Abstract
Bakgrunn
Kreft i bukspyttkjertelen er en av de dødeligste kreft med en 5-års overlevelse på 6%. Behandlingsalternativer er svært begrenset, og det er et udekket medisinsk behov for sikre og effektive behandlinger. Kreft celle metabolisme og mitokondrier gi uutforskede mål for denne sykdommen. Vi har nylig identifisert en ny klasse triphenylphosphonium salter, TP forbindelser, med eter spekteret kreft egenskaper. Vi undersøkte evnen til vår proto sammensatte TP421- valgt for sine fluoriserende egenskaper -. Å hemme veksten av kreft i bukspyttkjertelen celler og videre undersøkt de molekylære mekanismer som det utøver sin kreft effekter
Metodikk /hovedfunnene
TP421 utstilt sub-mikromolar IC
50 verdier i alle pancreatic kreft cellelinjer testet ved hjelp av MTT og kolonidannelse analyser. TP421 lokalisert hovedsakelig til mitokondriene og indusert G
0 /G
1 arrest, ROS akkumulering, og aktivering av flere stress regulert kinaser. Caspase og PARP-1 cleavage ble observert indikerer en apoptotisk respons mens LC3B-II og p62 ble samlet indikerer hemming av autofagi. Videre TP421 indusert de-fosforylering av viktige signalmolekyler involvert i FAK mediert adhesjon som korrelerte med hemming av cellemigrasjon.
Konklusjon /Betydning
TP421 er en representativ forbindelse av en ny lovende klasse mitokondrie-målrettede midler som er nyttige for kreft i bukspyttkjertelen behandling. På grunn av sin unike virkningsmekanisme og effekt videreutvikling er hjemlet
Citation. Shabaik YH, Millard M, Neamati N (2013) mekanistisk Evaluering av nye små molekyl Targeting Mitokondrier i kreft i bukspyttkjertelen celler. PLoS ONE 8 (1): e54346. doi: 10,1371 /journal.pone.0054346
Redaktør: Aamir Ahmad, Wayne State University School of Medicine, USA
mottatt: 12 juli 2012; Akseptert: 12. desember 2012; Publisert: 21 januar 2013
Copyright: © 2013 Shabaik et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet delvis av midler fra congressionally Directed Medical Research Program Breast Cancer Concept Award og Sharon og William Cockrell Velsignet Cancer Research Fund. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
kreft i bukspyttkjertelen er den fjerde største årsaken til kreft dødsfall i USA med en samlet 5-års overlevelse på 6% [1]. Siden 2005 er standard kjemoterapeutiske behandling administrasjon av gemcitabin, en nukleosid analog, kombinert med erlotinib, en kinase inhibitor [2], [3]. Gemcitabin rettet ribonukleotidreduktase forårsaker nedbryting av dNTP og videre blir inkorporert i DNA forårsaker en stall i syntese [4]. På den annen side erlotinib, opprinnelig tenkt å målrette mot epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR), har nylig blitt dokumentert å være en multi-kinase-inhibitor [5]. Den veien for gemcitabin-aktivitet er tilstrekkelig komplisert, blant annet opptakstransportører og intracellulær fosforylering fører til cytotoksisitet, noe som bidrar til den lave frekvensen lav hastighet på respons hos pasienter og den økende utvikling av chemoresistance [6]. Det er nylig blitt foreslått at PDAC lagdeling i flere undertyper basert på molekylære forskjeller kan bestemme respons på kjemoterapi [7]. To av de tre definerte undergrupper er representert blant de mest brukte bukspyttkjertelkreft cellelinjer, inkludert MIA PACA-2, PANC-en og VVS som vi benyttet i vår studie.
Blant de tidligste molekylære endringer underliggende kreft i bukspyttkjertelen er et konstitutivt aktiverende K-ras-mutasjon som forekommer i nesten 100% av tilfellene [8], [9]. Under transformasjon, K-ras signaliserer stasjoner dreven celleproliferasjon og fremmer overlevelse. Det har blitt foreslått at mitokondrienes energiproduksjon er viktig å støtte Ras-transformerte celler som blir sterkt avhengig av autofagi, en tilstand kalt «autofagi avhengighet», for å opprettholde en sunn pool av mitokondrier og tilstrekkelig TCA syklus mellom å støtte oksidativ fosforylering ( OXPHOS) [10], [11]. Spesielt, i bukspyttkjertelcancercellelinjer og pasientprøver, er det basale nivået av autophagy forhøyet sammenlignet med normale celler eller celler fra andre tumorcellelinjer, og er korrelert med kliniske resultater dårligere [10], [12]. Dette fenotype, karakteristisk for Ras-transformerte celler, som gjør dem unike utsatt for forstyrrelse av mitokondriell respirasjon og autofagi. Faktisk har farmakologisk hemning samt stanse av nøkkel Autophagy gener med hell ført til reduksjon av mitokondriell oksygenforbruk og intracellulære ATP-nivåer fører til dyp hemming av kreft i bukspyttkjertelen vekst, både in vitro og in vivo [10]. Derfor hemming av autofagi og mitokondrie målretting kunne gi en ny tilnærming for behandling PDACs som vanligvis er svært ildfast til tilgjengelige kjemoterapi. Faktisk har det vært en siste bølge i interesse for målretting kreft celle mitokondriene etter anerkjennelse av deres endrede bioenergetisk status som bidragsyter til kreft patogenesen [13]. Derfor har rettet mot mitokondrier dukket opp som en ny ideell for kreftbehandling hjulpet delvis av kunnskap for å oppnå presis levering av legemidler til organeller. Bruken av mitokondrie målrettede midler for kreftterapi presenterer en ekstra fordel av direkte virker på den viktigste regulatoren av programmert celledød i cellen og helt utenom oppstrøms signalkaskader som ofte undergravd [14]. Det er godt dokumentert at mitokondriene av ondartede celler viser en høyere transmembrane potensial i forhold til ikke-maligne celler med forskjeller i enzymaktivitet, elektronbærere og membran lipid struktur som potensielle bakenforliggende årsaker [15]. Utnyttelse av dette unike egenskap har ført til konstruksjon av nye lipofile kationer som fortrinnsvis kan akkumuleres i svulstcelle mitokondrier enn normalt vev som drives av den økede transmembranpotensialet [15]. Konjugering av triphenylphosphonium (TPP) kationer til en rekke kjemiske sonder og medikamenter er mye brukt for å oppnå spesifikk målretting til mitokondriene [16], [17], [18], [19], [20]. En TPP-merket vitamin E analog (MitoVES) har blitt grundig undersøkt for sin apoptotiske og antiangiogene egenskaper som er langt forbedret over at av foreldrenes un-merket sammensatte, støtte mitokondrie målretting som en levedyktig tilnærming for å forbedre effekten av moderat aktiv legemiddelkandidater [20], [21], [22]. Alternativt har medikamentavleveringsbærere som dendrimerer og lipososmes blitt modifisert med TPP kationer og anvendt for å levere lasten til mitokondriene [17], [23], [24], [25]. Når disse bærere ble lastet med modell kjemoterapeutiske legemidler inkludert paclitaxel eller doksorubicin, ble effekten forsterket i løpet av ikke-målrettede bærere indikerer at levering til mitokondriene kan forbedre apoptose og cytotoksisitet.
Vi har tidligere rapportert funn av en ny klasse av TPP salter som har bredspektret anticancer aktivitet [26]. Disse forbindelser kan hope seg opp i mitokondriene i kraft av deres positivt ladede grupper TPP og det negative potensialet på tvers av mitokondrielle membraner [27]. Senere har vi vist at disse forbindelser er istand til å oppheve mitokondriell respirasjon og økende mitokondrielle superoksyd nivåer. Viktigst, har vi vist at denne klassen av forbindelser som effektivt kan inhibere tumorvekst i en naken mus brystkreft xenograft modell uten åpenbar toksisitet [26]. På grunn av sin unike mekanisme handling rettet mot mitokondrier og utsøkt avhengighet av Ras-drevet svulster på mitokondrienes funksjon, forsøkte vi å utvikle denne klassen av forbindelser som nye midler mot kreft i bukspyttkjertelen. Videre, gitt viktigheten av autophagy å opprettholde en sunn pool av mitokondriene for å støtte overlevelse og spredning av Ras transformerte celler, hypotese vi at TP421 ville indusere celledød i kreft i bukspyttkjertelen celler på en måte som involverer autofagi regulering av mitokondrier.
Materialer og metoder
celle~~POS=TRUNC linjer~~POS=HEADCOMP og kultur reagenser
MIA PACA-2, PANC-en, BxPC-3 og VVS bukspyttkjertelkreft cellelinjer ble kjøpt fra American Type Culture Collection (ATCC; Manassas, VA). MEF atg3 + /+ og atg3 – /- murine cellelinjer var en gave fra Masaaki Komatsu (Juntendo University School of Medicine, Bunkyo-ku, Tokyo) [28]. HFF-en normal fibroblast cellelinje ble gitt av Dr. Carla Grandori (Fred Hutchinson Cancer Research Center, Seattle, Washington). Alle cellelinjer brukes til eksperimentering ble holdt i kultur under 35 passasjer og testes regelmessig for mycoplasma forurensning ved hjelp PlasmoTest ™ (InvivoGen, San Diego, California). MIA PACA-2 og PANC-1-celler ble opprettholdt i DMEM supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS; Gemini-Bioproducts, West Sacramento, CA). BxPC-3, MEF atg3 + /+ og atg3 – /- celler ble holdt i RPMI supplert med 10% FBS. HPAC celler ble holdt i 01:01 blanding av DMEM og Ham F12-medium supplert med 5% FBS. Celler ble dyrket ved 37 ° C i en fuktet atmosfære av 5% CO2. For alle forsøk ble celler i eksponentiell vekstfase skyllet med DPBS uten kalsium og magnesium, kort trypsinisert i et lite volum av 0,25% trypsin-EDTA-oppløsning (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), resuspendert i fullstendig kulturmedium manuelt telles og sådd på sterile plater og lov til å følge over natten før behandling.
forbindelser
Alle forbindelser ble lagret som konsentrert DMSO lager fryses ved -20 ° C. Fortynninger ble utarbeidet i DPBS, uten kalsium og magnesium, og brukes for maksimalt 3 fryse-tine sykluser. Forbindelser ble kjøpt fra LKT Laboratories Inc. (St. Paul, Minnesota), Sigma-Aldrich Corp (Saint Louis, MO) og Asinex Ltd (Moskva, Russland).
Cvtotoksisitetsmålinq
Cytotoksisitet ble målt ved hjelp av 3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5-difenyltetrazoliumbromid (MTT) kolorimetrisk analyse som tidligere beskrevet [26].
kolonidannelse assay
cellene ble utsådd i 6-brønners plater (500-1000 celler per brønn, avhengig av cellelinjen) og fikk over natten for å overholde. Den neste dag, legemidler ble tilsatt til brønnene i 24 timer, hvoretter mediet ble erstattet med medikamentfritt medium. Celler ble ytterligere inkubert i 7-14 dager for å gi kolonier til å danne. Koloniene ble farget med en krystallfiolett løsning (0,05% krystallfiolett, 0,74% formaldehyd og 36% metanol), skylles og deretter avbildes.
trypanblått Utelukkelse analysen
Behandlet celler ble samlet inn via kort trypsinering og farget ved hjelp av trypanblått 0,4% oppløsning (Lonza Group Ltd) i henhold til produsentens anbefaling. Cellene ble telt ved bruk av et hemacytometer.
Alamar blå celleviabilitet analysen
Celler ble håndtert identisk med MTT analysen beskrevet ovenfor. Ved slutten av behandlingen, ble Alamar blå (ABD Serotec
©) lagt til brønner i henhold til produsentens anbefaling. Fluorescens ble påvist ved 560/590 ex /em bølgelengder.
Cell Cycle Bestemmelse
Narkotika behandlede celler ble samlet via kort trypsinering, og fiksert i 70% etanol ved -20 ° C i minst 4 timer. For å bestemme DNA-innhold ble prøver spunnet ned og re-suspendert i DPBS inneholdende propidiumjodid (50 pg /ml sluttkonsentrasjon) og RNase A (100 pg /ml sluttkonsentrasjon) og analysert ved hjelp av strømningscytometri.
Cell lysater og Western blotting-analyse
Behandlet cellswere skyllet med DPBS og lysert på is ved tilsetning av et lite volum av SDS-inneholdende cellelysebuffer i 15 min. Lysater ble oppsamlet i Eppendorf-rør, sonikert på is for å skjære DNA, og kvantifisert ved hjelp av RC DC-proteinanalyse (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Tretti mikrogram cellelysat ble fylt i hvert kjørefelt og underkastet SDS-PAGE og deretter overført til Immun-Blot polyvinylidenfluorid membraner (PVDF; Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). I korthet membranene ble blokkert i 5% melk i TBST, fulgt av inkubasjon i primært antistoff fortynnet i hensiktsmessig blokkeringsbuffer ved 4 ° C overnight.After, ble membranene vasket, ble passende sekundært antistoff tilsatt i 1 time ved romtemperatur og til slutt vasket off før bildebehandling. Alle antistoffer ble kjøpt fra enten Cell Signaling Technology Inc. (Danvers, MA) eller Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, California). Protein påvisning ble utført ved hjelp av Super Signal West Dura kjemiluminescenssubstrat (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA) og avbildes på ChemiDoc ™ XRS + systemet (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). For alle western blot-data, bilder er representative blots valgt fra minst to uavhengige eksperimenter.
Måling av hydrogenperoksyd Nivåer
Genereringen av hydrogenperoksyd ble målt ved anvendelse av en Amplex Red enzymanalyse. -Celler utsådd i 96-brønns klare bunn sorte plater ble behandlet i 4 timer med den ønskede konsentrasjon av medikament i fenolrødt-fritt DMEM-medium supplert med 10% FBS. Ved slutten av behandlingen ble cellene vasket og lysert i DPBS-buffer inneholdende 50 uM Amplex Red (Molecular Probes) og 0,1 enheter /ml pepperrot-peroksidase (HRP, Sigma, St. Louis, MO, USA) og inkubert i 30 minutter ved 37 ° C , beskyttet mot lys. Etter inkubasjon ble fluorescens intensitet av hver brønn detektert ved 540/590 ex /em bølgelengder.
Måling av superoksydanion Levels
Narkotika behandlet MIA PACA-2 og BxPC-3 celler ble kort farget med MitoSOX Red Mitokondrie Superoxide Indicator (Invitrogen, Carlsbad, California) etter produsentens recommendations.Fluorescence intensitet ble målt ved hjelp av flowcytometri som tidligere beskrevet [26].
Fluorescent Mikroskopi av TP421 subcellulære lokalisering
MIA PACA-2 og PANC-1-cellelinjer ble sådd i dobbelt kammer, dekkglass (Nalge Nunc International, Rochester, NY) ved en tetthet på 50.000 celler /kammeret og tillatt over natten for å overholde. Den følgende dag ble cellene behandlet med 2 uM TP421 i tidsrom opp til 72 timer. Før bildebehandling, ble cellene farget i 15 minutter ved 37 ° C ved hjelp av enten 200 nM Mitotracker Red CMXRos eller 50 nM Lysotracker Red DND 99 levende celle organelle flekker (Life Technologies, Grand Island, NY) etter produsentens anbefalinger. Levende celler ble visualisert ved hjelp av et Nikon DAIPHOT 300 invertert mikroskop (Nikon Instruments, Melville, New York) er utstyrt med DAPI og Cy3 filteret blokkerer, 10x øye stykke og 100x /1.3 Nikon olje nedsenking linse og super høytrykkskvikksølvlamper. For å hindre fotobleking, ble prøven eksponering for lys minimeres under bildet oppkjøpet ved å delta nøytral tetthet (ND2 og ND4) filtre for å begrense intensiteten av lyset som når prøven. Bilder ble tatt med et fotometriske CoolSNAP 9 CCD-kamera (Roper Scientific, Ottobrun, Tyskland) og behandlet ved hjelp av Q-fangst Pro v 5.1.1.14 bildebehandlingsprogrammer (Q bildebehandling aksjeselskap, Surrey, BC, Canada).
Immunofluorescent farging av LC3B
MIA PACA-2-celler ble sådd ut på dekkglass ved en tetthet på 50.000 celler og tillatt over natten for å overholde. Den følgende dag ble cellene behandlet med 2 uM TP421 i nærvær eller fravær av 5 uM rapamycin eller 10 uM klorokin i 18 timer. Ved slutten av behandlingen ble mediet fjernet og cellene ble vasket med 500 ul DPBS før fiksering med 3,7% formaldehyd i 15 m ved romtemperatur. Faste cellene ble vasket med 500 mL DPBS før og etter permeablization med iskald aceton i 5 minutter ved -20 ° C. Objektglassene ble blokkert i 30 minutter med 1% bovint serumalbumin (BSA) i DPBS før inkubering over natten ved 4 ° C med LC3B antistoff i 1% BSA. Antistoff ble fjernet, og objektglassene ble vasket i DPBS med forsiktig omrøring. Cy5 og Cy3-konjugerte antistoffer (GE Healthcare Lifesciences, Pittsburgh, Pennsylvania) fortynnet i 1% BSA ble inkubert med dekkglass for 2 timer. Dekk igjen ble vasket i DPBS med forsiktig omrøring, lufttørket og montert på pre-renset glass slidesusing Forleng Gold anti-fade montering media (Life Technologies, Grand Island, New York). Bilder ble innhentet ved hjelp av en Lieca SP2 skanning konfokal mikroskop (Leica Microsystems, Heidelberg, Tyskland) er utstyrt med 488 nm argon og 633 nm krypton lasere (laser makt ble holdt til et minimum 50% av totalen) og Leica Confocal programvare v 2.61 ( Leica Microsystems, Heidelberg, Tyskland).
In vitro Migration analysen
Cell migrasjon ble analysert ved hjelp av 24-brønns plate cellekultur inserts utstyrt med gjennomsiktig PET-membraner med 8 mikrometer store porer (BD Biosciences, San Jose, California). 7,5 × 10
4 serumsultede MIA PACA-2-celler ble sådd i den øverste kammeret i serum frie medier og får lett følge natten. På den neste dag, ble migrerings stimulert med 10% FBS medium tilsatt til det nedre kammer. Negative kontrollbrønner mottok 1% serum medium i stedet. TP421 behandlede prøver, ble tilført 10% FBS medium i det nedre kammer og forbindelsen i serumfritt medium i det øvre kammeret. Etter 24 timer ble cellene adherent til oversiden av membranen forsiktig skrapet av ved hjelp av en Q-tips. Cellene på undersiden av membranen ble farget med Giemsa nukleær flekk i 30 minutter ved romtemperatur og vasket med deionisert vann. Bilder av de fargede membraner ble tatt fra representative felt ved hjelp av Nikon invertert mikroskopet med en 10X objektiv.
Wound Healing analysen
Tissue kultur behandlet 96-brønners plater ble belagt med kollagen jeg oppløst i 0,2 N eddiksyre (sterilfiltrert) til en sluttkonsentrasjon på 45 ug /ml over natten ved 4 ° C over natten. Den følgende dag overskudd av kollagen ble fjernet, brønnene ble vasket to ganger med DPBS og blokkert med 2 mg /ml BSA i DPBS i 1 time ved romtemperatur. Etter blokkering, ble brønnene igjen vasket DPBS. PANC-1-celler ble deretter sådd ut i en tetthet på 35.000 celler /brønn i sin helhet serum media og tillates å følge natten over. Mediet ble skiftet til serumfritt medium, og cellene ble ytterligere inkubert over natten. Dagen etter riper ble gjort ved hjelp kanten av en 200 mL tips og brønnene ble vasket med DPBS. Behandlet og un-behandlet kontrollbrønner mottok 10% FBS inneholder media og narkotika ble lagt. Negative kontrollbrønner mottok serum-fritt medium. Sår ble tillatt 24 timer til å lukke ved enden av hvilken brønnene ble skyllet med DPBS ble cellene fiksert i 100% metanol i 10 minutter og farget med Giemsa beis atom i 30 minutter. Til slutt, ble brønnene vasket med avionisert vann og wallowed tørke. Sår ble avbildet med en ved hjelp av en 4X objektiv.
Statistical Analysis
Hvor angitt, p-verdier ble beregnet ved hjelp av tosidige uparet t-test med ulike variasjoner. P-verdier mindre enn 0,05 ble ansett for å være statistisk signifikant.
Resultater
TP421 Viser Rapid og Potent Cytotoksisitet i et panel av bukspyttkjertelkreft cellelinjer
I vår første rapport på anticancer-aktivitet av denne klasse forbindelser beskrev vi deres potent cytotoksisitet mot kreftcellelinjer av varierende slektsnavn [26]. Her igjen, testet vi muligheten av en av de blyforbindelser som er identifisert skjema vår første skjermen, TP421, for å indusere cytotoksisitet og inhibere celleproliferasjon i et panel av bukspyttkjertelcancercellelinjer. Ved hjelp av MTT-analysen, evaluerte vi virkningen av 72 timers kontinuerlig eksponering for økende doser av TP421, TP187, og TP197 på veksten av MIA PACA-2, BxPC-3, PANC-1 og VVS-cellelinjer. Resultatene (tabell 1) viste potent cytotoksisitet, med TP421 IC
50-verdier i sub-mikromolområde i alle de testede cellelinjer, uavhengig av deres forskjeller i differensiering tilstand eller genetisk mutasjons bakgrunn. Strukturene til forbindelsene som ble testet er vist i holde figuren (fig S1). TPP-gruppen i denne forbindelsen er essensiell for aktivitet som 7-dietylamino-4-metylkumarin, et strukturelt identisk analog av TP421 mangler TPP del, produserte ikke cytotoksisitet i cellelinjene som ble testet. Vi undersøkte videre effekten av 24 timers eksponering for TP421 på kolonidannende evne av MIA PACA-2-celler sammenlignet med gemcitabin og erlotinib (figur 1). Resultatene bekreftet evne TP421 å hemme celledeling
in vitro
til nivåer tilsvar med gemcitabin og langt mer potent enn erlotinib. For ytterligere å karakterisere de cytotoksiske aktivitetene til TP421, inkubert vi-celler i nærvær eller fravær av en rekke konsentrasjoner av TP421 i 0,25, 0,5, 1 eller 5 timer, etterfulgt av inkubasjon i medikamentfritt medium i 24, 48 og 72 timer. Parallelt, behandlet vi cellene med en kontinuerlig eksponering for TP421 for 24, 48 og 72 timer. Ved slutten av inkubasjoner vurderte vi celleviabilitet via MTT. Som forventet, IC
50 av TP421 hadde en invers korrelasjon med behandlingstiden, så vel som den totale varighet av inkubasjonstid, slik det er vist i tabell 2. Uventet vi imidlertid observert at med meget korte eksponeringstider, så kort som 15 min, TP421 var i stand til å oppnå 50% cytotoksisitet enn ved høyere konsentrasjoner (20 uM) som indikerer en meget rask innledende legemiddeleffekt. Interessant nok har vi funnet at for PANC-1-celler som ble behandlet på denne måte, kortere eksponeringstider medikament sterkt redusert cytotoksisitet av TP421. Overlevelseskurver som sammenligner kontinuerlig og 0,25 h eksponeringstider i de tre cellelinjer er vist i figur 2.
Effekt av 24 timers medikamenteksponering på kolonidannende evne på (A) MIA PACA-2 og (B) BxPC -3. Bilder er representative for tre uavhengige eksperimenter.
doseresponsoverlevelseskurver for cellelinjer behandlet med TP421 sammenligning av kontinuerlig eksponering (lukkede firkanter) til 0,25 h medikament eksponering, etterfulgt av en media vaske ut (åpne firkanter) og ytterligere inkubasjon. Total inkubasjonstiden er angitt i parentes. Dataene er gjennomsnitt ± SD fra tre uavhengige eksperimenter. TP421 konsentrasjoner er plottet på en log base 10 skala.
TP421 Cytotoksisitet er Selective Mot kreft celler
Etter en forutsetning om at TP421 ville selektivt akkumuleres i kreftceller drevet av høyere transmembrane potensiale sammenlignet vi effekten av TP421 på vekst egenskapene til normal fibroblast cellelinje HFF-1 mot tre av pancreatic cancer-cellelinjer. Behandling av MIA PACA-2 og HFF-1-celler med en rekke doser av TP421 i 72 timer viste klart høyere sensitivitet av bukspyttkjertelkreft cellelinjen mot stoffet (figur 3A). Dette ble ytterligere bekreftet ved å måle prosentandelen av døde celler akkumulert av TP421 behandling som var betydelig høyere i de pankreatiske kreftceller i forhold til HFF-1 (figur 3B). Videre, anvendelse av Alamar blue indikatorfarge, observerte vi en 4-gangers forskjell i inhibering av MIA PACA-2-celleproliferasjon sammenlignet med HFF-1-celler etter 72 timers inkubering periode med TP421 ved de angitte doser. (Figur 3C).
(A) Vekst av normale HFF-1 celler er upåvirket mens kreft i bukspyttkjertelen MIA PACA-2 celler viser omfattende død etter 72 timers eksponering for økende doser av TP421. (B) TP421 induserer større celledød i tre bukspyttkjertelkreft cellelinjer i forhold til HFF-1 celler målt ved trypan blå eksklusjon. (C) Spredning av MIA PACA-2, men ikke HFF-1 er sterkt hemmet av TP421 i Alamar blue analysen. Tre uavhengige eksperimenter ble utført, representative bilder er vist i (A), var gjennomsnittlig ± SD er plottet i (B) og (C). *, **, *** Og **** tyder p-verdi 0,05, p 0,01, p 0,001 og p. 0,00005 hhv
TP421 Arrestasjoner bukspyttkjertelkreft cellelinjer i G
0 /G
en fase av cellesyklus i en tid og doseavhengig måte
for å belyse den mekanismen som TP421 hemmer celledeling, vi evaluert effekten på cellesyklus kinetikk. MIA PACA-2 (figur 4), PANC-1, BxPC-3, og VVS (Tabell 3) celler ble behandlet med to konsentrasjoner av TP421 for å øke varigheten av tid og DNA-innhold ble analysert ved hjelp av strømningscytometri. Omfattende G
0 /G
1 arrest ble observert i alle cellelinjene tross små forskjeller i deres følsomhet for TP421. Interessant, cellesyklusfordelingen for MIA PACA-2-celler som ble behandlet med de to andre analoger, TP187 og TP197, også lignet TP421 med sterk og tidlig arrest i G
0 /G
1 (tabell 3). Dette resultatet er forskjellig fra G
2 /M og S-fase rest indusert av disse forbindelser i ikke-bukspyttkjertel cancer-cellelinjer [26], noe som indikerer en potensiell tumor-typespesifikk virkning.
Effekten av TP421 behandling på cellesyklusfordelingen av MIA PACA-2-celler ble undersøkt i en dose- og tidsavhengig måte. Celler var ubehandlet eller behandlet med 0,1 og 1 mM TP421 for 24, 48 og 72 timer. Histograms avbildet er representative for tre uavhengige eksperimenter.
TP421 lokaliserer til MITOKONDRIELLE Structures med Vedvarende Retention over tid
TP421 tilhører en klasse av forbindelser som inneholder en TPP kation kjent for å hoper seg opp i mitokondriene [27]. For å bekrefte mitokondrie lokalisering, ble PANC-1-celler behandlet med 2 uM TP421 for forskjellige tidsrom. Umiddelbart før bildebehandling, celler ble co-farget med 200 nM MitoTracker Red dye å merke mitokondriene. Vi har observert signifikante ko-lokalisering vedvare i opptil 72 timer (figur 5A) som indikerer at TP421 faktisk akkumulert i mitochondria og ble beholdt i en forlenget tidsperiode. Som sekundær verifisering av mitokondriell lokalisering vi søkt å bestemme rollen til mitokondriell transmembranpotensialet i akkumulering av TP421 i celler. Ved hjelp av ionoforen karbonyl cyanid-4- (trifluormetoksy) phenylhydrazone (FCCP), som vanligvis brukes for å spre den mitokondrielle transmembrane potensial, undersøkte vi mønsteret av TP421 fluorescens. Vi forbehandlet PANC-1-celler i 30 minutter med 10 uM FCCP etterfulgt av en 15 minutters inkubasjon med TP421. Kontrollceller fikk ingen FCCP og ble utsatt for 15 min TP421 bare. I nærvær av FCCP, observerte vi en utpreget diffus fluorescens TP421 (figur 5B), som ikke ligner på den for mitokondriell lokalisering som bekrefter at under normale forhold TP421 akkumulert i mitokondriene drevet av den transmembrane potensial. Siden vi har observert at 7-dietylamino-4-metylkumarin ikke var cytotoksisk for celler, vi videre undersøkt forholdet mellom mitokondrie lokalisering og TP421 cytotoksisitet. Vi forbehandlet MIA PACA-2-celler i 30 minutter med 10 uM FCCP deretter tilsatt TP421 i ytterligere 30 min. Ved slutten av behandlingsvarighet, vasket vi cellene og erstattet medium for å fjerne overskudd av medikamentet og inkuberte cellene i 24, 48 og 72 timer og målte celleviabilitet. I nærvær av FCCP cellene ble signifikant beskyttet mot TP421 cytotoksisitet (figur 5C) som indikerer at lokaliseringen til mitokondriene var direkte ansvarlig for virkningen av vår medikament.
(A) PANC-1-celler behandlet med TP421 og farget med MitoTracker Rød (MTR) avslører omfattende samlokalisering av TP421 og mitokondriell markør fargestoff. (B) PANC-1-celler forbehandlet med FCCP viser ikke-mitokondriell TP421 lokalisering. (C) Redusert cytotoksisitet av TP421 på MIA PACA-2-celler forbehandlet med FCCP sees ved 24, 48 og 72 timer. Dataene er gjennomsnitt ± SD fra tre uavhengige eksperimenter. * Indikerer p. 0,01
TP421 Behandling induserer mitokondrie og cytosolic Opphopning av reaktive oksygen arter
TP421 reduserer mitokondrieluftkapasitet og øker superoksid (O
2
– ) akkumulering [26]. Imidlertid, sammenlignet med O
2
-, hydrogenperoksid (H
2o
2) er en forholdsvis mer stabile og membran-gjennomtrengelige ROS som kan forårsake lipid, protein og DNA-skade og deltar i signaltransduksjon [29]. Derfor undersøkte vi nivået av H
2o
2 i kreft i bukspyttkjertelen celler følgende TP421 behandling. MIA PACA-2 og BxPC-3-celler ble behandlet med økende doser av TP421 i 4 timer etterfulgt av en kort inkubering med 50 uM Amplex Red, i nærvær av 0,1 enheter /ml HRP. I nærvær av HRP, reagerer Amplex Red reagens med H
2o
2 i et 01:01 støkiometri for å fremstille sterkt fluorescerende resorufin. Den resulterende fluorescens-intensiteten ble målt ved eksitasjons- og emisjonsbølgelengder på 540 nm og 590 nm, respektivt. Som forventet, resulterte behandling i en 2,5 ganger økning i H
2o
2 nivåer i BxPC-3 på den høyeste konsentrasjonen av TP421 med en god korrelasjon mellom H
2o
2 nivåer og dose TP421 brukes (Figur 6A). På den annen side kan en lignende økning i fluorescens ikke påvises i MIA PACA-2-celler (data ikke vist). For å avgjøre om mangelen på H
2o
2 akkumulering i disse cellene skyldes et fravær av O
2
– generasjon, brukte vi en MitoSOX rød analyse [26] for å måle nivået av mitokondrie O
2
– i MIA PACA-2 og sammenlignet det å BxPC-3. Begge cellelinjer som ble behandlet med økende doser av TP421 for 4 t utstilt 3-5 ganger økning i O
2
– nivå (figur 6B) og disse nivåene forble høy på 24 timer (data ikke vist). Dette tyder på at mangelen på H
2o
2 opphopning observert i MIA PACA-2 celler var ikke på grunn av mangelfull O
2
-produksjon i disse cellene.
Effekten av TP421 behandling på nivåene av (A) H
2o
2 og (B) mitokondrie O
2
– i BxPC-3 og MIA PACA-2-celler ble målt ved hjelp av fluorescerende prober Amplex rød og MitoSOX Red hhv. (C) Effekt av antioksidanter forbehandling på cytotoksisiteten av TP421 i PANC-1-celler. *, ** Og *** angir p 0,05, p 0,005 og p. 0,001 henholdsvis
Som dreven ROS er kjent for å føre til celledød, vi videre undersøkt mulighetene beskyttende rolle en antioksidant. PANC-1-celler ble forbehandlet med 15 mM
N
-acetyl-L- cystein (NAC) i 2 timer før tilsetning av TP421. Etter en 24 timers inkubering graden av cytotoksisitet ble bestemt ved MTT. Antioxidant forbehandling kunne beskytte cellene fra TP421 indusert cytotoksisitet med opp til 35% (figur 6C) og lignende resultater ble observert i MIA PACA-2 og BxPC-3 celler (data ikke vist).
TP421 Behandling Aktiverer Stress indusert Pathways
Gitt sterk akkumulering av ROS følgende TP421 behandling, har vi antatt at, cellulært stress trasé JNK, p-38 og ERK, vil bli aktivert [30], [31], [32]. MIA PACA-2 og BxPC-3-celler ble behandlet med økende doser av TP421 i 4 timer eller med 5 uM for 1-8 timer og kinase-aktivering ble bestemt ved Western blotting.
