengelig var problematisk. For pasienten 9 tumor ble KRAS (G12R) mutasjon validert ved hjelp av en CLIA-sertifisert test. For alle bortsett fra en pasient (pasient 2), et potensielt mål druggable med enten en kommersielt tilgjengelig eller eksperimentell behandling ble identifisert. For pasienten 11, gjorde WGS ikke gi et mål, og bare WTS bidratt til å identifisere druggable mål. Integreringen av Epigenomics analyse kunne også faktor som et lag mot tilrettelegging identifisering av druggable mål med eksisterende terapier.
Selv om det ikke er noen tekniske eller logiske forsinkelser i NGS, tolkningen og anvendelsen av denne informasjonen til klinisk praksis er full av usikkerhet. Ikke alle SNVs identifisert ved WGS vil ha en skadelig effekt på proteinfunksjonen. Så bare identifisering av SNVs, selv når validert i en CLIA-sertifisert test, garanterer ikke at målretting det vil føre til stabilisering eller reduksjon i tumorbyrde. Vi må også erkjenne at intratumor heterogenitet og klonal evolusjon kan komplisere vår utviklet behandlingsstrategier for pasienter basert på resultater fra en enkelt svulst biopsi [13], [14].
Under gjennomføringen av denne studien, skjønte vi at med en median tidsramme på 91 dager til å rapportere fra NGS resultater, pasienter med en utmerket allmenntilstand og lav tumorbelastning er mer sannsynlig å ha mål identifisert som kan blir påvirket. Med bedre effektivitet som reduserer tiden for å få NGS resultater og rimelige kostnader, kan vi forestille NGS kan brukes mer globalt til avanserte kreftpasienter. Selv under den relativt korte tiden at denne studien ble melde, observerte vi betydelige forbedringer i sekvense analyser og senket reagenvolumer kostnader. Andre rapporterte nylig ganske imponerende resultater med 27% svarprosent til tilgjengelige målrettet terapi ved hjelp av mer begrenset sekvenseringsteknologi for å identifisere druggable mål [15]. Samlet viser vi muligheten for å utføre NGS teknologier i en potensiell måte i avanserte kreftpasienter. Vi regner med at i ikke fjern fremtid NGS teknologier vil bli lettere tilgjengelig for inkorporering i rutinemessig oppfølging av avanserte kreftpasienter.
Konklusjon
Mens den opprinnelige innsatsen var en langsommere enn forventet prosess på grunn til en rekke problemer, viser vi at NGS kan benyttes i kliniske situasjoner, enten denne tilnærmingen vil føre til reell og konsekvent pasient fordelen er ennå ikke påvist.
Hjelpemiddel Informasjon
fil S1.
Tilleggsopplysninger
doi:. 10,1371 /journal.pone.0076438.s001 plakater (docx)
Figur S1.
Pasient 9 WTS data kanoniske kart. Denne figuren illustrerer de 20 beste kanoniske kart beriket i WTS data for pasient 9.
doi: 10,1371 /journal.pone.0076438.s002 plakater (TIFF)
Figur S2.
rolle stel celler i utviklingen av kreft i bukspyttkjertelen. Denne figuren illustrerer rolle stel celler i bukspyttkjertelen kreft progresjon
doi:. 10,1371 /journal.pone.0076438.s003 plakater (TIFF)
Figur S3.
Utvikling Regulering av epitelial til mesenchymale overgang. Denne figuren illustrerer mulig involvering av TGF-beta mediert epitelial til mesenchymale overgang
doi:. 10,1371 /journal.pone.0076438.s004 plakater (TIFF)
Figur S4.
Valgt kanoniske kartet for Patient 10: Cellesyklus spindelenheten og kromosom separasjon. Denne figuren illustrerer cellesyklus spindelenheten og kromosom separasjon, inkludert oppregulert og druggable målet, aurora-B (AURKB)
doi:. 10,1371 /journal.pone.0076438.s005 plakater (TIFF)
Figur S5 .
