Abstract
Kjøp av platina motstand etter førstelinje platina /taxaner er ofte observert i eggstokkene kreftpasienter og hindrer klinisk effektivitet. Det er få muligheter til å forhindre platina motstand; har imidlertid demethylating midler blitt vist å resensitize pasienter til terapi platina derved demonstrerer at DNA-metylering er en viktig bidragsyter til utviklingen av platinamotstands. Vi har tidligere rapportert at epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR) er en ny regulator av DNA-metyltransferase (DNMT) aktivitet og DNA-metylering. Andre har vist at EGFR-aktivering er knyttet til behandling med cisplatin og platina motstand. Vi antok at cisplatin-indusert aktivering av EGFR medierer endringer i DNA-metylering i forbindelse med utvikling av resistens platina. For å undersøke dette, evaluert vi EGFR-signalering og DNMT aktivitet etter akutt cisplatin eksponering. Vi har også utviklet en
in vitro
modell av platina motstand for å undersøke effekten av EGFR hemming om kjøp av cisplatin motstand. Akutt cisplatin behandling aktiverer EGFR og nedstrøms signalveier, og induserer en EGFR mediert økning i DNMT aktivitet. Cisplatin resistente celler viste også økt DNMT aktivitet og global metylering. EGFR-inhibering i løpet av gjentatte behandlinger cisplatin generert celler som var mer følsom overfor cisplatin, og ikke utvikle en økning i DNA-metylering eller DNMT aktivitet sammenlignet med kontroller. Disse funn antyder at aktiveringen av EGFR i løpet av platina behandling bidrar til utvikling av platinamotstands. Videre kan EGFR hemming være en effektiv strategi på å dempe utviklingen av platina motstand og dermed øke effektiviteten av kjemoterapeutiske behandling i eggstokkreft
Citation. Granados ML, Hudson LG, Samudio-Ruiz SL (2015) Bidrag fra epidermal vekstfaktor reseptor til Oppkjøp av Platinum Resistance i eggstokkreft celler. PLoS ONE 10 (9): e0136893. doi: 10,1371 /journal.pone.0136893
Redaktør: J. Christopher stater, University of Louisville, USA
mottatt: 10 april 2015; Godkjent: 09.08.2015; Publisert: 09.09.2015
Copyright: © 2015 Granados et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Forskning rapportert i denne publikasjonen ble støttet av National Cancer Institute of National Institutes of Health i henhold Award Number K01CA172591. Innholdet er utelukkende ansvaret til forfatterne og ikke nødvendigvis representerer den offisielle visninger av National Institutes of Health. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Eggstokkreft er den ledende dødsårsaken som følge av gynekologiske kreftformer [1]. Avansert sykdom, sent stadium diagnose, peritoneal metastaser og hyppig utvikling av chemoresistance hindre forbedringer i total overlevelsesrate som fortsatt er lav på omtrent 44% [1]. Første linje behandling for eggstokkreft inkluderer kirurgisk debulking og platina (cisplatin eller karboplatin) -taxane (paclitaxel) kjemoterapi [2]. Så mange som 70-80% av eggstokkreft pasienter vil utvikle platinamotstands etter førstelinjebehandling og de fleste av disse pasientene til slutt gi etter for kjemoresistent sykdom [3-5]. Således fortsetter platinamotstands å være en signifikant klinisk utfordring. Til dags dato, det er begrenset intervensjoner tilgjengelig for å hindre eller reversere platina motstand; Imidlertid har det vært noen fremskritt i bruk av demethylating midler i resensibilisering av pasienter til platinabasert terapi [6-10]. Nærmere bestemt, Matei og medarbeidere viste at platina resistente pasienter som ble behandlet med en lav dose demethylating middel indusert demetylering av gener i tumorceller og positivt korrelert med progresjon overlevelse [7]. Dette understreker DNA metylering som en kritisk bidragsyter til oppkjøpet av resistens i eggstokkreft. Men mekanismene som regulerer DNA metylering og oppkjøpet av platinamotstands følgende cisplatin behandling er ikke fullstendig klarlagt. Vi har tidligere rapportert at epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR) regulerer av DNA metyltransferaser (DNMT) og DNA-metylering [11]. Derfor kan EGFR bidra til utvikling av platinamotstands.
EGFR er en reseptor tyrosin kinase som er overuttrykt i 30-98% av ovarialcancer [4,5] og overekspresjon av EGFR (og dens ligander) i eggstokkene kreftpasienter korrelerer med dårlig prognose [12]. Aktivering av EGFR i ovarietumorer er assosiert med økt kreft og dårlig pasient utfall [13,14]. Videre aktivering av EGFR er vist i ~ 30% av ovarietumorer [15]. EGFR er ansvarlig for aktivering av flere intracellulære signalveier inkludert Ras /Raf /MAPK, Jak /Stat og AKT /PI3K og regulerer mange cellulære prosesser som celle overlevelse, spredning og migrasjon (se [14] for gjennomgang). I tillegg oppstår EGFR aktivering i respons til cisplatin [16-19] og hyperaktive av reseptoren, og nedstrøms signalveier, er innblandet i platina motstand [20,21]. Vi viste tidligere at aktivering av EGFR i eggstokkreft celler øker DNMT aktivitet og over lang sikt EGFR aktivering kan føre til økt DNA-metylering [11] samt redusert følsomhet overfor cisplatin [22].
platina eller cisplatin motstand er korrelert med økt DNA-metylering og påfølgende lyddemping av gener som er involvert i passende legemiddelrespons [23-28]. Genekspresjon analyse av platina sensitiv i forhold til platina resistente pasientprøvene viste at differensielt regulerte gener er mer sannsynlig å bli underexpressed i motstandsdyktig mot sensitive tumorer [29]. Tatt sammen, hypotese vi at den cisplatin-indusert aktivering av EGFR bidrar til utvikling av platinamotstands i eggstokkreft celler gjennom regulering av DNMT aktivitet og DNA-metylering. Videre foreslår vi at lavmolekylære inhibitorer til EGFR kan være nyttig for å forebygge eller dempe oppkjøpet av cisplatin motstand. For å teste vår hypotese, vurderte vi aktivering av EGFR, nedstrøms signalveier og DNA metyltransferase aktivitet i eggstokkreft celler i respons til fysiologisk relevante doser av cisplatin. Vi undersøkte også effekten av den lille molekylet inhibitor erlotinib i en
in vitro
modell av platina motstand. Vi fant at inhibering av EGFR demper cisplatin-induserte økninger i DNMT aktivitet, hindrer økte DNA-metylering og også reduserer platina motstand i eggstokkreft celler. Dette arbeidet fremhever en mulig mekanisme og en medgjørlig mål å redusere utviklingen av platina motstand basert på epigenetiske mekanismer.
Materialer og metoder
Cell kultur og medikamentell behandling
eggstokkreft karsinom cellelinje OVCA 433 ble gitt av Dr. Robert Bast Jr, MD Anderson Cancer Center, Houston TX [30] og vokst i Minimum Essential Medium (MEME) (Gibco, Life Technologies, Grand Island, New York) supplert med 10% ( v /v) føtalt bovint serum (FBS) (Atlanta Biologicals, Lawrenceville, GA), 1 mM natrium pyruvat (Sigma, St. Louis, MO), 0,5 enheter /ml penicillin-0,5 mikrogram /ml streptomycin (Gibco, Life Technologies) , senere referert til som MEME vekstmedier. Alle cellene ble holdt ved 37 ° C under 5% CO2 /95% luft. Akutte 10 mm cisplatin (Sigma-Aldrich) behandlinger ble gjort i MEME vekstmedier for 0-6 timer. EGFR inhibering ble utført ved hjelp av preinkubasjon av cellene med 2 uM AG1478 (LC Laboratories, Woburn, Massachusetts) i 24 timer før behandling med cisplatin. 10 nM EGF (Biomedical Technologies, Stoughton, MA) behandling i 15 minutter ble foretatt som en positiv kontroll for EGFR-aktivering.
Cisplatin motstand paradigme
som opprinnelig ble demonstrert i [20], motstand mot cisplatin kan økes i eggstokkreft celler ved gjentatte sekvensiell behandling med cisplatin etterfulgt av narkotika gratis utvinning ganger. Vår cisplatin motstand paradigme ble modellert fra [20]. I korthet OVCA 433-celler ble behandlet med cisplatin i 48 timer og fikk deretter komme seg i minst 48 timer etter medikamentbehandling. Celler gjennomført tre runder med hver konsentrasjon av cisplatin etterfulgt av narkotika gratis utvinning ganger før de blir utsatt til neste høyere dose. Dosene av cisplatin ble benyttet var 3, 6 og 9 pM. Celler som fullfører dette paradigmet ble betegnet Cisplatin resistente (HLR) celler. Passasje kontrollceller (ikke gjennomgår behandling cisplatin) ble utført parallelt. EGFR ble hemmet ved å behandle cellene med en mikrometer Erlotinib (Cell Signaling, Danvers, MA) i minst en time før medikamentelle behandlinger med cisplatin. Erlotinib ble opprettholdt i kulturen media i 48 timer med cisplatin behandlinger og deretter cellene ble tillatt å komme seg fra all behandling i MEME vekstmedier i løpet av stoff gratis intervaller.
Immunoblotting
Celler ble vasket med PBS og høstet i cellelyseringsbuffer inneholdende 5 mM EDTA, 2 mM EGTA, 1 mM Na
3VO
4, leupeptin 10 mg /ml pepstatin A 10 mg /ml, 1 mM PMSF i PBS og 1% SDS . Totalt proteinkonsentrasjonen ble bestemt ved hjelp av BCA protein assay kit (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL). Like mengder av totale cellelysater (30 ug) ble underkastet elektroforese gjennom 10% SDS-polyakrylamid-, overført til 0,45 pm nitrocellulose (Thermo Fisher Scientific) og blokkert med 3% BSA. Blotter ble probet med kanin polyklonale anti-fosfor-EGFR (Tyr1068) (Cell Signaling) ved 1: 1000, kanin polyklonale anti-total EGFR (Santa Cruz, Dallas, TX) ved 1: 500, kanin monoklonalt anti-fosfor-JAK2 ( Abcam, Cambridge, MA) ved 1: 1000, kanin monoklonalt anti-total JAK2 (Cell Signaling) ved 1: 1000, kanin monoklonalt anti-fosfo AKT (Cell Signaling) ved 1: 1000, muse-monoklonalt anti-total AKT (BD Transduksjon Laboratories, Franklin Lakes, NJ) ved 1: 500, monoklonalt anti-fosfor-STAT3 (ser727) (Cell Signaling) ved 1: 1000, kanin monoklonalt anti-total STAT3 (Cell Signaling) 1: 1000, kanin polyklonale anti-fosfor -ERK1 /2 (Cell Signaling) ved 1: 2000, kanin polyklonale anti-total ERK1 /2 (Cell Signaling) ved 1: 2000, kanin polyklonale anti-DNMT1 (New England Bio Labs, Ipswich, MA) ved 1: 750, kanin polyklonale anti-DNMT3A (Cell Signaling) ved 1: 1000, kanin polyklonale anti-DNMT3B (Abcam) ved 1: 1000, kanin polyklonale anti-DNMT3L (Abcam) ved 1: 1000, kanin polyklonale pDNMT1 (Ser714) (Millipore, Billerica , MA) ved 1: 250 og en mus monoklonalt anti-GAPDH-antistoff (Millipore) ved 1: 1000, som ble brukt som en kontroll lasting. Blottene ble deretter inkubert i riktig sekundært antistoff (Promega, Madison, WI) og immunreaktive proteiner ble oppdaget ved hjelp SuperSignal West Pico eller Femto Chemiluminescence (Thermo Fisher Scientific). Imaging av blotter og densitometry ble oppnådd ved å bruke Kodak Image Station 440 og tilhørende programvare (NEN Life Science Produkter, Boston, MA).
Ettlagskulturer og Flercellede Aggregate (MCA) cellekultur
Celler ble platet ut ved 2000 celler per brønn i 96-brønners flatbunnede cellekulturplater (monolagskultur) og 96 brønners Lipidure U bunnplater (NOF America Corporation, White Plains, NY) (MCA kultur). Cellene vokste over natten ved 37 ° C under 5% CO2 /95% luft. Bilder ble tatt med Olympus IX70 utstyrt med DP72 digitalt kamera og bildebehandling.
Celleviabilitet
Celler dyrket i monokultur og som MCAS ble behandlet med økende doser av cisplatin [0-300 mikrometer] i 48 timer. Celleviabilitet ble målt ved hjelp av PrestoBlue (Life Technologies) i henhold til produsentens protokoll. Kort fortalt ble 10 ul PrestoBlue reagens tilsettes per 100 mL av media og inkubert i 1 time (enkeltlag) eller 24 timer (MCAS). Etter de respektive inkubasjonstider, topp lese fluorescens (RFUs; eksitasjon 555 nm emisjon 585 nm) ble målt ved hjelp av SpectraMax M2 plateleser og Softmax Pro v5.4 programvare (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Beregninger av IC
50 verdier for Celleviabilitet analyser ble bestemt ved bruk av GraphPad Prism Software 4.0 (San Diego, California).
DNMT aktivitetsanalyse
Nuclear ekstrakter ble isolert ved hjelp av EpiQuik Nuclear Extraction Kit (Epigentek, Farmingdale, New York) i henhold til produsentens protokoll. Proteinkonsentrasjoner for atom ekstrakter ble bestemt ved hjelp av BCA protein assay kit (Thermo Fisher Scientific). Total DNMT aktivitet ble bestemt ved bruk av 20 ug totalt protein og EpiQuik DNA-metyltransferase (DNMT) Aktivitet /Inhibering Assay Kit (Epigentek) som anbefalt av produsenten. Hver plate ble lest ved hjelp av en mikroplateleser ved 450 nm. Mengden av metylert substrat-DNA detektert av settet er proporsjonal med DNMT enzymatisk aktivitet i våre prøver. DNMT aktivitet blir beregnet ved den følgende ligning: Eksempel verdier ble normalisert til verdiene oppnådd for kontroll, ubehandlede OVCA 433 celler i det samme eksperimentet, og uttrykt i forhold til en
Global DNA-metylering kvantifisering
DNA. ble isolert fra celler ved hjelp av DNeasy blod og vev Kit i henhold til produsentens protokoll (Qiagen, Valencia, CA). Globalt DNA metylering ble evaluert med 250 ng av DNA og MethylFlash denaturert DNA Kvantifisering Kit (Epigentek) i henhold til produsentens protokoll. Mengden av 5-metylcytosin i hver prøve bestemmes ved en kolorimetrisk analyse som blir detektert av mikroplateavleser ved 450 nm. Kvantifisering av DNA-metylering beregnes ved følgende ligning:. Eksempler på verdier ble normalisert til verdiene oppnådd for kontroll, ubehandlede OVCA 433 celler i det samme eksperimentet og uttrykt som en prosentvis økning av 100% (kontroll)
Grafisk fremstilling og statistisk analyse
Alle data ble undersøkt i duplikat for ubehandlede kontrollceller passasje og samlet opp fra minst 4 uavhengige forsøk, hvis ikke annet er angitt. Data ble fremstilt grafisk og analysert ved hjelp GraphPad Prism Software 4.0 (San Diego, CA) ved hjelp av enveis ANOVA eller to-veis ANOVA og Tukey-tallet, Dunnet innlegg hoc analyse eller Bonferroni korreksjon der dette er hensiktsmessig. Standard uparet t-test også brukt når det passer.
Resultater
Akutt cisplatin behandling starter EGFR signaliserer
Flere
in vitro
studier så langt har brukt høy doser av cisplatin (50-100 uM) for å demonstrere økt aktivering av EGFR over korte behandlingstider [16-19]. Men studier ser på farmakokinetikken hos pasienter som fikk 75-120 mg /m
2 av cisplatin viste maksimalt plasmanivå mellom 0,2 og 14 mikrometer [31,32], og dermed tyder på at
in vitro
studier av 50-100 mikrometer kan ikke være klinisk relevant. Her, bekreftet vi at cisplatin behandling på en mer fysiologisk relevant dose (10 mm) aktiverer EGFR. Betydelige økninger i EGFR fosforylering (pEGFR) ble observert i eggstokkreft celler (OVCA 433) etter 30 min (0,5 timer), 1 time og 2 timer behandling med 10 mm cisplatin uten endringer i total EGFR (Fig 1A og 1B). Dataene ble også uttrykt som et forhold mellom aktivert EGFR til total EGFR (figur 1C) og funnet å være signifikant øket ved 2 timer etter behandling med cisplatin. Spesifikk inhibering av EGFR-tyrosinkinase-aktivitet ble oppnådd ved anvendelse av AG1478 for å bestemme rollen til EGFR i cisplatin-indusert aktivering av nedstrøms signalveier. Som forventet, AG1478 hemmet både basal og cisplatin induserte nivåer av pEFGR uten vesentlige endringer i total EGFR uttrykk (Fig 2A). Funksjonell aktivering av EGFR etter cisplatinbehandling ble vurdert ved evaluering av nedstrøms-reseptor mål etter behandling med cisplatin og AG1478 (figur 2B). JAK2 og AKT-aktivering ble øket betydelig ved 4 timers behandling tidspunkt når sammenlignet med ubehandlede kontroller. Betydelige økninger i ERK1 /2 eller STAT3 aktivering ble ikke observert under disse betingelser (data ikke vist). Motsatt, aktivering av JAK2 og AKT ble sterkt redusert ved AG1478 mens totale proteinnivå forble relativt uendret uavhengig av behandling (figur 2B-2D). Dermed akutte, fysiologisk relevante doser av cisplatin initierer EGFR-signalering og aktivering av JAK2 og AKT.
A) Representative vestlige blotter aktivert eller fosforylert EGFR (pEGFR, tyr1068) i OVCA 433 celler gitt 10 mm cisplatin for 0,5 , 1, 2, 4 og 6 timer, sammenlignet med ubehandlede kontrollceller. 10 nM EGF gitt til cellene i 15 minutter som en positiv kontroll som viser aktivering av reseptoren. Total EGFR blot og GAPDH representative blotter også vist. B) Diagram av EGFR aktiverings følgende 10 uM cisplatin behandling av 0,5, 1, 2, 4 og 6 timer, n = 6. EGF data som er vist som en positiv kontroll. C) Diagram som viser forholdet mellom pEGFR til total EGFR (pEGFR /total EGFR-forhold) ved å følge 10 uM cisplatin behandling av 0,5, 1, 2, 4 og 6 timer, n = 6. En-veis ANOVA av data indikerer en signifikant effekt av cisplatin behandling og vesentlige forskjeller fra kontroll som bestemmes av Dunnet innlegg hoc analyse indikert av * p 0,05, ** p 0,01, *** p. 0,001
A) Representative vestlige blotter av pEGFR, total EGFR og GAPDH av OVCA 433 celler – /+ 10 pM cisplatin i 1 time i nærvær og fravær av EGFR-spesifikk hemmer AG1478 (2 uM, for 24-timers preinkubering). B) Representative vestlige blotter for pJAK2 (tyr1007 /1008), total JAK2, Pakt (ser473), total AKT og GAPDH. OVCA 433 celler – /+ 10 mm cisplatin i 1-4 timer og i nærvær av AG1478. Dataene som genereres for følgende grafene representerer minst 4 uavhengige forsøk dvs. ~ 4 forskjellige behandlings /innsamlingsgrupper og ~ 4 forskjellige immunoblotter. C) Forhold av JAK2 aktivering (pJAK2 /totalt JAK2) data ble oppnådd etter 10 uM cisplatin behandling i 1-4 timer og i nærvær av AG1478, n = 4-6. Betydelige økninger fra kontrollprøvene observert ved 4 timer med cisplatin behandling. AG1478 pre-inkubering i 24 timer blunted basalnivåer av aktivt JAK2 samt cisplatin-induserte økninger i JAK2 aktivering ved 4 timer (AG + 4). D) Forhold av AKT-aktivering (pakt /totalt AKT) data ble oppnådd etter 10 uM cisplatin behandling i 1-4 timer og i nærvær av AG1478, n = 4-7. Betydelige økninger fra kontrollprøvene observert ved 4 timer med cisplatin behandling. AG1478 pre-inkubasjon i 24 timer blunted cisplatin-indusert økning i AKT aktivering på 4 timer (AG + 4). Enveis ANOVA viste en signifikant effekt av medikamentell behandling og følge Dunnet innlegg hoc test signifikante forskjeller fra kontrollene er angitt med * p 0,05, ** p. 0,01
In vitro
oppkjøpet av cisplatin motstand
for å vurdere rollen til EGFR aktivering i utviklingen av platina motstand, har vi designet en
in vitro
paradigme av platina motstand basert på tidligere utgitt arbeid [20] ( figur 3A). Cisplatin-resistente (HLR) celler dyrket under heft (monolayer) forhold viste morfologiske forandringer sammenlignet med kontrollceller (figur 3B). Litteraturen antyder at 3D-modeller, så som flercellede aggregater (MCAS), mer nøyaktig reflekterer eggstokk-kreft-celle
in vivo
responser [33], og kan være viktig for å forstå medikamentresistens [34]. HLR MCAS var synlig mer kompakt sammenlignet med kontroll passasje MCAS (figur 3B). Dette er i tråd med våre tidligere funn som viser at kompakte MCAS er mer motstandsdyktig mot cisplatin [22]. Ett lag cisplatin levedyktighet analyser viste en 5 ganger økning i IC
50 (kontroll IC
50 = 12,7 mikrometer vs. HLR IC
50 = 72,9 mm) (figur 3C). To-veis ANOVA viste en signifikant effekt av cisplatin signifikant effekt av celletype (kontroll vs. CPR), og en signifikant interaksjon. Levedyktighet analyser for MCAS viste at HLR MCAS hadde økt i IC
50 sammenlignet med passeringskontroll MCAS (styre MCA IC
50 = 44,0 mikrometer vs. HLR MCA IC
50 = 79,5 mm) (fig 3D) . Igjen, avslørte to-veis ANOVA en signifikant effekt av cisplatin, celletype og interaksjon. Dermed vår
in vitro
modell av platina motstand viste seg å være et verdifullt verktøy i å undersøke de molekylære endringer som er involvert i utviklingen av cisplatin motstand.
A) Skjematisk av cisplatin motstand paradigme som beskrevet i materialer og metoder. B) Representant 10X bilder av OVCA 433 kontroll og cisplatin resistente (HLR) celler som et enkeltlag og som flercellede aggregater (MCA). Scale bar = 100 mikrometer. C) Cellenes levedyktighet av monolaget kontroll (sort linje), IC
50 = 12,7 uM, og HLR (grå linje) IC
50 = 72,9 uM, i respons til cisplatin behandling med doser [5, 10, 20, 50, 100 mikrometer] for 48hrs. Data uttrykt som en prosent av ubehandlede kontrollceller, n = 8. To-veis ANOVA viste en betydelig generell viktigste effekten av celletype (kontroll vs CPR) [F (1,84) = 88,10, p 0,001], en signifikant virkning av cisplatin eksponering [F (5,84) = 61,87, p 0,001], så vel som en signifikant interaksjon [F (5,84) = 4,353, p 0,01]. Signifikante forskjeller i levedyktigheten observert ved 5, 10, 20, 50, 100 uM cisplatin i kontrollceller, ** p 0,01, *** p 0,001. D) Cellenes levedyktighet av MCAS kontroll (sort linje), IC
50 = 44,0 uM, og HLR (grå linje), IC
50 = 79,5 uM, i respons til cisplatin behandling med doser [5, 10, 20 , 50, 100 uM] i 48 timer. Data uttrykt som en prosent av ubehandlede kontrollceller, n = 7. To-veis ANOVA viste en betydelig generell viktigste effekten av celletype (kontroll vs CPR) [F (1,72) = 30,41, p 0,001], en signifikant virkning av cisplatin eksponering [F (5,72) = 128,3, p 0,001], så vel som en signifikant interaksjon [F (5,72) = 3,946, p 0,01]. Signifikante forskjeller i levedyktigheten observert ved 50, 100 mikrometer cisplatin i kontrollceller, *** p. 0,001
Karakterisering av signalveier i HLR celler
HLR cellene forble motstandsdyktig mot ytterligere behandling med cisplatin, selv i fravær av ytterligere eksponering for cisplatin demonstrere en vedvarende endring i HLR-celler i forhold til deres passasje kontroller. Mens andre rapporterte at hyperaktivitet av EGFR er assosiert med platinamotstands [20], observerte vi ingen forskjell i basalnivåer av pEGFR i HLR-celler sammenlignet med kontrollceller (figur 4A). I tillegg har vi funnet at HLR celler ikke viser signifikant økning i basalnivåer av EGFR nedstrøms signalveier som for eksempel JAK2, AKT, STAT3, ERK1 /2 (S1 Fig). Imidlertid forble HLR cellene utsatt for den cisplatin-indusert aktivering av EGFR ved re- eksponering for medikamentet i 1 time, uten samtidige endringer i samlede EGFR-nivåer (figur 4A). HLR-celler viste en signifikant økning i aktivering av EGFR (forholdet mellom pEGFR /total EGFR) når cellene ble på nytt utsatt for cisplatin (figur 4B). I overensstemmelse med våre observasjoner i figur 1, viser vi en betydelig økning i EGFR-aktivering når kontrollceller ble behandlet med cisplatin, men det var ingen signifikante forskjeller ble observert mellom kontroll og HLR-celler i fravær av cisplatin.
A) representative vestlige blotter av pEGFR, Total EGFR og GAPDH for kontroll og HLR celler – /+ 10 mm cisplatin (re-eksponering) i 1 time. B) stilles grafisk data for forholdet mellom EGFR aktivering (pEGFR /total EGFR) i kontroll- og HLR celler etter cisplatin re-eksponering. Enveis ANOVA etterfulgt av Tukey s post hoc viste signifikante økninger i EGFR-aktivering i kontrollceller behandlet med cisplatin og i HLR celler behandlet med cisplatin i forhold til sine ubehandlede motparter, men HLR-celler var ikke signifikant forskjellig fra kontrollceller i fravær av cisplatin. * P. 0,05, ** p, 0,01
Akutt cisplatin behandling øker DNMT aktivitet og denne effekten er avhengig av EGFR aktivering
Fordi EGFR aktivering øker DNMT aktivitet og DNA metylering og det er en etablert sammenheng mellom DNA metylering og platinamotstands (27-32), vi evaluert effekten av akutt cisplatin eksponering på DNMT aktivitet. OVCA 433 celler behandlet med cisplatin viste signifikant øket DNMT aktivitet ved 1 time sammenlignet med kontroller (figur 5A). EGF behandling ble anvendt som en positiv kontroll i disse studiene som vi tidligere viste økt DNMT aktivitet under disse betingelser [11]. I tillegg inhibering av EGFR med AG1478 forhindret cisplatin-indusert økning i DNMT aktivitet ved 1 time (figur 5B) som indikerer at denne økningen i DNMT aktivitet er avhengig av cisplatin s aktivering av EGFR. Det var ingen signifikante forskjeller ble observert mellom kontrollprøver og AG1478 alene behandlet prøvene, og heller ikke var det en betydelig forskjell mellom AG1478 alene og AG1478 + cisplatin grupper.
A) Normalisert DNMT aktivitet etter behandling med 10 mm cisplatin for 0- 4 timer, n = 4. 10 nM EGF behandling i 15 minutter ble anvendt som en positiv kontroll. Enveis ANOVA viste en signifikant effekt av cisplatin behandling og vesentlige forskjeller fra kontroll som bestemmes av Dunnet innlegg hoc analyse indikert av * p 0,05. B) Normalisert DNMT aktivitet etter behandling med 10 uM cisplatin i 1 time i nærvær og fravær av 2 uM AG1478 (24-timers preinkubering), n = 5. En-veis ANOVA, etterfulgt av Tukey s post hoc-analyse viste at EGFR-spesifikke inhibitor AG1478 betydelig svekket cisplatin induserte effekter på DNMT aktivitet. * P 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001
DNMT aktivitet og global DNA metylering er økt i HLR celler, men EGFR hemming reduserer denne endringen
HLR-celler viste en signifikant økning i aktivitet sammenlignet med DNMT passasje kontrollceller (figur 6A). Så, benyttet vi den EGFR-hemmer, Erlotinib, for å undersøke om DNMT aktivitet kan forebygges ved cisplatin behandling. Erlotinib behandlinger alene ikke påvirke DNMT aktivitet, men erotinib samtidig behandling med cisplatin i løpet av platinamotstands paradigmet (Erlotinib HLR) dempes den cisplatin-indusert økning i DNMT aktivitet. For å vurdere konsekvensene av økt DNMT aktivitet, vi deretter målt global DNA metylering (totalt 5-metyl-cytosin innhold) i de eksperimentelle gruppene (figur 6B). Data ble normalisert til verdier som ble oppnådd for kontrollcellene og fremstilt grafisk som prosent av kontrollen. Totalt 5-metyl-cytosin innhold var signifikant økt i HLR-celler, men denne økningen var svekket i cellene i henhold til EGFR inhibering i løpet av platinamotstands paradigmet. Disse studiene bekrefter at cisplatin induserte endringer i DNMT aktivitet og DNA-metylering er avhengig av EGFR aktivering. Denne økningen i DNMT aktivitet og DNA-metylering i HLR-celler kunne ikke forklares med økte nivåer av DNMTs til stede i disse cellene. Faktisk, analyse av DNMT nivåer i kontroll- og HLR celler viste at DNMT1 og en fosforylert form for DNMT1 på serin 714 (pDNMT1) tidligere koblet til EGFR aktivering [35] er både betydelig redusert i HLR celler (S2 Fig). DNMT3A, DNMT3B og DNMT3L alle viste ingen signifikante forskjeller i HLR celler sammenlignet med kontrollene.
A) Normalisert DNMT aktivitet i kontroll, HLR celler samt celler som mottok EGFR-hemmer Erlotinib bare eller Erlotinib + cisplatin under cisplatin motstand paradigme, n = 4. enveis ANOVA etterfulgt av Dunnet innlegg hoc viste at Erlotinib samtidig behandling med cisplatin i cisplatin motstand paradigmet dempet økningen i DNMT aktivitet observert i HLR celler. B) Normalisert prosent 5-metylcytosin (5mC) eller DNA global metylering for kontroll, HLR celler samt celler som mottok EGFR-hemmer Erlotinib bare eller Erlotinib + cisplatin i løpet av cisplatin motstand paradigmet, n = 4-6. En måte ANOVA etterfulgt av Tukey s post hoc viste en signifikant økning i den globale DNA-metylering i HLR-celler, men ikke i celler som fikk erlotinib * p. 0,05
EGFR inhibering reduserer graden av motstand observert hos in vitro modell av platinamotstands
Gitt bevis på at bruk DNMT hemmere reverserer platinamotstands [6-10] samt våre observasjoner som EGFR hemming svekket DNMT aktivitet og DNA metylering i HLR celler, vi testet om dette resulterte i en endring i platina følsomhet. Som innledningsvis vist i figur 3, har vi funnet i et separat sett av eksperimenter som HLR celler er vesentlig mer motstandsdyktige enn sine motstykker passeringskontroll dyrket som monolag (kontroll IC
50 = 15,8 uM versus HLR IC
50 større enn 100 mm) (figur 7B) og MCAS (kontroll IC
50 = 28 mikrometer vs. HLR IC
50 større enn 100 mm) (figur 7C). Hemming av Erlotinib alene påvirker ikke følsomhet for cisplatin; monolag (Erlotinib IC
50 = 12 mm) og MCAS (Erlotinib IC
50 = 32 mikrometer). EGFR hemming med Erlotinib under platinamotstands paradigmet reduserer graden av motstand observert i HLR celler for både mono (CPR IC
50 større enn 100 mikrometer vs. Erlotinib HLR IC
50 = 59 mm) og MCAS (HLR IC
50 større enn 100 mikrometer vs. Erlotinib HLR IC
50 = 86 mikrometer). Toveis ANOVA viste en signifikant effekt av celletype (kontroll vs. Erlotinib vs. CPR vs Erlotinib CPR), en signifikant effekt av cisplatin behandling og en signifikant interaksjon. Post hoc analyse viste signifikante forskjeller mellom HLR og erlotinib ved 50 uM og 100 uM. Tatt sammen tyder dette på at EGFR spiller en rolle i utviklingen av platinamotstands som EGFR inhibering redusert mengden av motstanden som ble oppnådd ved vår modell av platinamotstands.
A) Representative 10X bilder av OVCA 433 styre , Erlotinib behandlet, cisplatin resistente (HLR) og celler som ble gitt Erlotinib og cisplatin i platina motstandsdyktig paradigmet (Erlotinib HLR) som et enkeltlag og som flercellede aggregater (MCA). Scale bar = 100 mikrometer. B) Celleviabilitet av monokontroll (sort linje), IC
50 = 15,8 mikrometer, CPR (grå linje) IC
50 100 mikrometer, Erlotinib alene (stiplet svart linje), IC
50 = 12 uM, og erlotinib HLR (stiplet linje grå) IC
50 = 59 uM, i respons til behandling med cisplatin doser [5, 10, 20, 50, 100 uM] i 48 timer. Data uttrykt som en prosent av ubehandlede kontrollceller, n = 4. To-veis ANOVA viste en betydelig generell viktigste effekten av celletype (kontroll vs. erlotinib vs vs HLR erlotinib CPR) [(3,72) = 65,88, p 0,001], så vel som en signifikant interaksjon [F (15,72) = 3,468, p 0,001].
