Abstract
β-catenin spiller dobbeltrollen i vedheft kompleks formasjon og Wnt signalveien . Selv om β-catenin ekspresjon synes å være oppregulert og Wnt signalveien aktiveres i de fleste kreftformer, synes dens ekspresjon nivå for å gå tapt i ikke-småcellet lungekreft (NSCLC). Vi har tidligere rapportert at arrangøren av β-catenin ble hypermethylated i to NSCLC cellelinjer. I denne studien, utvidet vi vår analyse for metylering status av β-catenin promoter-regionen og dens protein ekspresjon i syv NSCLC-cellelinjer, og en serie av 143 tilfeller av primær human lungekreft med tilstøtende ikke-neoplastiske vev. Kvantitativ metylering spesifikk PCR (qMSP) analyse viste metylering av β-catenin promoter-regionen i fem NSCLC-cellelinjer, med økte β-catenin proteinnivåer ved 5′-aza-2′-deoksycytidin (5-aza-dC) behandling. Metyleringen status i SPC (denaturert) og A549 (unmethylated) ble bekreftet ved sekvensering av PCR-bisulfitt. 5-Aza-dC behandling hemmet invasivitet av SPC men ikke A549. Immunofluorescens-analyse viste membranøs β-catenin ekspresjon var tapt i SPC og kan bli reetablert av 5-aza-dC, mens Wnt3a behandling førte til nukleær translokasjon av β-catenin i både SPC og A549. Dual-luciferase-analyser indikerte at 5-aza-dC behandling forårsaket ingen vesentlig økning i Wnt signal aktivitet sammenlignet med Wnt3a behandling. Effekten av demetylering agent i SPC kan reverseres ved β-catenin uttømming men ikke E-cadherin uttømming som indikerte at metylering mediert β-catenin stanse kan forbedre NSCLC invasjon og metastasering i en E-cadherin uavhengig måte. Påfølgende immunhistokjemi resultatene ytterligere bekreftet at β-catenin promoter hypermethylation korrelert med tap av immunreaktivt protein uttrykk, positiv lymfeknutemetastase, høy TNM stadium og dårlig prognose. Den foreliggende studien impliserer β-catenin promoteren hypermethylation i mekanismen for epigenetiske endringer liggende NSCLC metastase og progresjon, således indikerer potensialet i β-catenin som en ny epigenetisk mål for behandling av NSCLC
Citation:. Miao Y, Wang L, Zhang X, Xu X, Jiang G, Vifte C, et al. (2014) Arrangøren Metylering-mediert stanse av β-catenin Forbedrer Invasivitet av ikke-småcellet lungekreft og Spår alvorlig prognose. PLoS ONE 9 (11): e112258. doi: 10,1371 /journal.pone.0112258
Redaktør: Pier Giorgio Petronini, Universitetet i Parma, Italia
mottatt: 17 april 2014; Godkjent: 09.10.2014; Publisert: 14.11.2014
Copyright: © 2014 Miao et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle relevante data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra Natural Science Foundation of China (No. 81000942 til Yuan Miao og nr 30900562 til Yang Liu) Nasjonal . Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Lungekreft er fortsatt en stor klinisk utfordring på grunn av sine dårlig prognose og begrenset behandlingstilbud [1]. Den høye dødeligheten av lungekreft skyldes i hovedsak svikt i tidlig diagnose og metastase ofte observert ved diagnosetidspunktet [2]. Analyse av biologiske endringer liggende patogenesen av malignitet, identifikasjon i de tidlige stadiene, og forebygging av metastaser, derfor kan være den primære alternativer for å forbedre den generelle dystre prognosen for denne kreftformen.
Tumor invasjon og metastaser oppstår når tumorceller få muligheten til å koble fra den primære svulsten og inngå omliggende vev eller lymphovascular kanaler, en prosess som er kritisk avhengig av avbrudd av vedheft overgangene mellom kreftceller [3]. β-catenin er spesielt interessant i denne prosessen siden det ikke bare deltar i denne adhesjon komplekset, men også en integrert del av Wnt signalveien [4] – [6]. Et stort flertall av krefttyper, inkludert kolorektal, hepatocellulær, skjoldbruskkjertelen, og eggstokk-kreft, havn β-catenin mutasjoner og endringer i andre gener, så som APC-genet, noe som fører til kjerne opphopning av β-catenin og aktivering av Wnt signalveien [ ,,,0],4], [7], [8]. Indikerer imidlertid bevis for at atom ekspresjon av β-catenin er sjelden og Wnt signal aktivitet er nedregulert i lungekreft [5], [9] – [11]. Et økende antall studier har beskrevet og analysert sammenhengen mellom tap av β-catenin uttrykk og clinicopathological parametere i lungekreftpasienter [9], [11]. Likevel, de underliggende mekanismene er fortsatt kontroversielt. En fersk rapport viste at nivået av β-catenin protein ikke ble påvirket av E-cadherin uttømming [12]. Derfor må det være andre mekanismer ansvarlig for downregulated β-catenin uttrykk i NSCLC.
Aberrant arrangøren metylering kan føre genet Slå i forskjellige ondartede svulster blant annet lungekreft [13], [14]. Selv om Wnt signal ble aktivert og β-catenin uttrykk ble oppregulert i primærmagekreft, Ebert
et al.
Viste at arrangøren av β-catenin ble hypermethylated som førte til tap av β-catenin uttrykk i cellen linjen stammer fra levermetastaser av magekreft, men ikke de primære kreft [15]. Tatt sammen, spekulert vi at metylering av β-catenin torer kan spille en rolle i regulering av invasivitet av kreftceller. Vår nyeste rapport fant at hypermethylation av β-catenin arrangører ble sett i to primære NSCLC cellelinjer, som skilte seg fra den i magekreft [16]. Siden virksomheten i Wnt signalveien var lavere i NSCLC enn det som i andre kreftformer, vi hypotese at hypermethylation av β-catenin arrangører i NSCLC kan forklare den høye metastase frekvens og dårlig prognose hos NSCLC pasienter.
Her vi studerte effekten av β-catenin promoter metylering statuson tumorprogresjon og invasjon, ved å utnytte både lungekreftcellelinjer og pasientprøver som våre eksperimentelle modeller.
Materialer og metoder
Menneskelig vevsprøver og cellelinjer
Denne studien ble gjennomført med godkjenning av Institutional Review board i Kina Medical University (Shenyang, Kina). Skriftlig samtykke ble gitt av deltakerne for informasjon som skal lagres i sykehus database for de prøver som skal anvendes i denne studien. All klinisk undersøkelse har blitt gjennomført i henhold til de prinsipper som er nedfelt i Helsinkideklarasjonen. Ett hundre og førti-tre tilfeller av primær menneskelig lungekreft med tilsvarende tilstøtende ikke-neoplastiske vev som gjennomgikk kirurgisk reseksjon med kurativ hensikt, ble samlet inn fra First Affiliated Hospital of China Medical University mellom oktober 2004 og juli 2006. Pasient overlevelse ble definert som tiden fra operasjonsdagen til slutten av oppfølging eller dødsdagen på grunn av tilbakefall eller metastasering. Ingen av pasientene, radioterapi eller kjemoterapi før kirurgisk reseksjon, og alle pasienter fikk rutine kjemoterapi etter operasjonen. Studien pasientpopulasjonen har blitt rapportert i forrige litteraturen [17]. Den histologiske diagnose og differensiering grad ble vurdert i hematoxylin og eosin fargete snitt, i henhold til de 2004 retningslinjer WHO-klassifisering [18]. Alle 143 prøver ble vurdert på nytt med hensyn til histologisk subtype, differensiering, og tumorstadium. Tumor iscenesettelse ble bestemt i henhold til den syvende utgaven av International Union mot Kreft (UICC) TNM Staging System for lungekreft [19]. Prøvene inkludert 44 tilfeller av plateepitelkarsinom lungekreft og 99 tilfeller av lunge adenokarsinom. Femtien svulster ble svært differensiert og 92 svulster ble moderat eller dårlig differensiert. Lymfeknutemetastaser var til stede i 70 tilfeller og fraværende i 73 tilfeller. Svulstene inkludert 81 tilfeller av stadium I-II sykdom og 62 tilfeller av stadium III
A-III
B-sykdom.
Seven NSCLC cellelinjer, som vanligvis brukes i vår lab, ble valgt for cellen eksperimenter. De HBE, A549 og H1299 cellelinjer ble oppnådd fra American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). PG-BE1 (BE1), PG-LH7 (LH7), SPC-A-1 (SPC), og LTEP-A-2 (LTE) cellelinjer ble hentet fra Shanghai Cell Bank (Shanghai, Kina). Alle celler ble dyrket i RPMI 1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) inneholdende 10% føtalt kalveserum (Invitrogen), 100 IU /ml penicillin (Sigma, St. Louis, MO, USA), og 100 ug /ml streptomycin ( Sigma). Cellene ble dyrket i sterile kulturskåler og passert hver 2 dager ved bruk av 0,25% trypsin (Invitrogen).
DNA ekstraksjon og kvantitativ sanntids metylering-spesifikke polymerase-kjedereaksjon
Genomisk DNA ble ekstrahert fra cellelinjer og 10-um tykke seksjoner av 10% nøytral formalinfikserte, parafininnstøpte tumorvev blokker ved hjelp av QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, Hilden, Tyskland). Genomisk DNA ble behandlet med natriumbisulfitt å bruke en EZ DNA metylering kit (D5005, Zymo Research, Orange, CA, USA). Metylering-spesifikk sanntids-polymerase kjedereaksjon (PCR) ble utført på ABI 7900HT Fast real-time PCR-system (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Primerpar var som følger: β-catenin fremover, 5′-GGAAAGGCGCGTCGAGT-3 «og omvendt, 5′-TCCCCTATCCCAAACCCG-3′, med den TaqMan probe 5»-6FAM- CGCGCGTTTCCCGAACCG-TAMRA-3 «; p-aktin fremover, 5»-TGGTGATGGAGGAGGTTTAGTAAGT-3 «og omvendt, 5′-AACCAATAAAACCTACTCCTCCCTTAA-3′, med den TaqMan probe 5»-6FAM-ACCACCACCCAACACACAATAACAAACACA-TAMRA-3 «. Housekeeping β-aktin-genet (ACTB) ble brukt til å normalisere en metylering uavhengig kontroll reaksjon. For relativ kvantifisering, ble mengder av det metylerte DNA (prosentandel av metylert referanse) ved en β-catenin promoterregionen normalisert til den metylering verdien av kalibratoren, som ble definert som 100%. Universal metylert DNA (Qiagen) ble brukt som kalibratoren. Prosentandelen av metylert referanse ble definert som 100 x 2
(sampleACTB (ct) – sampleβ-catenin (ct)) /2
(calibratorACTB (ct) – calibratorβ-catenin (ct)) [20]. For å skille mellom de enkelte metylering nivåer, ble en cut-off verdi på 4% eller mer definert som «denaturert» og en cutoff-verdi på mindre enn 4% som «unmethylated» basert på en tidligere studie [21].
Bisulfite sekvensering PCR (BSP) av β-catenin arrangører
Vi brukte Methyl Primer Express v1.0 programvare (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) for å analysere
CTNNB1
genet promoter-regionen -1,124-11,114 bp. DNA fra lungecancerceller ble ekstrahert, og deretter behandlet med natriumbisulfitt ved hjelp av en EZ DNA-metylering kit (Zymo Research) i henhold til produsentens instruksjoner. De β-catenin promoter-spesifikke primere for bisulfite sekvensering ble bygget ved hjelp av arrangøren sekvensdata og primer design software (Primer Premier 5; Premier Biosoft International, Palo Alto, CA, USA); primersekvensene er vist i tabell 1. Primerne ble konstruert for å amplifisere et CpG-rikt område av promoteren som strekker seg over 189 CpG sider (19 CpGCpG sider). PCR-produktene ble renset ved hjelp av multifunksjonelle DNA rensing utvinning kit (DP1501, BioTeke Corporation, Beijing, Kina) og ligert inn i PUM-T enkel vektor (DP6803, BioTeke Corporation, Beijing, Kina), og minst fem forskjellige kloner hver var valgt for sekvensanalyse av BIQ Analyzer.
Behandling med 5-aza-dC og Wnt3a
Kultiverte lungekreft celler ble behandlet med ulike konsentrasjoner av 5-aza-2′-deoxycytidine (5-aza-dC) (Sigma) oppløst i kulturmedium hver 24. time. Ved hjelp av q-MSP og MTT-analyser, ble den legemiddelkonsentrasjon som er nødvendig for β-catenin promoteren CpG øy demetylering med ingen signifikant effekt på cellevekst valgt (7 uM), og cellene ble oppsamlet ved fortsatt dyrking i 48 timer (Figur S1).
Celler ble behandlet med 500 ng /ml rekombinant Wnt3a (R D Systems, Minneapolis, Minnesota, USA).. for 48 timer
Små interfering RNA behandling
Cellelinjer linjer~~POS=HEADCOMP var sådd ut i seks-brønns plater med ferskt medium uten antibiotika for 24 timer før transfeksjon. Cellene ble transfektert med β-catenin siRNA (sc-29209, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), E-cadherin siRNA (sc-35242, Santa Cruz) og kontroll siRNA (sc-37007, Santa Cruz Biotechnology), bruker Lipofectamine-2000 (Invitrogen) i henhold til produsentens anvisninger. Alle sirnas var sammensatt av en pool av to target-spesifikke 19-25 nt sirnas, ble cellene høstet 48 timer etter transfeksjon.
Western blot analyse.
Totalt protein fra celler ble ekstrahert i lyseringsbuffer (Pierce) og kvantifisert ved anvendelse av Bradford-metoden. Deretter ble proteiner (50 ug) separert ved SDS-PAGE (12%) og overført til polyvinylidendifluorid (PVDF) membran (Millipore, Billerica, MA, USA). Deretter ble membranene inkubert over natten ved 4 ° C med monoklonale antistoffer mot E-cadherin (SC-8426, 1: 200, Santa Cruz Biotechnology), β-catenin (610 154, 1: 500; BD Transduction Laboratories, Lexington, KY, USA ) eller GAPDH (sc-365062, 1: 500, Santa Cruz Biotechnology). Etter inkubering med peroksidase-koblet anti-mus IgG (Santa Cruz Biotechnology) ved 37 ° C i 2 timer, ble bundne proteiner visualisert ved bruk av ECL (Pierce) og påvist ved å bruke Bioimaging Systems (UVP Inc., Upland, CA, USA). De relative proteinnivåer ble beregnet på grunnlag av GAPDH-protein som en lasting kontroll.
Matrigel invasjon assay.
Cell invasjons analyser ble utført ved anvendelse av en 24-brønners transwell kammer med en porestørrelse på 8 um (Corning Costar Transwell, Cambridge, MA, USA), og innsatsene ble belagt med 20 ul Matrigel (1:03 fortynning, BD Biosciences). Deretter, 48 timer etter transfeksjon ble cellene trypsinert og overført til det øvre kammer Matrigel i 100 ul serumfritt medium inneholdende 3 x 10
5-celler og inkubert i 16 timer. Medium supplert med 10% FBS ble tilsatt til det nedre kammer som kjemotiltrekkende. Antallet invaderende celler ble talt i 10 tilfeldig utvalgte kraftige mikroskop felt. Forsøkene ble utført in triplo.
Immunofluorescent farging.
Cellene ble fiksert med 4% para-formaldehyd, blokkert med 1% BSA og deretter inkubert med β-catenin monoklonalt antistoff (610 154, 1 : 400; BD Transduction Laboratories) over natten ved 4 ° C, etterfulgt av inkubasjon med fluorescein (FITC) konjugerte sekundære antistoffer (1: 200, Zhongshan Golden Bridge, Beijing, Kina) ved 37 ° C. Kjernene ble kontra med 4 «, 6-diamidino-2-fenylindol (DAPI). Epifluorescent mikroskopi ble utført ved hjelp av en invertert Nikon TE300 mikroskop (Melville, NY, USA) og konfokalmikroskopi ble utført ved hjelp av en Radiance 2000 laser scanning confocal mikroskop (Carl Zeiss, Thornwood, NY, USA).
Dual-luciferase analyser.
transfections ble utført ved hjelp Lipofectamine 2000 (Invitrogen) i henhold til produsentens instruksjoner. Celler ble sådd ut i 24-brønners plater i 24 timer før transfeksjon med pGL3-OT eller pGL3-OF (0,5 mg) reporter gene plasmider, sammen med kontroll plasmid PRL-TK (50 ng). Etter inkubering i 30 timer ved 37 ° C, ble reportergenekspresjon detektert av den dual-Luciferase Assay System (Promega, Madison, WI, USA). TCF-mediert gentranskripsjon aktivitet ble bestemt ved forholdet av pGL3-OT til pGL3-OF luciferaseaktivitet, som var normalisert til Renilla luciferaseaktivitet fra kontroll plasmid PRL-TK. Alle forsøkene ble utført i to eksemplarer, minst tre ganger. For å analysere effekten av 5-aza-DC og β-catenin siRNA på Wnt signal ble 5-aza-dC lagt og β-catenin siRNA var co-transfektert med pGL3-OT eller pGL3-OF for luciferase analyser.
Immunhistokjemi (IHC)
Immunhistokjemisk analyse av β-catenin ekspresjon ble utført ved anvendelse av en β-catenin-spesifikt monoklonalt antistoff (610 154, 1: 200; BD Transduction Laboratories) som beskrevet tidligere, og ble evaluert i henhold til vår forrige rapport [17], [22].
Statistisk analyse.
SPSS versjon 13.0 for Windows (SPSS Inc., Chicago, IL, USA) ble brukt for alle analyser. Chi-kvadrat og Spearmans korrelasjonstester ble brukt for å undersøke mulige sammenhenger av β-catenin metylering status i NSCLC med sin metylering status i tilstøtende normalt lungevev og clinicopathologic faktorer. Mann-Whitney U-test ble brukt til å analysere resultatene av q-MSP, Western blot, Matrigel invasive analyser og Dual-luciferase analyser. Kaplan-Meier metoden ble brukt for å anslå sannsynligheten for pasientens overlevelse, og forskjeller i overlevelse av undergrupper av pasienter ble sammenliknet med Mantel er log-rank test. Resultatene ble angitt som gjennomsnittet av eksperimenter utført i tre eksemplarer.
P
. 0,05 ble ansett for å indikere statistisk signifikante forskjeller
Resultater
Analyse av metylering status for promoter-regionen til β-catenin genet i lungekreftceller
β-catenin promoter metylering nivåer ble testet i lunge kreft cellelinjer. Som vist i figur 1 A, fem cellelinjer (LH7, BE1, SPC, LTE og H1299) utviste høye nivåer av metylering, mens to cellelinjer (HBE og A549) ble unmethylated. Analyse av CTNNB1 gen-promotorområdet -1124 – 11 114 bp i NSCLC-cellelinjer viste nærvær av to CpG øyer i posisjonene -1,124 – 876 og 10,676 – 11 114, henholdsvis. Disse sekvensene inneholdt 189 enkelt CG nettsteder, 19 av disse var CG-dinukleotider. Ved hjelp av natriumbisulfitt genomisk sekvenseringsmetode, har vi utviklet primere for å analysere de første CpG øyer i et 1331 basepar region (-614-717) inneholdende en del av β-catenin promoter region på tvers av den transkripsjonelle startsete i SPC og A549 cellelinjer . Flere metylering områder ble identifisert i SPC-celler, mens bare noen få 5-metylcytosin residuer ble observert i flere sekvenserte kloner avledet fra A549-celler (Fig. 1B og 1C).
(A) Kvantitativ analyse av MSP β -catenin promoter region i NSCLC-cellelinjer. (B) Arrangøren region av β-catenin genet: Plassering av CpG øyer og grunning design er indikert med linjer og piler. (C) Metylering av en av de 19 CG-dinukleotider i området -614 bp til -270 bp av både A549 og SPC. Fylte sirklene representerer denaturert CG nettsider, ubesatte sirkler representerer unmethylated CG nettsider.
Behandling av cellene med 5-aza-dC restaurert β-catenin uttrykk og hemmet lungekreft celle invasivitet gjennom re-etablere membran β-catenin ekspresjon i stedet for ved aktivering av Wnt signalveien
den kjemiske 5-aza-dC er blitt brukt både in vitro og in vivo, for å inhibere DNA-metylering. I denne studien ble alle syv cellelinjer (HBE, LH7, BE1, SPC, A549, LTE og H1299) behandlet med 5-aza-DC (Fig. 2A, 2B). Uttrykk for β-catenin ble restaurert i de fem cellelinjer (LH7, BE1, SPC, LTE og H1299) hvor β-catenin promoter metylering hadde blitt bekreftet tidligere. Det ble imidlertid ikke vesentlige endringer sett i HBE og A549-cellelinjer (unmethylated). Vi undersøkte videre effekten av 5-aza-dC behandling på invasjonen kapasiteten av lungecellelinjer. Som vist i figur 2C og 2D, 5-aza-dC behandlingen resulterte i markert hemming av invasivitet i SPC-celler, mens det var ingen målbar effekt på A549-celler (se fig S2 for Matrigel resultater på andre cellelinjer). Deretter ble evnen av 5-aza-dC for å aktivere Wnt signalveien undersøkt ved anvendelse av Wnt3a protein-simulert celler som en positiv kontroll. Sammenlignet med Wnt3a-behandlede celler, dual-luciferase analysene viste at 5-aza-dC behandling gav ingen vesentlige endringer i Wnt signal aktiviteter (Fig. 2E). Immunofluorescens-analyse viste at behandling med 5-aza-dC gjenopprettet membranøs β-catenin ekspresjon i SPC, men ikke A549-celler. Videre ble β-catenin ekspresjon detektert i kjernen i Wnt3a-behandlede celler, mens, ble en membran fordeling observert i ubehandlede celler (fig. 2F). Samlet utgjør disse resultatene at det, i motsetning til i andre karsinomer, metylering av β-catenin arrangøren var et vanlig fenomen i NSCLC, og kan være ansvarlig for nedregulering av β-catenin uttrykk styrke invasivitet av lungekreft celle.
(A) Protein nivåer av β-catenin etter 5-aza-dC behandling (7 uM) i NSCLC-cellelinjer. (B) Kvantifisering av proteinekspresjon etter 5-aza-dC behandling. (C) Representative bilder av celler på bunnen av Transwell membranene viser endringene i invasive celletall (x 400, Skala bar = 50 um). (D) Antall celler som invaderer på den nedre overflate av filteret ble tellet, hver foretatt i triplikat. (Søylene representerer SD *
P
. 0,05, sammenlignet med kontrollgruppen). (E) Dual-luciferase analyseresultatene viser at 5-aza-dC behandling gav ingen vesentlige endringer i Wnt signale aktiviteter sammenlignet med Wnt3a behandlede celler. Hvert av forsøkene ble gjentatt i triplikat. (D) Immunofluorescent farging som viser at β-catenin er primært lokalisert på membranen i SPC og A549 cellelinjer. Behandling med 5-aza-dC forandret mengder av membran β-catenin uttrykk. Imidlertid β-catenin ble translokert til kjernen følgende Wnt3a behandling (Skala bar = 20 um, β-catenin antistoff ble erstattet med normal mus IgG som en negativ kontroll).
5-Aza-dC behandling gjenopprettet β-catenin ekspresjon i en E-cadherin uavhengig måte
for ytterligere å bekrefte funksjonen til promoteren metylering av β-catenin, ble β-catenin-spesifikk siRNA innføres i SPC og A549-celler. Sammenlignet med celler transfektert med kontroll egge siRNA, celler transfektert med β-catenin siRNA oppviste redusert β-catenin og E-cadherin uttrykk, som ikke kan gjenopprettes ved 5-aza-dC behandling (Fig. 3A, B). Neste, vi slått ned E-cadherin med E-cadherin-spesifikke siRNA i disse to cellelinjer. E-cadherin ekspresjon ble redusert i begge SPC og A549-celler, mens β-catenin ekspresjon ikke var synlig redusert med E-cadherin uttømming sammenlignet med kontrollen. Med 5-aza-dC behandling, ble β-catenin ekspresjon signifikant oppregulert i SPC-celler, uavhengig ekspresjon av E-cadherin (fig. 3C, D). Vi undersøkte videre effekten av 5-aza-dC behandling når det innføres med β-catenin-siRNA og E-cadherin-siRNA på invasjonen kapasiteten av lungecellelinjer. Som vist i figurene 3E og 3F, enten β-catenin eller E-cadherin uttømming førte til en betydelig økning i invasiv kapasiteten til både SPC og A549-celler. Av 5-aza-dC behandling, ble antallet av de trekkende cellene betydelig redusert i E-cadherin-utarmet SPC-celler som ikke ble observert i A549-celler. Men invasive kapasitet β-catenin-utarmet SPC og A549 cellene ble ikke åpenbart hemmet av fem-aza-dC behandling. Videre dual-luciferase analyser avdekket at verken 5-aza-dC behandling eller β-catenin-uttømming resultert i store endringer i Wnt signale aktiviteter sammenlignet med Wnt3a-behandlede celler (Fig. 3G). Følgelig, inhibering av β-catenin ekspresjon av dets promoter metylering synes å downregulating invasivitet av lungekreft celle i en E-cadherin uavhengig måte. Immunofluorescerende farging viste at membran β-catenin forsterkes av 5-aza-dC behandling bare i SPC-cellelinje, men ikke i A549-cellelinjen. Uttømming av β-catenin demper membranøs β-catenin i begge SPC og A549 cellelinjer, men reduksjon av E-cadherin har ingen effekt på membranøs ekspresjon av β-catenin i enten SPC eller A549 cellelinje. Behandling med 5-aza-dC litt forandret mengdene av membran β-catenin uttrykk etter β-catenin eller E-cadherin uttømming i SPC cellelinje, men ikke i A549-cellelinjen.
Etter knockdown av β-catenin ( A) eller E-cadherin (C), protein ekspresjon av SPC og A549 cellelinjer ble undersøkt 48 timer etter 5-aza-dC behandling ved hjelp av de angitte antistoffer. (B, D) Grafer viser kvantifisering av protein uttrykk etter 5-aza-dC behandling og siRNA transfeksjon. GAPDH ble anvendt som en kontroll. (E) Representative bilder av celler på bunnen av Transwell membranene viser endringene i invasive celletall (x 400, Skala bar = 50 um). (F) Antall celler som invaderer på den nedre overflate av filteret ble tellet, hver foretatt i triplikat. (Søylene representerer SD *
P
. 0,05, sammenlignet med kontrollgruppen). (G) Dual-luciferase analyseresultatene viser at både 5-aza-dC behandling og β-catenin uttømming gav ingen vesentlige endringer i Wnt signale aktiviteter sammenlignet med Wnt3a behandlede celler. Hvert av forsøkene ble gjentatt i triplikat. (H) Immunofluorescent farging som viser at membran β-catenin forsterkes av 5-aza-dC behandling bare i SPC-cellelinje, men ikke i A549-cellelinjen. Uttømming av β-catenin demper membranøs β-catenin i begge SPC og A549 cellelinjer, men reduksjon av E-cadherin har ingen effekt på membranøs ekspresjon av β-catenin i enten SPC eller A549 cellelinje. Behandling med 5-aza-dC litt forandret mengdene av membran β-catenin ekspresjon etter β-catenin eller E-cadherin uttømming i SPC-cellelinje, men ikke i A549-cellelinjen. (Skala bar = 20 um, ble β-catenin antistoff erstattet med normal mus IgG som en negativ kontroll).
Hypermethylation av β-catenin promotor korrelert med sin tap av membranøs ekspresjon i NSCLC prøven
Vi neste undersøkte metylering status for β-catenin promoter i kliniske vevsprøver. p-catenin ble uttrykt overveiende på cellemembranen i normal lunge vevsprøver (83,9%, 120/143, Fig. 4A), med redusert membranøs ekspresjon i NSCLC-vev (18,9%, 27/143, Fig. 4B, C). Deretter ble β-catenin promoter-metylering nivåer kvantifisert ved sanntids-metylering-spesifikk PCR. Ved hjelp av en hypermethylation verdi som er større enn 4% som en cutoff, hypermethylation av β-catenin (gjennomsnitt ± SD, 8,60% ± 11,41%; rekkevidde, 0-100%) ble funnet i 74 (51,7%) av de 143 NSCLC prøver, som var betydelig høyere enn i tilstøtende normalt lungevev (13,3%, 19/143, middelverdi ± SA, 2,66% ± 2,63%; rekkevidde, 0-100%;
P
0,001, fig. 4D ). Til sammen vår studie antydet at β-catenin metylering signifikant korrelert med tap av membran β-catenin uttrykk (
P
= 0,001).
(A) β-catenin uttrykk i normal lungeepitelet med sterk membran flekker. Membran β-catenin uttrykk ble tapt i lunge plateepitelkarsinom (B) og lunge adenokarsinom (C). Scale bar = 20 mikrometer. (D) Kvantitative metylering resultatene av q-MSP. Data representerer middelverdi ± SD. Mann-Whitney U-test ble benyttet for å bestemme den statistiske signifikans. **
P
0,001. (E) Overlevelseskurver av pasienter med eller uten β-catenin promoter metylering. Mantel er log-rank test ble benyttet for å bestemme statistisk signifikans.
Korrelasjonen mellom β-catenin promoter metylering og clinicopathological faktorer
Kliniske og patologisk karakteristikk av pasienter med NSCLC ble analysert i henhold til deres metylering status. Som vist i tabell 2, β-catenin hypermethylation positivt korrelert med lymfeknutemetastase og TNM stadium i de 143 tilfeller av NSCLC (
P
= 0.001 og
P
= 0,046, respektivt). Det var ingen signifikant sammenheng mellom β-catenin metylering og kjønn, alder, histologisk type eller differensiering i NSCLC. Kaplan-Meier test viste at den totale overlevelsestiden av NSCLC var kortere hos pasienter med β-catenin-metylert svulster enn i de med β-catenin-unmethylated tumorer (
P
0,001, fig. 4E).
Diskusjoner
β-catenin, som en viktig del av både adherens veikryss og Wnt signalveien, ble antatt å være translocated til kjernen av sin ekson mutasjon og /eller APC mutasjon i forskjellige tumortype bortsett fra lungekreft [4], [7], [8]. Imidlertid akkumulerte bevis indikerer at, i den lungekreft, er β-catenin tapt og Wnt signal aktivitet er nedregulert. Den underliggende mekanisme forblir unelucidated [5], [9] – [11]. Vår nyeste studie fant at arrangøren av β-catenin genet ble alltid metylert i lungekreftcellelinjer [16]. For å avklare funksjonene til β-catenin i NSCLC, utvidet vi vår undersøkelse av arrangøren metylering status på sju kreftcellelungelinjer. Vi fant at demetyleringen midlet 5-aza-dC gjenopprettet β-catenin proteinnivåer i fem av syv cellelinjer som var blitt bekreftet å være metylert i denne studien. Blant disse, ble metylering status av SPC og A549 ytterligere bekreftet ved bisulfitt genomisk sekvensering. Det er vel anerkjent at oppføringen av β-catenin til kjernen kunne forbedre Wnt signaleringsaktivitet, og dermed fremme den invasivitet av flere humane kreftformer. Imidlertid β-catenin ekspresjon var tapt i fjerne metastaser av gastrisk karsinom og tap av β-catenin ekspresjon kan skyldes hypermethylation av β-catenin promoteren, til tross for at β-catenin ekspresjon ble oppregulert og Wnt signalveien ble aktivert i de fleste av de primære magekreft [15]. Vi har spekulert at tap av β-catenin som kan utløse andre signalkaskade (r) sterkere enn Wnt signaleringsaktivering ved styring av invasivitet av kreftceller. Siden lungekreft viser lavere baseline av Wnt signal aktivitet enn magekreft, kan den viktigste mekanismen i å regulere invasivitet være uavhengig av Wnt signalveien. aktivering av Wnt signalveien, invasjonen kapasitet, og den subcelluar fordeling av β-catenin i lunge cellelinjer. Resultatene indikerte at demetylering av 5-aza-dC kunne gjenopprettes β-catenin ekspresjon og inhiberte lungecancercelle invasivitet ved å reetablere membranøs β-catenin ekspresjon, i stedet for ved aktivering av Wnt signalveien. Denne studien tilbudt en ny forklaring på hvorfor β-catenin uttrykk ble nedregulert i NSCLC og indikerte at arrangøren metylering av β-catenin kan regulere invasivitet gjennom en vei uavhengig av Wnt signal i lungekreftceller. Som catenins sammen med cadherins og dannet adherens veikryss, våre resultater viste at tap av β-catenin uttrykk kan ødelegge adherens veikryss ved sin redusert membran uttrykk.
E-cadherin spiller en avgjørende rolle i adherens veikryss. Gjennom sin intracellulære domenet ble E-cadherin forbundet med β-catenin. Selv om metylering av E-cadherin-genet metylering ble funnet i forskjellige kreftformer, er det fortsatt kontroversielt som for i det lungekreft [23] – [25]. Russo
et al
.
