Abstract
p53 og NF-kB trasé spiller viktige roller i ulike cellulære funksjoner, inkludert celle vekst, apoptose, og tumorigenesis. Mutasjoner som inaktiverer p53-genet og konstituerende NF-kB veien aktivering er vanlige forekomster i humane kreftformer. Selv om mange legemidler er under utvikling som selektivt aktiverer p53 eller hemme NF-kB, er det få legemiddelkandidater som kan gjøre begge deler. Samtidig aktivering av p53 og hemming av NF-kB veien er derfor et ettertraktet mål for ny kreftmedisin utvikling. Denne studien er den første rapporten om en high-throughput tilnærming med masse forbindelser som samtidig er rettet mot begge veier. Ved hjelp av en cellebasert screening analyse og et bibliotek med 200.000 syntetiske forbindelser, identifiserte vi 9 små molekyler som samtidig hemmer NF-kB og aktiverer p53. En av disse forbindelser, N-2, økt ekspresjon av p53 målgener, inkludert p21 og GADD45a. I tillegg, N-2 inhiberte den transkripsjonelle aktivitet av NF-kB, samtidig undertrykke interleukin-6 og monocytt kjemotaktisk protein-1 (MCP-1) ekspresjon. Når cellelinjer avledet fra et variert utvalg av kreft ble behandlet
in vitro
med N-2, vi observert økt celledød. N-2 også i betydelig grad hemmet allograft vekst i murine modeller av melanom og lungekarsinom. Våre funn tyder på at N-2 kan fungere som en bivalent middel mot kreft gjennom samtidig modulering av NF-kB og p53 aktiviteter
Citation. Hwang SG, Park J, Park JY, Park CH, Lee KH, cho JW, et al. (2012) Anti-Cancer aktivitet av en nye små molekyl Compound som samtidig Aktiverer p53 og Hemmer NF-kB signale. PLoS ONE 7 (9): e44259. doi: 10,1371 /journal.pone.0044259
Redaktør: Aamir Ahmad, Wayne State University School of Medicine, USA
mottatt: 23 april 2012; Godkjent: 31 juli 2012; Publisert: 13.09.2012
Copyright: © Hwang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av SK Biopharmaceuticals Co., Ltd., og tilskudd (2011K00277) fra Brain Research Center for the 21st Century Frontier Research Program. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. SGH, CHP, KHL, JYP og JWC er ansatt i SK Biopharmaceuticals Co, Ltd (Daejeon, Korea), en av de finansiører av denne studien. SK Biopharmaceuticals Co., Ltd, er å utvikle bioteknologiske legemidler for sykdommer som CNS-lidelser og ulike kreftformer. Det er ingen patenter, flere produkter under utvikling eller markedsført produkter å erklære. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer, som beskrevet på nettet i veiledningen for forfatterne.
Innledning
NF-kB og p53 signalveier funksjon i nesten alle celletyper og aktiveres som reaksjon på en rekke biologiske stimuli. NF-kB er en sentral aktør i ulike cellulære funksjoner [1], [2]. Selv om det først identifisert som en transkripsjonsfaktor involvert i den inflammatoriske respons, antyder eksperimentelle bevis for at NF-kB også regulerer cellevekst, overlevelse, og apoptose [3]. IKB proteiner hemme NF-kB funksjon ved å hindre NF-kB fra å binde DNA. Aktivering av NF-kB omfatter fosforylering av spesifikke IicB serinrester av IkB-kinaser (IKKS) som fører til proteasom-mediert nedbrytning av IicB. Ved IKB degradering, er NF-kB kompleks da fri til å gå inn i kjernen hvor den kan regulere uttrykket av spesifikke gener relatert til inflammatoriske eller immunresponser, celleoverlevelses svar, og cellulær proliferasjon [4]. Den tumor suppressor protein p53 er en transkripsjons DNA-bindende faktor som spiller en viktig rolle i vakt cellen som respons på forskjellige stresssignaler [5]. Aktivert p53 induserer ekspresjon av flere gener knyttet til cellesyklus arrest, apoptose, senescence, oversettelse, og DNA-reparasjon. Fosforylering av p53 på bestemte serinresidua involverer sin egen aktivitet. For eksempel, blir fosforylering av seriner 9 og 46 i forbindelse med induksjon av apoptose og DNA-skade [6], [7]. Fosforylering på seriner 15 og 20 fører til en redusert interaksjon med negativ regulator, murine doble øyeblikk 2 (MDM2). MDM2 hemmer p53 akkumulering ved å målrette den for proteasome-mediert degradering [8], [9].
konstitutiv aktivering av NF-kB er hyppig observert i menneskelige kreft i ulik opprinnelse, inkludert lunge, melanom, og tykktarmskreft , og det er forbundet med angiogenese, kjemoterapi motstand, og overlevelse av kreft stamceller [10], [11], [12], [13]. Tumor-celle-assosiert NF-kB og dets regulerte gener, slik som cytokinet IL-6, har vært knyttet til utviklingen av chemoresistance i flere typer kreft [14], [15]. For eksempel er IL-6 forhøyet i serum og ascites av pasienter med kreft i eggstokkene og økt IL-6 konsentrasjoner korrelerer med dårlig prognose og chemoresistance [16]. En slik resistens mot kjemoterapi kan alvorlig påvirke effektiviteten av anti-kreft midler. NF-kB veien har fått mer oppmerksomhet som en ny terapeutisk mål i kreftceller som bærer mutasjoner i ras-genet i familien, en av de hyppigst muterte gen familier i humane kreftformer. Det er kjent at omtrent 20 til 30% av ikke-småcellet lungekreft pasienter (ca. 85% av alle lungekreft) har onkogene mutasjoner i k-Ras [17]. Inhibering av NF-kB signale hemmer cellulær transformasjon og sensitizes Ras mutert-cancerceller for å gjennomgå apoptose [11], [18], [19], [20], [21]. Denne hemmingen kan derfor være en lovende strategi for behandling av svulster som har Ras mutasjoner og andre kreftformer som uttrykker konstitutivt aktiv Ras.
Mutasjoner i p53-genet er mer vanlig i svulster enn mutasjoner i Ras genet familien. Faktisk er p53 direkte mutert hos omtrent 50% av humane tumorer [22]. Gjenoppretting av p53-funksjon kan derfor tilveiebringe et attraktivt terapeutisk strategi for å målrette mot kreftceller, og dermed små molekyler slik som MDM2 antagonist Nutlin-3 [23], p53-bindende molekyl RITA [24], og den MDM2 ned-regulator gambogic syre [ ,,,0],25], har blitt utviklet. Imidlertid er gjenoppretting av p53-funksjon ikke er tilstrekkelig for fullstendig tumorcelle tap. For eksempel, p53 overekspresjon hadde ingen effekt på utviklingen av lav grad av lesjoner som adenomer og p53 ikke forårsaker fullstendig tumorcelle tap i høy grad skader slik som karsinomer [26], [27], [28].
Mange studier har undersøkt rollen til NF-kB og p53-trasé henhold til patologiske tilstander, spesielt kreft [4], [29]. Aktivering av NF-kB reaksjonsvei og inaktivering av p53-reaksjonsveien blir detektert i forskjellige kreftformer. Imidlertid er det lite sannsynlig at et middel rettet mot bare en av disse veier kan være effektiv for behandling av forskjellige typer kreft, gitt kompleksiteten i tumorgenese. Flere p53-induserende kjemoterapeutika har blitt rapportert å indusere p53 og NF-kB i forskjellige typer celler [30]. Til tross for p53-indusert apoptose, er NF-kB-aktivering i stand til å fremme resistens mot apoptose. Konstituerende NF-kB aktivering har blitt rapportert i ulike kreft hos mennesker, og er også knyttet til legemiddelresistens [11].
Disse funnene tyder sterkt på at forbindelser med evnen til å undertrykke NF-kB pathway funksjon samtidig aktivering av p53 svei kan ha høyere anti-cancer effekt. Faktisk cyclin avhengig kinase (CDK) hemmer seliciclib (r-roscovitine) [31] og malaria narkotika quinacrine (QC), en 9-aminoacridine (9AA) -derivative [32], har denne doble aktiviteten og er for tiden i fase II kliniske studier som et anti-kreftmidler. QC og seliciclib er rapportert å inhibere NF-kB via hemming av Ser-536-fosforylering av p65-subenheten av NF-kB [31], [32]. Ser-536-fosforylering av p65-subenheten er en forutsetning for NF-kB aktivitet og defosforylering av dette området omdanner NF-kB inn i en ikke-aktiv form. I tillegg til denne aktiviteten, er QC stand til å aktivere p53-reaksjonsveien og indusere tumorcelledød gjennom Bcl-2-assosiert protein X (BAX) [33] og seliciclib aktivere p53 ved å hemme MDM2-p53-mediert degradering [34]. Derfor er disse stoffene presentere en lovende mulighet til å behandle kreft der begge disse banene er deregulert og Ras er konstitutivt aktiv.
I denne studien har vi identifisert små molekyl forbindelser som samtidig aktivert p53 og hemmet NF-kB ved hjelp av en fremover kjemisk genetisk tilnærming. Av disse forbindelser, N-2-indusert død av forskjellige cancercelletyper via inhibisjon av NF-kB og induksjon av p53. N-2 også hemmet tumorvekst i B16F10 melanom og LLC lungekarsinom muse-allograft-modeller. Dermed kan N-2 representerer en potensiell kjemoterapeutisk stoff med evnen til å målrette et variert utvalg av ondartede svulster.
Resultater
Identifikasjon av små molekyler som samtidig aktiverer p53 og hemme NF-kB
biblioteket ble screenet for å identifisere forbindelser som samtidig modulerer p53 og NF-kB veier. For å vurdere den følsomhet og robustheten i cellebaserte analysen før utfører HTS, bekreftet vi doseresponsprofiler i HTS-formatet ved hjelp av positiv kontroll parthenolid som blokkerer LPS-indusert NF-kB aktivitet (Fig. 1A). IC
50 verdi for parthenolide var 7,2 mikrometer, som er i overensstemmelse med en tidligere rapport [35], [36]. Optimaliseringen og miniatyrisering av HTS ble utført for å oppnå 384-brønn plate-format. Z «verdiene av de cellekulturplater ble . 0,6
C6 celler avledet fra rotte gliom bærer vill-type p53 ble anvendt for å screene biblioteket. (A) Et doseavhengig respons av NF-kB-rapportørgenet med økende konsentrasjoner av parthenolid. (B) screening av forbindelser som inhiberer NF-kB-rapportørgenet ved hjelp av biblioteket på 200.000 forbindelser. Forbindelser som inhiberte 100 ng /ml LPS-indusert rapportøraktivitet, mer enn 80% ble valgt som primær treff (n = 797). (C) Undersøkelse av de primære treff forbindelser for aktivering av p53 reportergen. Forbindelser som aktiverte p53 reporteren mer enn 3-ganger ble valgt som de siste treff (n = 9). (D) Sammendrag av HTS prosedyrer. Den totale hit ratio var ca 0,0045%.
Den første runden av HTS hjelp av NF-kB reporter genet identifisert 797 primær hits, tilsvarende en 0,4% hit ratio (Fig. 1B). Et annet HTS ble deretter utført for å vurdere evnen til disse forbindelsene 797 for å aktivere p53-rapportørgenet. Denne skjermen identifisert 9 forbindelser som tilfredsstilte studiekriteriene (Fig. 1C). Den totale hit forholdet mellom screening prosessen var 0,0045% (Fig. 1 D).
Klassifisering av bivalent lite molekyl forbindelser
De siste 9 forbindelser identifisert følgende to runder med HTS ble gruppert etter deres kjemiske struktur (fig. 2). Gruppe D inkludert 9AA-derivater, slik som 9AA og QC. De 9AA-derivatene 9AA-1 og 9AA-2 har blitt rapportert å aktivere p53 men inhibering av NF-kB er ikke blitt rapportert [33], [37]. Halvparten av de rammede forbindelser var 9AA derivater og disse forbindelsene viste god korrelasjon mellom NF-kB hemming potensial og p53-aktivering (R
2 = 0,85, Utfyllende fig. S1 A og B).
Forbindelser som forårsaket den p53 reporter mer enn tre ganger og samtidig hemmet NF-kB reporter med mer enn 80% ble inkludert i analysen (n = 9). I tillegg var 8 mindre aktive derivater med lignende struktur inkludert for struktur: aktivitetsforhold evaluering. Verdier i parentes refererer til maksimalt p53-responsive reporter induksjon i celler behandlet for 8 timer med hver forbindelse (0,4 til 25 mm). Relativ NF-kB-inhibering er presentert som prosent inhibering av NF-kB reporter i nærvær av 10 pM av hver forbindelse. De 17 forbindelser ble gruppert etter strukturelle likheten (gruppe A-D).
Konsernet Forbindelse piperlongumine (PIP) har blitt rapportert å selektivt drepe kreftceller basert på kreftspesifikke funksjoner og denne forbindelsen ble tidligere vist ved hjelp av en p53-responsive reporter analysen i U2OS osteosarkom celler [38]. Interessant, i vår skjerm, fant vi at PIP ikke bare aktiverer p53, men også er en sterk hemmer av NF-kB aktivitet (fig. 2).
Blant nye hit-forbindelser, N-2 (5-Ehyl- 3-metyl-6- (1-methly-1H-pryidin-2-ylidenmetyl) -phenanthridinium, C
23 H
23N
2, MW = 327,5) viste de mest lovende profilen. N-2 indusert p53 reporter mer enn 10 ganger og sterkt hemmet NF-kB aktivitet sammenlignet med andre nye treff i gruppe A gjennom D. Derfor valgte vi denne forbindelsen for videre analyser. QC, som nå er i kliniske forsøk for behandling av hormon-ildfast taxan resistent prostatakreft, og 9AA ble valgt som kontrollforbindelser.
N-2 hemmer NF-kB og dens nedstrøms målgener IL-6 , MCP-1, og nitrogenoksid
Sammenlignet med 9AA og QC, N-2 viste økt inhibisjon av NF-kB reporter i C6-celler når de tilsettes samtidig med 100 ng /ml LPS. IC
50 verdier av 9AA, QC, og N-2 for NF-kB-rapportørgenet var 23,8 uM, 50,4 uM og 5,9 uM, henholdsvis (fig. 3A). LPS stimulerer NF-kB-mediert nitrogenoksidproduksjon, så vel som ekspresjon av cytokiner og kjemokiner, så som IL-6 og MCP-1 [39]. Behandling av murine RAW 264.7 makrofagceller med N-2 inhiberte sterkt LPS-indusert nitrogenoksidproduksjon; IC
50 verdier av nitrogenoksidproduksjon av 9AA, QC, og N-2 var 7,8 uM 33,7 uM og 0,64 uM, henholdsvis (fig. 3B). Vi evaluerte også hemming av LPS-indusert IL-6 og MCP-1-ekspresjon i RAW 264.7-celler. N-2, og den positive kontroll parthenolid inhiberte signifikant IL-6 og MCP-1-proteinproduksjon (fig. 3C). Behandling med N-2 (1 pM) hemmet LPS-indusert fosforylering av Ser-536 av p65-subenheten av NF-kB, tilsvarende 20 uM av 9AA (Fig. 3D). Sammen N-2 sterkt hemmet NF-kB reporter og dens nedstrøms cytokin IL-6 (fig. 3B og C), en egenskap som gir en begrunnelse for kjemoresistent kreftbehandling bruker N-2.
(A ) Et doseavhengighet av NF-kB reportergen luciferaseaktivitet ble bestemt i C6-celler med økende konsentrasjoner av 9AA, QC, og N-2 (gjennomsnitt ± SD fra tre uavhengige eksperimenter). (B) Den doseavhengige inhibering av nitrogenoksid (NO) produksjon ble bestemt med økende konsentrasjoner av 9AA, QC, og N-2 i RAW 264.7-celler. Resultatene som er vist er gjennomsnitt ± SD av tre eksperimenter. (C) Nivåer av IL-6 og MCP-1 i RAW 264.7-celler etter behandling med parthenolid (Par) eller N-2 i nærvær av LPS. Hvert datapunkt representerer gjennomsnitt ± SD av fire tester. * P 0,01 av paret t-test. (D) Analyse av Ser536 fosforylering av p65-subenheten av NF-kB i RAW 264.7-celler etter behandling i 1 time med 20 uM av QC eller 1 uM av N-2 i nærvær av LPS. β-aktin ble benyttet som en kontroll lasting.
N-2 aktiverer p53 i kreftceller av diverse opprinnelse
N-2 økt total endogent p53-protein ekspresjon og ekspresjon av dens target genet p21 i A549 humane lungekreftceller og B16F10 murine melanomceller i en tids- og doseavhengig måte (fig. 4A og 4B). Aktivering av endogent p53 og p21 nådde maksimumsnivåene 8 timer etter behandling med N-2 i A549-celler, og 16 timer i B16F10-celler. N-2-indusert p53-rapportørgenet og dets endogene målgenet p21 i HCT116-celler med høyere effektivitet enn QC (fig. 4C og 4D). Aktivering av p53-responsive reporter ved 1 pM N-2 viste lignende kinetikk til 10 uM av QC eller 1 uM Dox (fig. 4E). Den maksimale effekt av Dox, N-2 og QC på p53 reporter aktivering ble observert ved 12 til 20 timer etter behandling, mens 3 pM av taxol vist topp p53 rapportøraktivitet etter 40 timer (fig. 4E). 9AA, QC, og N-2-aktiverte p53-rapportørgenet i forskjellige cellelinjer, inkludert C6, HCT116, A549, og B16F10 (fig. 4F). Maksimal p53-responsive reporter-aktivitet ble observert i celler behandlet med hver forbindelse med området 0,4 til 25 pM. (Fig. 4F). Ingen økning i p53-mRNA-ekspresjon ble funnet i respons til N-2-behandling (data ikke vist). I stedet, behandling av A549 celler med en mM N-2 for 12 timer indusert p53 fosforylering på Ser9, Ser20, og Ser46 (Fig. 4G). Men N-2 var ikke i stand til å indusere fosforylering av Ser-392 som ble fosforylert etter 9AA eller QC behandling. For å vurdere om N-2 fører til DNA-skader, undersøkte vi fosforylering av γ-H2AX på Ser139. N-2 og Dox økte nivåer av fosforylert γ-H2AX (fig. 4G og S2 Tilsetnings fig.). Vi fant ingen slik aktivitet ved 9AA og QC som tidligere rapportert [32]. Derfor er det sannsynlig at N-2 stabiliserer p53 via DNA-skade-mediert fosforylering av p53.
(A) Nivåene av endogene p53 og p21 proteinene ble undersøkt etter behandling av A549 og B16F10-celler med 1 uM av N-2. (B) Dose avhengighet av N-2 på endogene p53 og p21 proteiner. (C) Dose avhengighet av N-2 og QC på endogene p53 og p21 proteiner i HCT116-celler. (D) p53-responsive rapportøraktivitet i HCT116-celler behandlet i 12 timer med 9AA, QC, doksorubicin (Dox) eller N-2 over et område av konsentrasjoner (0,4 til 25,0 uM). (E) Aktivering kinetikken til p53-responsive rapportøraktivitet i HCT116-celler behandlet i 2-40 timer med 3 mM N-2, 3 uM av taxol, 1 uM av Dox eller 10 uM av QC. (F) Et p53 rapportøraktivitet i C6, HCT116, A549, eller B16F10-celler behandlet i 12 timer med 9AA, QC, eller N-2 over et område av konsentrasjoner (0,4 til 25 uM). Dataene er vist som den relative gangers induksjon av p53-reportergen på den mest effektive konsentrasjon av hver forbindelse. Resultatene som er vist er gjennomsnittet av tre forsøk; viser linjene standardavvik (D-F). (G) fosforylering av p53 ved forskjellige serinrester og fosforylerte histon γ-H2AX i A549-celler behandlet i 12 timer med QC (10 uM), 9AA (5 uM), Dox (1 uM) eller N-2 (1 uM).
N-2 har anti-tumor effekter
in vivo
Vi har sammenlignet neste anti-proliferativ aktivitet av 9AA, QC, og N-2 på forskjellig typer kreftceller. LD
50 konsentrasjonen for hver celletype ble bestemt etter behandling i 48 timer med 9AA, QC, og N-2 i forskjellige villtype og mutante p53-celler. N-2 viste forholdsvis høyere effektivitet enn 9AA og QC i alle cellelinjene som ble testet (Fig. 5A). Spesielt, N-2 viste den mest potente effekt hos LLC celler (LD
50 = 80 nM). Derfor valgte vi LLC celler for videre
in vivo
tester. I tillegg har vi undersøkt
in vivo
effekt av N-2 på mus B16F10 melanom celler (LD
50 = 600 nM) som melanom og lungekreft er to av de mest resistente krefttyper.
(A) sammenligning av IC
50 konsentrasjoner av 9AA, QC, og N-2 i forskjellige villtype og muterte p53-cellelinjer. Hvert punkt representerer IC
50 av en spesiell type celle, som er gruppert som følger: (
i
) sirkler, p53 villtype-cellelinjer (A549, H460, HCT116, C6, SH- SY5Y, og B16F19); og (
ii
) trekanter, p53 mutante cellelinjer (H2009, SW480, Jurkat, U937, og LLC). (B) Tidsforløp av kroppsvektendring etter behandling med N2. Feilfelt representerer SD. (C) Et anti-tumor aktivitet av N-2 og QC på B16F10 allografter. Tumor volum og en representant skåret melanom på dag 15 er vist. (D) Den antitumor-aktivitet av N-2 på LLC allografter. Tumorvolumet, utseende av allografter, og utskårne LLC tumorer ved dag 14 er vist. Feilfelt representerer SD (C-D). * Angir betydning sammenlignet med kontrollgruppen, p 0,05,
# p 0,01 med ANOVA. (E) Effekt av N-2-forankrings-uavhengig vekst i A549-celler. Hvert datapunkt representerer gjennomsnittlig ± SD for tre analyser. * P 0,05,
# p. 0,01 av paret t-test
Vi har vurdert om N-2 hadde anti-tumor effekter i mus B16F10 (melanom) og LLC allograft-modeller. Aktivatorer av p53 har vist lovende i behandling av primær uveal melanom og murine allograft modeller av okulær B16F10 celle melanom [40]. QC og N-2 hemmet veksten av tumor allotransplantater dannet ved intraperitoneal injeksjon av B16F10 melanom celler i C57 /BL6 mus. N-2 (1 mg /kg) viste lignende antitumoreffekter som 30 mg /kg QC uten betydelig vekttap (opp til 20% ved 3 mg /kg behandling av N-2, fig 5B og C.). I tillegg N-2 viste sterk effekt i en
in vivo
LLC allograft-modell (Fig. 5D). Resultatene av LLC allograft samsvarer med den mest potente
in vitro
LD
50 verdi på N-2 i LLC celler. Den midlere vekt og volum av de primære tumorer i N-2-behandlede mus var signifikant lavere enn de vehikkelbehandlede mus.
Inhibisjon av NF-kB signale indusert apoptose i p53-null lungekreftceller og inhiberte mus adenocarcinoma lunge utvikling [19], [41], [42]. For å evaluere effekten av N-2 på humane lungekreft, anvendte vi-agar-kolonidannelse analyser. NF-kB spiller en viktig rolle i forankrings-uavhengig vekst, metastase og tumordannelse i lunge carcinoma-celler, inkludert A549-celler [43]. Kolonidannelse
in vitro
generelt korrelerer med tumorigenicity
in vivo product: [44]. N-2 inhiberte sterkt kolonidannelse i en doseavhengig måte, og dens effekt er mye høyere enn 9AA og QC i A549-kolonidannelse analyser (fig. 5E).
N-2 induserer spenning responsgener
Vi visualiserer molekylær interaksjon nettverk ved å analysere forholdet mellom de forskjellig uttrykt målgener som vises i microarray analyse. Den totale nettverket viser flere interessante interaksjoner som kan kobles til p53 eller NF-kB. N-2-behandling reduserte ekspresjonen av gener relatert til cellesyklus, DNA-replikasjon, og reparasjon, men økt ekspresjon av apoptose- og cellulære stressrelaterte gener (fig. 6A og supplerende Tabell S1 og S2). Disse resultatene ble bekreftet ved hjelp RT-PCR. N-2-behandling karakteristisk indusert stress-relaterte gener, slik som DDIT3, DDIT4, SENS2, og GADD45 med samtidig nedregulering av den proliferative markør PCNA, CDK1 (CDC2), og NF-kB målgenet CCND3 (cyklin D3, fig . 6B).
(A) Interaksjon kartet degs. Totalt nettverk avslører mange interessante interaksjoner som kan kobles til p53 eller NF-kB. Noden farge representerer ganger endring (grønn, nedregulering, rød, oppregulering). (B) N-2 opp-regulerer mRNA nivåer av stress responsgener (DDIT3, DDIT4, SESN2, og GADD45a) og nedregulerer mRNA nivå av gener assosiert med spredning (PCNA og CCND3). Transkripsjonen nivået av utvalgte gener ble bekreftet med RT-PCR. * P 0,01, ** p. 0,001
Diskusjoner
transkripsjonsfaktorer p53 og NF-kB er to viktige proteiner som deregulerte i ulike kreft hos mennesker. En multi-target tilnærming kan være fremtiden for anti-kreft terapi, der medikamentresistens er et problem. I lys av dette nye molekyler som dually regulere NF-kB og p53 signal kan være spesielt viktig å vurdere potensialet terapeutisk bruk av toverdige rusmidler i ulike kreftformer [29].
Vårt skjermen på 200.000 forbindelser identifisert N- 2, til en toverdig molekyl med potensial modulere både NF-kB og p53-signalering. Sammenlignet med de tidligere rapporterte bi-målrettede medikamenter, 9AA og QC, N-2 hadde en sterkere effekt i forskjellige tumorcellelinjer. Den sterke virkning av N-2 oppvises av IC
50 Verdiene for NF-kB-formidlede produksjon av nitrogenoksid ved 9AA, QC, og N-2 (7,8 uM 33,7 uM og 0,64 uM, henholdsvis) . N-2 også indusert p53 og dets målgener ved lavere konsentrasjoner enn QC. p53-aktivering er også rapportert å inhibere LPS-indusert NF-kB-aktivering [45]. Interessant, IC
50 av N-2 for kreftceller var uavhengig av p53 genetiske status under de samme betingelsene (tabell Tilsetnings S3 og S4 fig.). Curaxins, QC og tidligere kjent p53 aktivator PIP (gruppe A) også forårsake p53-uavhengig apoptotisk død av kreft celler [46], [47]. Inhibering av NF-kB signale alene kan være effektive for behandling av lunge cancer som har Ras mutasjoner [19], [41], [48]. 9AA og QC viste heller ingen signifikant forskjell i LD
50 verdier mellom villtype og mutante p53 kreftceller (Fig. 5A og supplerende Tabell S3), som indikerer at p53-avhengig apoptose er ikke den eneste mekanisme av N-2- mediert tumor celledød. Spesielt resulterer i fig. S4 antyder at ROS virker sannsynligvis som signalmolekyler for N-2-indusert celledød, og denne prosessen er likevel funksjonell selv i fravær av p53. Således kan induksjon av ROS tilveiebringe en mulig mekanisme for N-2-indusert celledød i begge p53-villtype og mutant p53-kreftceller.
I denne undersøkelsen, fant vi at de tidligere kjente p53-aktivatorer PIP , 9AA-1, og 9AA-2 også inhiberte LPS-indusert NF-kB-aktivering (fig. 2). Den anti-inflammatoriske egenskap av den tidligere identifiserte toverdig medikament seliciclib (roscovitine) kunne forklares ved inhibisjon av NF-kB [31]. I fremtidige studier, vil det være nødvendig å evaluere den anti-inflammatoriske effekten av disse forbindelsene treff i større detalj.
Den globale genekspresjon profilerings Resultatene viste en særegen induksjon av stress-relaterte gener, slik som ATF3, DDIT3 , DDIT4, SENS2, og GADD45 (fig. 6). Det har blitt rapportert at forskjellige cellulære påkjenninger, blant annet endoplasmatiske retikulum, genotoksiske, og reaktive oksygenarter spenning, kan stabilisere det p53-protein. Effektiv induserer p53 RITA også stimulert stressgener som ATF3, DDIT3, DDIT4 og GADD45 som N-2 [49]. Den DDIT3 /CHOP gen er en komponent av det endoplasmatiske retikulum stressrespons, DDIT4 /REDD1 og SENS2 er inhibitorer av mTOR overlevelsesreaksjonsveien, og GADD45 er en kritisk spenning sensor av apoptotisk celledød av chemo-forebyggende midler. Videre ATF3, DDIT3, DDIT4, GADD45 og SESN2 er også p53-regulerte gener [50], [51], [52], [53]. Spesielt, N-2-indusert ekspresjon av mTOR inhibitorer DDIT4 og SESN2 og inhiberer fosforylering av Ser536 av p65-subenheten av NF-kB, som blir fosforylert av AKT [54]. Mekanismen av N-2-handling kan involvere hemming av AKT /mTOR og AKT /NF-kB veier. mTOR har dukket opp som en kritisk vekstkontroll node mottar stimulerende signaler fra Ras og phosphatidylinositol-3-OH kinase [55]. Resultatene av vår globale genekspresjon profilering antyder at induksjon av DNA-skade, ROS produksjon og oppregulering av stress-relaterte gener ved N-2 er sannsynligvis involvert i p53 stabilisering, sammen med inhibering av AKT /mTOR eller AKT /NF -κB overlevelse veier.
Behandling med N-2 indusert p53 fosforylering på Ser9, Ser20, og Ser46 i A549 celler. Fosforylering av disse områdene er knyttet til induksjonen av apoptose, DNA-skade, og p53 stabilitet [6], [7], [8]. Spesielt, fosforylering av p53 ved Ser20 forekommer for det meste i respons til DNA-skade og ROS induksjon [56]. Vi har bekreftet at DNA-skade ved N-2 gjennom induksjon av histon γ-H2AX fosforylering. Vi bestemte effekten av N-2 på ROS produksjon i A549 celler ved hjelp av 2 «, 7»-dichlorofluorescein diacetat (DCF-DA). Behandling av N-2 økt ROS-nivåer betydelig i A549 celler, men 9AA ikke. Positiv kontroll forbolmyristatacetat forårsaket også en økning av ROS, men N-2- forbedret ROS var mye større enn andre forbindelser (Tilsetnings fig. S3). Tatt sammen tyder disse data på at den sterke effekten av N-2 i forskjellige cancercelletyper er på grunn av kombinasjonen av mange faktorer som er rettet mot to hovedveier i tumorceller. Likheter og forskjeller mellom QC, 9AA, Dox, RITA, Nurtlin-3, β-fenyl-isotiocyanat (PEIC) og N-2 ble oppsummert i Tilleggs fig. S5.
I sammendraget, romanen lite molekyl N-2 er en bivalent kreft agent som har en sterkere effekt enn andre tidligere identifiserte små molekyler. N-2 har potensiale for behandling av forskjellige kreftformer, inkludert de som er resistente overfor eksisterende terapier. Denne studien gir også mekanistiske innsikt i den molekylære virkningsmekanismen til andre kjente p53 indusere som PIP, 9AA-en, og 9AA-2 og fremhever mulig bruk av disse forbindelsene som anti-inflammatorisk agenter.
Materialer og metoder
Cell kultur, transfections og luciferase analyser
HCT116, C6, B16F10, A549, U937 og Lewis lungekarsinom (LLC) celler ble hentet fra American Type Culture Collection og HCT116 null celler var en generøs gave fra Dr. Bert Vogel [57]. H460, H2009, SW480, Jurkat og SH-SY5Y celler ble innhentet fra koreanske cellelinje bank (Seoul, Korea). Celler ble opprettholdt i RPMI-1640 medium, supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS), 120 ug /ml penicillin og 200 ug /ml streptomycin, og ble inkubert ved 37 ° C med 5% CO
2. Transfections ble utført med Lipofectamine 2000 (Invitrogen, San Diego, CA, USA) i henhold til produsentens instruksjoner. For stabil ekspresjon av PNF-kB-Luc og pp53-Luc vektorer (Clontech, Palo Alto, CA, USA), på samme måte som transient transfeksjon ble anvendt, bortsett fra at cellene ble ko-transfektert med pcDNA3.1 (+) ved en molar forhold på 10:01. Stabile kolonier ble utvalgt med 1000 ng /ml G418 (Invitrogen, San Diego, CA, USA) og individuelle kolonier ble overført til en 24-brønns plate. For å undersøke NF-kB-mediert eller p53-medierte transkripsjonsaktiviteter, forbigående transfekterte celler og positive kloner ble evaluert ved å bruke Promega luciferase-rapportøranalysesystemet i henhold til produsentens instruksjoner (Promega, West Virginia, USA). Positive kloner ble opprettholdt i nærvær av 500 ng /ml av G418. Luciferase-signaler ble påvist ved anvendelse av et luminometer (Victor 5, Perkin Elmer Wallac, Waltham, MA, USA).
Cell-baserte high-throughput screening (HTS) for å identifisere små molekyler som samtidig aktiverer p53 og NF-KB-hemmer kB
for å screene for små molekyler som samtidig modulerer p53 og NF-kB trasé, vi generert en C6 reporter cellelinje (avledet fra rotte glioma bærer villtype p53) stabilt transfektert med p53-responsive og NF-kB -responsive luciferaserapportørplasmid gener. Den sammensatte bibliotek besto av 200.000 kjemikalier levert av Chembridge (San Diego, California, USA), ChemDiv (San Diego, California, USA), og Asinex (Moskva, Russland) kjemiske biblioteker. Til undersøkelse av disse kjemikaliene, 1 x 10
4 NF-kB rapportør celler ble sådd ut i hver brønn i en 384-brønners plastcellekulturplate i 40 ul DMEM medium inneholdende 10% FBS. Etter inkubering over natten, 0,1 ul av forbindelsene i DMSO og 10 ul lipopolysakkarider (LPS; i DMEM) ble tilsatt til hver brønn til en endelig konsentrasjon på 10 uM forbindelse og 100 ng /ml LPS. Like mengder av DMSO og parthenolid ble anvendt som negative og positive kontroller, henholdsvis. Hver prøve ble analysert i triplikat.
