Abstract
Bakgrunn
nestin assosieres med neoplastisk transformasjon, men mekanismene som nestin bidrar til invasjonen og malignitet av lungekreft er fortsatt ukjent. Tatt i betraktning at spredning er nødvendig for ondartet atferd, undersøkte vi mekanisme nestin handling i forbindelse med proliferative egenskapene til ikke-småcellet lungekreft (NSCLC).
Metoder
nestin uttrykk ble undersøkt hos NSCLC prøver og cellelinjer. Foreninger med clinicopathological funksjoner, inkludert prognose og proliferativ markører, ble evaluert. Effekter av nestin knockdown på spredning og signalveier involvert ble videre undersøkt.
Resultater
nestin ble uttrykt i de fleste kreftprøver og alle tumorcellelinjer analysert. Høy nestin uttrykk i ondartet vev ble assosiert med høye Ki-67 eller PCNA nivåer og dårlig pasientutfall. Omvendt, knockdown av nestin uttrykk førte til signifikant inhibering av tumorcellevekst, redusert kolonidannende evne, og cellesyklus G1 arrest. Videre nestin knockdown resulterte i hemming av Akt og GSK3p aktivering.
Konklusjoner
Våre data viser at nestin uttrykk hos NSCLC-celler er assosiert med dårlig prognose for pasienter og tumor celleproliferasjon veien. Nedregulering av nestin effektivt hemmet lungekreft celledeling, som kan være gjennom å påvirke cellesyklus arrest og Akt-GSK3p-Rb signalveien
Citation. Chen Z, Wang J, Cai L, Zhong B, Luo H, Hao Y, et al. (2014) rolle Stem Cell-Associated Intermediate Filament nestin i Ondartet spredning av ikke-småcellet lungekreft. PLoS ONE 9 (2): e85584. doi: 10,1371 /journal.pone.0085584
Redaktør: Vladimir V. Kalinichenko, Cincinnati Children Hospital Medical Center, USA
mottatt: 29. mai 2013; Godkjent: 29 november 2013; Publisert: 3. februar 2014
Copyright: © 2014 Chen et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet med tilskudd fra National Basic Research Program of China (No. 2009CB522100 og 2010CB945400), Natural Science Foundation National of China (No. 30971675, 30900729, og 31.171.398), og nøkkelen vitenskapelige og teknologiske prosjekter i Guangdong-provinsen (No . 2007A032100003). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Lungekreft er nå den ledende årsak til kreft-relaterte dødsfall på verdensbasis. I ikke-småcellet lungekreft (NSCLC), som står for 80% av alle lungekreft tilfellene, fjernmetastaser utvikle seg i opptil 70% av pasienter med tidlig stadium sykdommen [1], [2]. Til tross for innføring av nye kjemoterapeutika og bedre kirurgiske teknikker, forblir NSCLC en betydelig terapeutisk utfordring. Overlevelsesraten er for tiden dårlig, med bare 15% pasient overlevelse ved 5 år etter diagnose [3]. Ondartede funksjoner i NSCLC involvere flere viktige hendelser, inkludert spredning og invasjon av primærtumor, vedvarende angiogenese, og unndragelse av apoptose. Spredning av primærtumor er en integrert del av molekylær og cellulær patogenesen, utvikling og metastasering av lungekreft [4].
nestin, et medlem av den mellomliggende filament (IF) familie, har blitt identifisert som en potensiell proliferative og multipotency indikator i flere stamceller [5] – [10]. Nylige rapporter støtter en kobling mellom nestin og ondartede egenskaper [11] – [19], og antyder at tallrike nestin ekspresjon er korrelert med større malignitet og dårligere prognose i forskjellige krefttyper [11], [18] – [21]. Imidlertid er den spesifikke funksjon av nestin i invasive og metastatiske adferd av lungekreftceller er fortsatt uklar. Funnene som nestin knockdown reduserer kultivert neuroblastom og astrocytom cellevekst mens overekspresjon har en cytoprotective effekt mot H
2o
2 skade foreslå en rolle i å fremme celle overlevelse og spredning [22] – [24]. I motsetning til en annen studie viste at nestin downregulation ikke endrer
in vitro
eller
in vivo
vekst egenskapene til to forskjellige bukspyttkjertelkreft cellelinjer [25]. Således kan nestin ikke bare fungere som et strukturelt protein, men kan delta aktivt i kontroll av viktige cellulære prosesser. Men de nøyaktige mekanismene for nestin handling i spredning krever ytterligere forklaring.
Vår tidligere studie bekreftet nestin uttrykk hos NSCLC vevsprøver, som syntes å korrelere med den nyfødte lymfatisk duct indusert av kreftceller [21]. På den annen side hadde Ryuge S rives nestin uttrykk er en prognostisk indikator på dårligere overlevelsen sannsynlighet for pasienter med NSCLC resekterte [26]. Men forholdet mellom nestin ekspresjon og proliferative oppførselen til NSCLC-celler er ikke blitt direkte undersøkt til dags dato. Gitt den begrensede tilgjengelige data på patofysiologisk rolle nestin i NSCLC celler [21], [26], vi har ikke bare bekreftet at uttrykket av nestin i NSCLC prøvene viste seg å korrelere med kliniske tiltak av svulsten ondartet sykdom, men også undersøkt sammenhengen av nestin uttrykk med proliferative egenskapene til lungekreftceller og sin funksjonelle rolle i tumorcellevekst i denne studien.
Materialer og Metoder
vevsprøver
totalt 71 NSCLC prøver og tumor tilstøtende vev (lengst kant av reseksjon fra svulsten) ble tilfeldig valgt fra vår vev database. Prøver ble innhentet fra pasienter behandlet ved Institutt for Thoracic Surgery fra First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen-universitetet mellom mai 2003 og juli 2004. Ingen av pasientene hadde fått neoadjuvant kjemoterapi eller strålebehandling. Kliniske opplysninger ble innhentet ved å gjennomgå preoperative og perioperative medisinske poster eller via telefon eller skriftlig korrespondanse. Saker ble iscenesatt basert på svulsten-node-metastaser (TNM) klassifisering av International Union Against Cancer, revidert i 2002 [27], [28]. Bruken av humant materiale ble godkjent av Medical Etisk komité The First Affiliated Hospital, Sun Yat-sen-universitetet (Fullt navn av styret /komiteen. Medical Etisk komité The First Affiliated Hospital, Sun Yat-sen-universitetet No. 2008-7). Vi bekrefter at skriftlig informert samtykke fra donor eller pårørende ble oppnådd for bruk av denne prøven i forskning. Kliniske kjennetegn ved pasientene er vist i tabell 1.
Cellelinjer
Ikke-småcellet lungekreft cellelinjer, A549, H1299 og H460, ble hentet fra Cell Bank of Chinese Academy of Sciences (Shanghai, Kina), og dyrket i henhold til de spesifikke Cell Bank protokollen.
immunhistokjemisk farging
immunhistokjemiske prosedyre var lik tidligere rapporterte protokoller [21], [29] . Anti-nestin (AB5922, Millipore, Temecula, CA, 1:500 fortynning) og anti-Ki-67 (sc-15402, Santa Cruz, CA, USA; 1:200 fortynning). Ble brukt som primære antistoffer
Plasmider
for knockdown av nestin uttrykk, retrovirus vektorer (pSM2) koding av kort hårnål RNA (shRNAs), betegnet shRNA1 (5′-TGC TGT TGA CAG TGA GCG AGG CAG ACA TCA TTG GTG TTA ATA GTG AAG CCA CAG ATG TAT TAA CAC CAA TGA TGT CTG CCC TGC CTA CTG CCT CGG A-3 «) og shRNA2 (5»-TGC TGT TGA CAG TGA GCG CGG CTA GTC CCT GCC TGA ATA ATA GTG AAG CCA CAG ATG TAT TAT TCA GGC AGG GAC Tags CCA TGC CTA CTG CCT CGG A-3), ble kjøpt fra Open Biosystems (Huntsville, AL, USA). Disse retrovirus eller en konstruksjon som inneholder en egge shRNA sekvens (kontroll shRNA, Open Biosystems) ble stabilt omformet til kreftceller gjennom antibiotika utvalg.
immunfluorescens Farging
Celler ble inkubert med primære anti-nestin ( AB5922, Millipore, Temecula, CA, 1:500 fortynning), anti-Ki-67 (Santa Cruz, 1:200 fortynning) eller anti-PCNA antistoff (2586, Cell Signa Tech, Beverly, MA, 1:2000 fortynning). Prøvene ble montert med Vectashield inneholder Hoechst 33342, og observert under et fluorescens mikroskop
RT-PCR analyse
Total RNA ble ekstrahert, og følgende primer sekvenser ansatt. Nestin, 5-GAG GAC CAG AGT ATT GTG AGA C-3 og 5-CAC AGT GGT GCT TGA GTT TC-3 (368 bp) og β-aktin (internkontrollen), 5-GTG GGG CGC CCC AGG CAC CA-3 og 5-CTC CTT AAT GTC ACG CAC GAT TTC-3 (540 bp).
Immunoblotting Analyse
Proteiner ble separert, elektrooverført, blokkert med en løsning av TBS /0,1% Tween-20, inkubert med mus anti- nestin antistoff (AB5922, Millipore, Temecula, CA, 1:500 fortynning) over natten, og detektert med en pepperrot peroksidase-konjugert anti-muse-sekundært antistoff (Cell Signaling Tech, Beverly, MA, USA). GAPDH (SC-81545, Santa Cruz, CA, USA) ble brukt som en intern kontroll og bildet-Pro Express (MediaCybernrtics, USA) systemet ble brukt
Colony Forming og CCK-8 Cell Proliferation Analyser
Cell kolonidannelse ble bestemt ved hjelp av krystallfiolett farging. Celleproliferasjon ble analysert med Cell Counting Kit (CCK) -8 (Dojindo, Kumamoto, Japan), og bestemmes ved å måle absorbans ved 450 nm.
Vurdering av DNA syntese via Edu innlemmelse
celler ble merket med 5-etynyl-2′-deoxyuridine (edu). Nuclear innlemmelse ble analysert ved påvisning av Alexa Fluor 488 med klikke-iT Edu Imaging Kit (Invitrogen).
flowcytometrisystemer
Etter vasking med PBS, femti tusen celler ble analysert ved hjelp av en FACS Calibur instrument (BD Biosciences, San Jose, CA) utstyrt med Cellquest 3.3 software. ModFit LT 3,1 prøvecellesyklus analyse programvare ble benyttet for å bestemme hvor mange prosent av cellene i ulike faser av cellesyklus
Expression of Cell Cycle Proteiner
For immunoblotting, følgende antistoffer brukes. Kanin anti-Akt (# 9272), anti-GSK3p (# 9332), anti-fosfor (Ser21 /9) -GSK3β (# 9331), anti-fosfor (Ser780) -Rb (# 9307), anti-fosfor (Ser795) -Rb (# 9301), anti-fosfo (Ser870 /811) -Rb (# 9308), muse-anti-fosfo (Ser473) -Akt (# 4051) og anti-retinoblastom (Rb) protein (# 9309), så vel som HRP-konjugert-anti-kanin-sekundært antistoff. Alle antistoffer ble kjøpt fra Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA). For kvantitative analyser, alle data ble normalisert til GAPDH uttrykket.
Statistical Analysis
Alle beregninger ble utført ved hjelp av SPSS V.14.0 statistisk programvare (Chicago, IL, USA). Spearmans korrelasjonskoeffisienten, Chi-kvadrat-test, og ANOVA ble anvendt etter behov. Total overlevelse (OS) ble beregnet fra datoen for operasjonen frem til dato for siste oppfølging, og foreningen av nestin uttrykk med OS presentert som Kaplan-Meier plott. Univariate og multivariate analysene ble utført ved hjelp av Cox regresjon for å bestemme prognostiske effekten av nestin uttrykk og potensielle kliniske variabler på OS.
Resultater
Grunnleggende klinisk informasjon og oppfølgingsstudier
i alt 51 mannlige og 20 kvinnelige pasienter med NSCLC utsatt for kurativ kirurgisk fjerning ble inkludert i studien. Gjennomsnittsalderen for pasientene var 57,6 ± 9,8 år (range, 35 til 77 år). Vi undersøkte 35 lunge adenokarsinom, 34 plateepitelkarsinom og to store cellekreft tilfeller. Saker ble klassifisert som stadium I (n = 32), stadium II (n = 17), stadium III (n = 15) og stadium IV (n = 7).
27, 28 Stage IV tilfeller inkludert T
1-2 N
0 og resected enslig hjernemetastaser. Pasientdata ble analysert etter 5 års oppfølging, og informasjon som er innhentet for 95,8% (68 av 71) av pasientene. Median total overlevelse var 25,2 ± 1,9 måneder (95% KI: 21.4-29.0 måneder) og bety total overlevelse var 24,0 ± 2,3 måneder (95% KI: 19.4-28.6 måneder).
Association of nestin Expression med dårlig prognose hos NSCLC pasienter
baseline karakteristikker av studiepopulasjonen med hensyn til nestinfenotypen og resultater av multivariate analysene er presentert i tabell 1 og 2, henholdsvis. Nestin ble uttrykt i 88,7% (63/71) tilfeller, med nesten ingen uttrykk i alveolære og bronkiale epitelceller i tumor tilstøtende vev (figur 1A, B). Nestin status ble korrelert med dårlig differensiert fenotype (
χ
2 = 17,776,
P =
0,006), histologiske kreft vevstype (
χ
2 = 8,215,
P =
0,002), N-klassifisering (
χ
2 = 12,093,
P =
0,001), og vital status (
χ
2 = 9,003,
P =
0,003). Vi har observert en signifikant forskjell i overlevelse mellom anslagene pasienter med og uten nestin fenotypen (Fig 1 D). Forhøyet nestin uttrykk (med en cut-off verdi basert på median nestin histoscore) var assosiert med kortere kumulativ overlevelse (30,8 ± 3,3
vs
20,2 ± 1,7 måneder, hazard ratio, 3,366,
P =
0,006).
Sterk nestin flekker var tydelig i NSCLC vev, mens flekker i tumor tilstøtende vev var svak (A, B). Nestin ble også påvist i dårlig differensiert adenokarsinom og plateepitelkarsinom vev (C). En Kaplan-Meier plott som viser forskjeller i overlevelse mellom høye og lave nestin uttrykk grupper, dikotomisert basert på medianverdien av nestin uttrykk i tumorlesjoner (D). Skalere Bar, 100 mikrometer; *
p
0,01; ANOVA.
Association of nestin med Tumor celleproliferative Markers
nestin uttrykk var signifikant assosiert med de av proliferative markører, Ki-67 (r = 0,795,
P
0,001; figur 2A, B og C) og PCNA (r = 0,764,
P
0,001; fig S1A og B), som indikerer en rolle i tumorcelle-proliferasjon.
Farging av nestin og Ki-67 i NSCLC prøver. (A) IHC-farging av nestin og Ki-67 i NSCLC vev. (B) Signifikant korrelasjon av nestin og Ki-67 nivåer (r = 0,795;
P
0,001). Hvert punkt representerer én NSCLC prøven. (C) Ki-67 histoscores ble forhøyet i adnocarcinoma (Adeno) og plateepitelkarsinom (SCC) med høyere nestin uttrykk. Skalere Bar, 100 mikrometer; *
p
0,01, bruker ANOVA
nestin Expression hos NSCLC cellelinjer
For å klargjøre uttrykket status for nestin i NSCLC, vi undersøkte sitt uttrykk. mønstre i NSCLC cellelinjer, A549 og H460. Spesielt, ble nestin mRNA og protein påvist i alle cellelinjer (figur 3). Ekspresjonen av nestin protein mellom tumorceller og normale celler ble også blitt vist ved hjelp av laseropptaks mikrodisseksjon (figur S2).
nestin ekspresjon ble påvist i A549, H1299and H460-celler ved hjelp av immunfluorescens farging (A), RT-PCR (B) og immunoblot analyse (C). β-aktin eller GAPDH ble anvendt som en kontroll lasting. Scale Bar, 100 mikrometer.
Rolle nestin i Tumor Cell Proliferation
For å vurdere om nestin spiller en rolle i lungekreft celleproliferasjon, vi stabilt transfektert A549 og H460 celler med plasmider koding shRNAs rettet mot nestin karakterutskriften eller med egge shRNA kontroll plasmider, og målte endringer i spredningsrelaterte attributter. Immunfluorescens farging og immunblotting viste at to nestin shRNA sekvenser (shRNA1 og shRNA2) dramatisk redusert ekspresjon av nestin protein (figur 4A). Som vist i figur 4B, nestin knockdown i tumorceller resulterte i fremtredende reduksjon i kolonidannende evne (fra 23% til 11,8% og 12,3% for shRNA1 og shRNA2 i A549-celler, og fra 39,6% til 20,9% og 22,8% for shRNA1 og shRNA2 i A549-celler, henholdsvis). Formeringshastigheten ble også markert redusert i hvert nestin-knockdown-celler sammenlignet med kontroll vektor-celler, målt som en reduksjon i levedyktige celler (Figur 4C). I overensstemmelse med forholdet mellom forhøyede nestin ekspresjon og Ki-67 eller PCNA-ekspresjon i NSCLC-tumorprøver, nestin knockdown i tumorceller resulterte i en signifikant reduksjon i antall Ki-67-positive celler sammenlignet med kontrolltumorceller (Figur 4D). Videre DNA-syntese i nestin knockdown tumorceller var betydelig hemmet i forhold til at det i kontrolltumorceller (figur 5A).
(A) A549 eller H460-celler som stabilt uttrykker shRNA mot nestin (shRNA1, shRNA2) ble etablert og nestin knockdown, i forhold til A549 eller H460-celler transfektert med en kodet sekvens shRNA (kontroll vektor), bekreftet med immunofluorescens farging (venstre panel) og immunoblotting (høyre panel). Forskjellene mellom nestin knockdown og kontroll A549 eller H460 celler i form av celle kolonidannelse ble vist i representative mikrografer med krystallfiolett farging (B, venstre panel) og kvantifisering av cellekolonier (B, panel til høyre). Undertrykkelse av cellevekst som et resultat av nestin knockdown ble etablert med CCK-8 kit analyse (C). Immunfluorescens farging (D) viste positiv immunoreaktivitet for Ki-67-antistoff (rød), og kjerner ble motfarget med Hoechst 33342 (blå). Skalere Bar, 100 mikrometer; *
p
. 0,01, bruker ANOVA
Forskjeller i DNA-syntese priser mellom nestin knockdown og kontroll A549 eller H460 celler ble bestemt med Edu innlemmelse analyser (A). Strømningscytometri ble benyttet for å analysere cellesyklus i nestin knockdown og kontroll A549 eller H460-celler (B). Skalere Bar, 100 mikrometer; *
p
. 0,01, bruker ANOVA
nestin shRNA Clones Skjerm cellesyklus arrest i G1 /S Fase
For å finne ut om svulst celle proliferative hemming er relatert til cellesyklusregulering, undersøkte vi effekten av nestin knockdown på cellesyklusprogresjon i kreftceller. Spesielt er antall celler i S-fasen av cellesyklusen ble vesentlig redusert etter nestin knockdown (figur 5B).
nestin shRNA Kloner display Redusert Fosforylering av Akt i Ser 473 og GSK3α /β ved Ser 21 /9
Deretter bestemmes vi signaleringsprofiler nestin shRNA kloner. Siden overgangen fra G1 til S-fasen er en viktig kontrollpost i løpet av celleproliferasjon, vi ytterligere bekreftet de signalveier som er involvert i G1 til S progresjon. Nestin knockdown vises relativt redusert fosforylering av viktige proteiner involvert i spredning og metastase, inkludert Akt på Ser 473, GSK3α /β på Ser 21/9, og Rb på Ser 780, 795, og 807/811 (figur 6A). Kvantitativ analyse er beskrevet videre at nedgangen i fosfo-Akt og fosfo-GSK3α /p-proteiner var spesielt markert i tumorceller transdusert med shRNA2 sekvensen, mens fosfo-Rb-ekspresjon ble mer signifikant redusert i tumorceller transdusert med shRNA1 sekvens (figur 6B -F). Derfor er de viktigste begivenhetene fosforylering endret ved nestin nedregulering er de av nøkkelmediatorer i fosfatidylinositol 3-kinase pathway.
(A) ekspresjon mønstre av en serie av cellesyklusrelaterte proteiner i nestin knockdown og kontroll A549 celler. (B-D) Kvantitativ analyse av Rb og fosfo-Rb, (B) AKT og fosfo (Ser473) -AKT (C), og GSK3p og fosfo-GSK3α /β (D). *
p
0,01; ANOVA.
Diskusjoner
nestin uttrykkes i et bredt spekter av embryonale og voksne stamcellepopulasjoner, og regnes som en markør for å skille forløper celler fra andre differensierte celler [30], [ ,,,0],31]. Nylige rapporter har vist at ekspresjon av nestin i bryst, prostata, og kreft i bukspyttkjertelen er positivt korrelert med tumor malignitet [16] – [18]. Disse observasjonene har bedt om økt forskningsinteresse i uttrykket mønstre av nestin i ulike svulster og dens forhold til proliferative og metastatiske egenskaper.
I denne studien, viste vi at nestin uttrykk signifikant assosiert med maligne trekk ved NSCLC vev , spesielt, dårlig differensiert fenotype og histologi klassifisering. I tillegg ble nestin mRNA og protein uttrykt i alle NSCLC-cellelinjene som ble undersøkt. Statistiske analyser viste en signifikant økning i risikoforhold (risiko for å dø) i pasienter med høy nestin ekspresjon, sammenlignet med de som uttrykker lave nivåer av nestin. Høy nestin ekspresjon i NSCLC vev ble mest hyppig assosiert med sykdom tilbakefall og død. Våre funn ytterligere bekrefter tidligere rapporter om en positiv sammenheng mellom nestin uttrykk og tumor malignitet [11], [18] -. [21]
Selv om tidligere studier har rapportert at knockdown av nestin av siRNA reduserer effektivt spredning og vekst av C6 astrocytom celler [23] og dens nedregulering aktiverer cdk5 /P35-avhengig apoptotiske reaksjonsveier [24], [32], den nøyaktige rolle av nestin i tumormetastase er uklar i dag. Her observerte vi en positiv sammenheng mellom nestin og Ki-67 uttrykk hos NSCLC vev og celler. Observasjonen at Ki-67 protein blir uttrykt i løpet av alle de aktive faser av cellesyklusen (G1, S, G2, og mitose), men fraværende fra hvilende celler, ytterligere støtter teorien om at nestin kan være forbundet med tumorcelle-proliferasjon. Gitt sammenhengen mellom høy nestin uttrykk og forhøyet farging for de proliferative celle markører, Ki-67 og PCNA, vi fokusert på rollen nestin i tumor celleproliferasjon ved hjelp av retrovirus å innføre shRNA vektorer med nestin målretting (eller kontroll) sekvenser i NSCLC celler. Betydelig, proliferative egenskaper, for eksempel kolonidannende evne og celleveksthastigheten ble redusert i nestin shRNA kloner. Våre funn gir foreløpige bevis for en rolle nestin i kreft celle lunge spredning.
En mulig mekanisme for å gjøre rede for sammenhengen mellom nestin uttrykk og spredning er foreslått på bakgrunn av resultatene fra vår analyse av cellesyklus regulering i tumorceller. Nærmere bestemt størrelsen av S-fase cellepopulasjon ble dramatisk redusert i nestin knockdown-celler. I overensstemmelse med dette funn syntese DNA, noe som skjer i løpet av S-fasen, ble redusert i nestin shRNA kloner. Overgangen fra G1 til S-fasen er en viktig kontrollpost i cellesyklusen. Våre undersøkelser av de sentrale proteiner som regulerer denne sjekkpunktet, for eksempel Rb-proteinet, sørget for ekstra støtte for en rolle for nestin i spredning via modulering av cellesyklusen. Interaksjoner av Rb med cyclin D-CDK4 /6 og cyclin E-CDK2 komplekser fremme Rb fosforylering og uttrykket av gener som er nødvendige for å gå inn i S-fasen [33], [34]. Våre forsøk viste at nestin shRNA kloner vise forminskede relative nivåer av fosforylering på flere områder av Rb. Derfor foreslår vi at markedsføring av Rb-fosforylering er en av de molekylære mekanismene gjennom hvilke nestin induserer tumorcelle-proliferasjon. Vi har i tillegg undersøkt spesifikke proteiner av Akt signalveien. Unormalt i serin /treonin proteinkinase, Akt, er nært knyttet til den proliferative status av celler og induserer fosforylering av GSK3P [35], [36]. I sin aktiverte defosforylert form, fremmer GSK3P nedbrytning av cyclin D, og ufosforylerte GSK3P undertrykker Rb-fosforylering og hindrer cellesyklusprogresjon [37], [38]. Data fra denne studien viser at suppresjon av celleproliferasjon i nestin shRNA kloner avhenger av nedregulering av Akt-GSK3p-Rb signalveien. Forlengelsen av disse data antyder at forhøyede nivåer i nestin lungekreftceller stimulere proliferasjon og metastase ved å øke aktiviteten av denne veien. En rekke forskere tror at nestin har først og fremst en cytoskeletal funksjon, som gir et reaksjonsstedet for en rekke signalveier [39], [40], og således cytoskjelettet forventes endringer for å påvirke kinaser i forbindelse med invasjon og metastasering. Enda viktigere, fordi A549 og H460 cellelinjene er p53 villtype og p53-regulert MDM2-protein er et kjent regulator av Rb funksjon, virker det krysstale mellom nestin og p53 veien for å bli tatt i betraktning, og hemming av mTOR-aktivitet av p53, som i sin tur regulerer fosfo-Akt-S473 nivå, kan også tilveiebringe mulig sammenheng mellom p53 og nestin [41], [42]. Derfor må koblingen mellom nestin uttrykk og regulering av Rb protein nivå for å bli ytterligere opp.
Sammenligning med tidligere rapporter om for nestin uttrykk i lungekreft [21], [26], våre funn ikke bare bekreftet at ekspresjonen av nestin i NSCLC-prøvene viste seg å korrelere med kliniske mål på tumor malignitet og dårlig histologisk klassifisering, men også antydet at nestin kan bidra til den proliferative og invasive oppførsel av NSCLC-celler. I tillegg vårt arbeid også først studert den biologiske forholdet mellom nestin høy ekspresjon og ondartede trekk ved NSCLC ved hjelp av RNA-knockdown teknikker, cellesyklusanalyse, og evaluering av en serie av cellesyklus-assosierte proteiner på lungecancercellelinje modeller. Basert på disse resultatene, ville vi gitt den første demonstrasjonen som nestinfenotypen utstilt forbedret proliferative egenskaper, og forklares vitenskapelig de viktigste spørsmålene i den potensielle mekanisme nestin handling i tumor celleproliferasjon. Dermed fenomener som nestin-uttrykke svulst cellene er viktig for spredning, migrasjon, og metastase i lungekreft.
Mens våre resultater tyder på at nestin handlinger gjennom Akt-GSK3p-Rb signalveien for å bidra til spredning i lungekreftceller, andre aspekter av tumorformer, slik som angiogenese, tumor lymphangiogenesis og metabolisme, er ennå ikke direkte undersøkes. Men i lys av disse funnene, rollen nestin må vurderes i pågående klinisk diagnose eller som et nytt mål for kreftbehandling.
Konklusjoner
Vi observerte nestin-positive tumorceller i flertallet av NSCLC prøver og signifikant sammenheng av nestin uttrykk med undergruppe av NSCLC pasienter som viser dårlige resultater og høye nivåer av proliferative markører. Videre nestin knockdown hemmet celledeling og G1 /S arrest i humane NSCLC-celler, muligens via nedregulering av AKT-GSK 3β-cyclin D signalering. Våre data samlet tyder på at tumorceller som uttrykker nestin fremme proliferasjon i NSCLC, som kan utgjøre en viktig mekanisme for nestin-mediert malignitet i lungekreftceller. Målrettet regulering av nestin kan således ha terapeutiske anvendelser i human lungekreft behandling.
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
Farging av nestin og PCNA i NSCLC prøver. (A) IHC-farging av nestin og PCNA i NSCLC vev. (B) PCNA histoscores ble forhøyet i adnocarcinoma (Adeno) og plateepitelkarsinom (SCC) med høyere nestin uttrykk. Skalere Bar, 100 mikrometer; *
P
0,01, bruker ANOVA
doi:. 10,1371 /journal.pone.0085584.s001 plakater (TIF)
Figur S2.
uttrykk for nestin protein mellom kreftceller og normale celler ved hjelp av laser capture mikrodisseksjon. (A) Laser fangst mikrodisseksjon av tumorceller og normale celler. H E-fargede snitt som viser celle-tumorceller (A) og normale celler (d) før mikrodisseksjon. Samme snitt som viser tumorceller (b) og normale celler (e) etter mikrodisseksjon. Tumorceller (c) og normale celler (f) etter mikrodisseksjon på kapselen. (B) Resultatene av Western-blotting av to par microdissected tumorceller og normale celler. Scale Bar, 100 mikrometer
doi:. 10,1371 /journal.pone.0085584.s002 plakater (TIF)
Takk
Denne forskningen har blitt presentert på to
nd European Lung Cancer Conference (2010, Geneve).
