Abstract
CHIP, en co-anstand protein som samhandler med Hsc /Hsp70, har G1 blitt vist å være under-uttrykkes i kreft i bukspyttkjertelen celler og har vist en potensiell tumor suppressor egenskap. Likevel, de underliggende mekanismene for CHIP regulering i kreft i bukspyttkjertelen celler forblir ukjent. I denne studien fant vi at Mir-1178 redusert oversettelsen av CHIP protein ved å målrette den 3′-UTR regionen. Vi observerte at overuttrykk av MIR-1178 tilrettelagt spredning, G1 /S overgang, migrasjon og invasjon av kreft i bukspyttkjertelen celler. Motsatt, hemming av MIR-1178 uttrykk undertrykte betydelig disse fenotyper. Videre CHIP over-uttrykk avskaffet MIR-1178-indusert celleproliferasjon og invasjon. Våre data tyder på at Mir-1178 fungerer som en oncomiR i kreft i bukspyttkjertelen celler ved å hemme CHIP uttrykk
Citation. Cao Z, Xu J, Huang H, Shen P, du L, Zhou L, et al. (2015) MiR-1178 Fremmer spredning, G1 /S Transition, migrasjon og invasjon av kreft i bukspyttkjertelen celler ved å målrette CHIP. PLoS ONE 10 (1): e0116934. doi: 10,1371 /journal.pone.0116934
Academic Redaktør: Jose G. Trevino, University of Florida, USA
mottatt: 31 juli 2014; Godkjent: 16 desember 2014; Publisert: 30 januar 2015
Copyright: © 2015 Cao et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Denne studien ble støttet med tilskudd fra Natural Science Foundation of China National (nr 81272484), Beijing Natural Science Foundation (No. 7,132,179), Major State Basic Research Development Program of China (973 Program, nr 2014CB542300), Forsknings Special Fund for offentlig velferd Industry of Health (nr 201 202 007), og National Science Teknologi Pillar Program under tolvte femårsplan Periode (No. 2014BAI09B11). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
kreft i bukspyttkjertelen er den fjerde største årsaken til kreft-relaterte dødsfall i USA [1]. Eksisterende behandlinger har liten effekt på forbedring av overlevelsen hos pasienter med kreft i bukspyttkjertelen [2-4]. Utforske de mekanismer av tumorigenesis, progresjon og metastasering av kreft i bukspyttkjertelen og identifisere nye terapeutiske mål er sterkt behov.
CHIP, en co-anstand protein som samhandler med Hsc /Hsp70 [5], fremmer ubiquitinering og degradering av en rekke viktige kreft-relaterte proteiner, slik som NF-kB [6, 7], Met [8] og p53 [9-11]. Tidligere har vi funnet at CHIP trykkes kreft i bukspyttkjertelen celleproliferasjon, forankrings-uavhengig vekst, migrering og invasjon av mediere nedbrytning av EGFR. Et lavt nivå av ekspresjon CHIP ble korrelert med en forverret prognosen hos pasienter med kreft i bukspyttkjertelen [12]. Men mekanismene for regulering av CHIP uttrykk i kreft i bukspyttkjertelen celler forblir ukjent.
microRNAs (mirnas) er små, endogene, ikke-kodende RNA-molekyler med en viktig rolle i den post-transcriptional regulering av genekspresjon [13 -16]. Guo J
et al
. [17] fant at Mir-764-5p hemmer protein oversettelse av CHIP hos mus. Men om mirnas regulere CHIP uttrykk i humane kreftceller har ikke tidligere blitt vist.
I denne studien, utførte vi en
i silico
skjermen på mirnas å identifisere mulige regulatorer av CHIP uttrykk. Vi fant ut at Mir-1178 er rettet mot 3′-UTR av CHIP mRNA og negativt regulerer oversettelse av CHIP. Videre bidrar MIR-1178 uttrykk for kreft i bukspyttkjertelen celleproliferasjon, G1 /S overgang, migrasjon og invasjon. Vi fant også at effekten av MIR-1178 er reversible ved over-uttrykk for CHIP. Våre funn tyder på at Mir-1178 uttrykk akselererer bukspyttkjertel tumorigenesis ved direkte hemming av CHIP uttrykk.
Materialer og metoder
cellelinjer og reagenser
Den menneskelige bukspyttkjertelen kreft cellelinjer BxPC-3, PANC-en, SW1990 og MiaPaCa-2 var gaver fra Dr. Freiss H (Universitetet i Heidelberg, Heidelberg, Tyskland) [18, 19]. Disse cellelinjene ble passert for mindre enn 6 måneder etter gjenoppliving. Ingen reauthorization ble utført. Cellene ble dyrket i RPMI 1640 eller Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) supplert med 10% FBS (begge typer av medium var fra HyClone, Utah, USA), 100 IU /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin i en fuktet inkubator med 5% CO
2 ved 37 ° C.
Cell transfeksjon
PANC-1 og BxPC-3-celler ble sådd ut i 6-brønns plater, dyrket over natten, og deretter transfektert med MIR-1178 etterligner, en Mir-1178-hemmer, eller deres matchede negative kontroller (alt fra GenePharma, Shanghai, Kina). Lipofectamine 2000 (Invitrogen, USA) ble anvendt for transfeksjon celle i henhold til produsentens instruksjoner. Celler ble samlet opp for videre analyser etter ytterligere 48 timers inkubering.
RNA isolering og kvantitativ sanntids RT-PCR
Total RNA ble ekstrahert fra transfekterte celler ved anvendelse av TRIzol reagens (Invitrogen, USA ) i henhold til produsentens instruksjoner. Revers transkripsjon ble utført ved anvendelse av en revers transkripsjon kit (Promega, Madison, USA). CHIP mRNA nivåer ble målt ved hjelp av kvantitativ real-time PCR (QRT-PCR) med SYBR Grønn PCR Kit (Takara, Japan). Uttrykket nivåer av modne MIR-1178 ble kvantifisert ved MIR-QRT PCR der hårnål-det miRNA qPCR Kvantitering Kit (GenePharma, Shanghai, Kina), som inneholdt en stilk-løkke-lignende RT primer og PCR primere spesifikke for de ulike mirnas eller til den U6 RNA intern kontroll. Analyser ble utført på Applied Biosystems StepOne-Plus Real-Time PCR System (Life Technologies, South San Francisco, USA). Brett endringer ble beregnet ved hjelp av to
-ΔΔCT metode. Omvendt primere for GAPDH og CHIP ble syntetisert av Invitrogen (USA). Primersekvensene er vist i tabell S1. Uttrykket av MIR-1178 ble ansett som høy når uttrykket nivået var lik eller over medianen av kohorten og lavt når nivået var lavere enn medianen av kohorten. Den QRT-PCR-analyser ble gjentatt minst 3 ganger.
Western blot analyser
Etter 48 timer med transfeksjon i 6-brønners plater ble cellene lysert med RIPA buffer (Applygen, Beijing, Kina ). Lysater ble denaturert med natriumdodecylsulfat (SDS) prøvebuffer ved 100 ° C i 5 minutter og separert ved SDS polyakrylamid gelelektroforese (SDS-PAGE), fulgt av overføring til polyvinylidendifluorid (PVDF) membraner (Millipore, MA, USA). Etter blokkering med 5% fettfri tørrmelk ved romtemperatur i 1 time, ble membranene inkubert over natten ved 4 ° C med primære antistoffer. Antistoffene er vist i Tabell S2. Etter vasking med TBST ble membranene inkubert med sekundære antistoffer (Applygen, Beijing) ved romtemperatur i 1 time. Proteinbånd ble visualisert med den elektrokjemiluminescens (ECL) deteksjonssystem, og uttrykket nivåer av proteinene ble evaluert ved hjelp av Image-Pro Plus 6.0 software (Media Cybernetics, USA). Western blot analyser ble gjentatt minst 3 ganger.
celleproliferasjonsanalyse
Celleformering ble analysert ved anvendelse av en celletall kit (CCK-8) (Dojindo, Japan). PANC-1 (4 x 10
5-celler /brønn) og BxPC-3 (5 x 10
5-celler /brønn)-celler ble transfektert i 6-brønns plater. Etter 24 timer ble cellene oppsamlet og utsådd i 96-brønners plater (1000 celler /brønn). Celleproliferasjon ble målt hver dag i 4 dager. Ved hvert tidspunkt, 10 pl /brønn CCK-8-reagens ble tilsatt, og cellene ble inkubert i 2,5 timer ved 37 ° C. Optisk tetthet (OD) ble målt ved 450 nm og 630 nm av en mikroplateleser (Wellscan MK3, Thermo Labsystems, Finland). CCK-8-analysen ble gjentatt 3 ganger med seks replikater
Cell migrering og invasjon assay
Cell migrering og invasjon ble evaluert ved bruk av Transwell migrasjons kamre (8 um porestørrelse, Corning, USA). . Membranene for invasjonen analysen ble belagt med en fortynnet ECM-løsning (Sigma-Aldrich, Shanghai, Kina). PANC-1 (2 x 10
4 celler /brønn) eller BxPC-3 (4 x 10
4 celler /brønn) celler ble sådd ut i den øvre del av et kammer med serum-fritt medium etter transfeksjon. Medium inneholdende 10% FBS tjente som en kjemoattraktant i det nedre kammer. Etter 48 timers inkubering ved 37 ° C, ble ikke-invaderte celler på toppen av membranen skrapet og fjernet av bomullspinner, og den invaderte cellene ble vasket med PBS, fiksert med 90% etylalkohol, farget med hematoksylin og deretter tellet ved hjelp av lysmikroskopi. Migrasjon og invasjon analysen ble gjentatt 3 ganger med to brønner.
Cell syklus analyse
For cellesyklus-analysen ble cellene høstet 48 timer etter transfeksjon og fiksert i 70% etanol ved 4 ° C over natten. Etter vasking to ganger med PBS, ble cellene inkubert med 30 ug /ml propidiumjodid (PI), 0,2 mg /ml RNase A, og 0,2% Triton X-100 (alle fra Sigma-Aldrich, USA) ved 37 ° C i 30 minutter. Cellene ble deretter analysert ved flowcytometri (BD Biosciences, USA).
Dual-luciferase assay
For å vurdere om CHIP er et direkte mål på MIR-1178, den pMIR-RAPPORT analysen var anvendes. Brikken 3′-UTR vektorer som inneholder vill-type eller muterte frø sekvensen ble konstruert av og kjøpt fra GenePharma (Shanghai, Kina). PANC-1-celler ble sådd på 12-brønners plater (1 x 10
5-celler /brønn) og ko-transfektert med vill-type eller mutert vektor og 50 nM MIR-1178 etterligner eller NC ligner ved hjelp av Lipofectamine 2000. Ved 24 timer etter transfeksjon, ble luciferase aktivitet målt ved hjelp av Dual-luciferaserapportørplasmid analysesystem (Promega, USA) i henhold til produsentens protokoll.
Statistisk analyse
SPSS v. 13.0 programvare (SPSS, Inc., Chicago, IL) ble brukt for statistiske analyser. Kontinuerlige data er presentert som gjennomsnitt ± standard avvik (SD) og ble sammenlignet ved Students t test eller Fishers eksakte test.
P
0,05 ble ansett som statistisk signifikant.
Resultater
CHIP er et direkte mål på MIR-1178
For å identifisere regulatorer av CHIP uttrykk, ble det åpen tilgang til programvare TargetScan brukt. Ifølge prediksjon av TargetScan ble MIR-1178 identifisert som en mulig regulator av CHIP uttrykk. Vi fant ut at Mir-1178 uttrykk varierte mellom 4 menneskelige bukspyttkjertelen kreft cellelinjer, inkludert SW1990, BxPC-3, MiaPaCa-2, og PANC-en, hvor den relative uttrykket nivået av MIR-1178 var 0,568 ± 0,12, 1,04 ± 0,05, 1,51 ± 0,07 og 0,87 ± 0,09, henholdsvis (figur 1A;.
P
0,01). De PANC-1 og BxPC-3 celler, som hadde moderat uttrykk for MIR-1178, ble brukt gjennom resten av studien.
(A) MiR-1178 uttrykk varierte mellom 4 menneskelige bukspyttkjertelen kreft cellelinjer. (B) A Mir-1178 bindingssete i 3′-UTR av CHIP ble spådd av TargetScan. (C) På PANC-1-celler, MIR-1178 etterligner trykt luciferaseaktiviteten av reporterinneholdende villtype CHIP 3′-UTR, men ikke den som inneholder en mutant 3′-UTR. (D) Uttrykket nivåer av CHIP ble oppdaget av western blot etter PANC-1 og BxPC-3-celler ble transfektert med Mir-1178 etterligner eller hemmer. β-aktin ble benyttet som en intern kontroll. (E) Transfeksjon med Mir-1178 ligner ikke undertrykke mRNA uttrykk for CHIP. Dataene er vist som gjennomsnitt ± SD. *
P
P
For å finne ut om CHIP er et direkte mål på MIR-1178, 3′-UTR av CHIP med villtype eller mutante frø sekvens gjenkjenningsseter ble klonet inn i en dual-luciferase reporter (fig. 1B). Vi fant at luciferaseaktivitet ble redusert etter ko-transfeksjon av de MIR-1178 etterligner med vill-type vektor, sammenlignet med ko-transfeksjon av de MIR-1178 etterligner med det mutante vektoren (
P
0,05 ) (fig. 1C). Vi evaluerte videre mRNA og proteinnivåer CHIP etter endring MIR-1178 uttrykk. Resultatene viste at over-ekspresjon av MIR-1178 signifikant redusert CHIP protein ekspresjon uten å påvirke CHIP mRNA-ekspresjon, sammenlignet med kontrollen. I motsetning til dette, nedregulering av MIR-1178 øket CHIP protein ekspresjon (Fig. 1D, E). Disse dataene indikerer at Mir-1178 kan direkte rettet mot den antatte CHIP frø regionen.
MiR-1178 fremmet vekst og G1 /S overgang fra PANC1 og BxPC-3 celler
For å utforske funksjon av MIR-1178 i kreft i bukspyttkjertelen, ble Mir-1178 ligner og MIR-1178 inhibitor brukes. Etter transfeksjon med Mir-1178 etterligner eller hemmer, uttrykket av MIR-1178 var signifikant oppregulert eller nedregulert, henholdsvis (figur 2A.). En CCK-8-analysen viste at spredningsrater PANC-1 og BxPC-3 celler ble økt etter MIR-1178 over-uttrykk. I motsetning til dette, MIR-1178 nedregule inhiberte proliferasjonen av kreft i bukspyttkjertelen celler (Fig. 2B). Videre oppregulering av MIR-1178 fremmet G1 /S sjekkpunkt overgang i både PANC-1 (S-fasen 30,17 ± 1,31% vs 39,31 ± 1,51%,
P
0,01) og BxPC- 3 (S fase 29,89 ± 1,56% sammenlignet med 42,57 ± 3,74%,
P
0,05) celler, mens den nedregulering av MIR-1178 førte til en forlengelse av G1 fase (fig. 2C) .
(A) QRT-PCR viste at etter trans celler med Mir-1178 etterligner eller hemmer, uttrykket av MIR-1178 var signifikant oppregulert eller nedregulert, henholdsvis. (B) A CCK-8-analysen viste at MIR-1178 overekspresjon fremmet spredning av PANC-1 og BxPC-3-celler, mens den nedregulering av MIR-1178 trykkes celleproliferasjon. (C) Den oppregulering av MIR-1178 lettet G1 /S overgang i PANC-1 og BxPC-3-celler. I motsetning til dette ble et G1 /S cellesyklus-stans observert etter MIR-1178 inhibering. Dataene er presentert som gjennomsnitt ± SD. *
P
P
0. 01.
MiR-1178 akselerert kreft i bukspyttkjertelen celle migrasjon og invasjon
En transwell analysen ble utført for å bestemme hvilken rolle MIR-1178 i bukspyttkjertelkreft celle migrasjon og invasjon. Den over-uttrykk for MIR-1178 økte antall PANC-1 celler som penetrerte ECM-belagt membran. I motsetning til dette ble det invasivitet av PANC-1-celler signifikant redusert når MIR-1178 ekspresjon ble undertrykt. Lignende resultater ble funnet i BxPC-3-celler (fig. 3A). I overensstemmelse med dette funn var trekk evnene til disse to cellelinjene også forbedret etter at cellene ble behandlet med MIR-1178 etterligner, mens de motsatte resultater ble observert når cellene ble behandlet med en MIR-1178 inhibitor (fig. 3B ).
Cell migrasjon og invasjon ble analysert i membranholdig transwells uten eller med Matrigel. Celler som hadde migrert eller invadert til den nedre overflate av membranen ble farget med hematoksylin og eosin og tellet under et mikroskop ved 100 x forstørrelse. (A) oppregulering av MIR-1178 ved transfeksjon av de etterligner forbedrede celle invasjon, mens MIR-1178 nedregule hindret celle invasjon. (B) Over uttrykk for MIR-1178 fremmet celle migrasjon, mens nedregulering av MIR-1178 hemmet celle migrasjon. *
P
P
0.01.
Nedstrømssignalveier fra Mir-1178
I vår forrige undersøkelse, viste vi at CHIP er en roman tumor suppressor i bukspyttkjertelkreft via nedbrytning av EGFR. Gitt vår observasjon at Mir-1178 nedregulert uttrykk for CHIP, hypotese vi at Mir-1178 kan også regulere aktiviteten av EGFR og dens nedstrøms signalkaskade. Vi fant at overuttrykk av MIR-1178 økte EGFR protein nivå og aktivert nedstrøms AKT /p21 sti og Src /E-cadherin pathway (fig. 4A). I motsetning til inhibering av MIR-1178 hadde den motsatte effekter (Fig. 4B). Mange studier har indikert at EGFR /AKT /p21 og EGFR /SRC /E-cadherin trasé spiller sentrale roller i spredning, cellesykluskontroll, migrasjon og invasjon av kreft i bukspyttkjertelen celler [20-23]. Dermed spekulert vi at ektopisk aktivering av EGFR /AKT /p21 og EGFR /SRC /E-cadherin trasé kan delvis forklare de effektene av MIR-1178 i kreft i bukspyttkjertelen celler.
(A, B) uttrykket nivåer av EGFR, p-AKT, AKT, p21, p-SRC SRC og E-cadherin ble oppdaget av western blot etter PANC-1 og BxPC-3-celler ble transfektert med Mir-1178 etterligner eller hemmer. β-actin ble brukt som en intern kontroll.
Over-uttrykk for CHIP avskaffet MIR-1178-indusert spredning, G1 /S overgang, migrasjon og invasjon av kreft i bukspyttkjertelen celler
for ytterligere å verifisere om MIR-1178 fremmer en ondartet fenotype ved å undertrykke CHIP i kreft i bukspyttkjertelen celler, vedtok vi en «redde» strategi for å undersøke den funksjonelle relevansen av MIR-1178 /CHIP interaksjon. Den pcDNA-CHIP eller pcDNA tom vektor ble transfektert inn PANC-1 celler over-uttrykker Mir-1178. Som vist på fig. 5A, nivået av CHIP ble øket når pcDNA-CHIP ble transfektert. Videre er det over-ekspresjon av CHIP inhiberte MIR-1178-indusert ekspresjon av EGFR, p-AKT og p-SRC. Etter avtale med inaktivering av EGFR og nedstrøms trasé, celle invasjon, migrasjon (fig. 5B), spredning (Fig. 5C) og G1 /S overgang (Fig. 5D) var alle undertrykte. Disse resultatene indikerer at MIR-1178 fremmer celle proliferasjon, G1 /S overgang, migrering og invasjon gjennom nedregulering av CHIP.
(A) Western blot-analyse av CHIP, EGR, AKT, P21, SRC og E-cadherin uttrykk i PANC-1 celler som var co-transfektert med enten pcDNA-CHIP eller pcDNA tom vektor og Mir-1178 etterligner. β-actin ble også detektert som en intern kontroll. (B) Transwell analyse av PANC-1-celler etter at begge ko-transfeksjoner. (C) Vekstkurver av PANC-1-celler etter ko-transfeksjon. (D) Prosentandelen av celler i hver fase av cellesyklusen ble beregnet ved fluorescens-aktivert cellesortering (FACS) analyse. *
P
0. 05, **
P
0. 01.
Diskusjoner
I denne studien, viste vi at Mir-1178 målrettet 3′-UTR av CHIP mRNA, som resulterer i hemming av CHIP protein oversettelse. MiR-1178 tilrettelagt bukspyttkjertelkreft celleproliferasjon, G1 /S overgang, migrasjon og invasjon av undertrykke CHIP uttrykk. Vi konkluderer med at MIR-1178 er en endogen demperen av CHIP uttrykk som fremmer en ondartet fenotype i kreft i bukspyttkjertelen celler.
karboksylsyreenden Hsp70-samspill protein (CHIP) er medlem av E3 ubiquitin ligase, fungerer som en kobling mellom anstand (heat shock protein 70/90) og proteasomer systemer. CHIP har vist seg å være involvert i tumordannelse, spredning, og invasjon i flere ondartede sykdommer [24], som regulerer et antall onkogene proteiner, inkludert hypoksi-induserbar faktor 1α (HIF-1α) [25], østrogenreseptor-α (ERα) [ ,,,0],26], og human telomerase revers transkriptase [27]. Vi har tidligere funnet at CHIP fungerte som en roman tumor suppressor ved å nedregulere EGFR sti i kreft i bukspyttkjertelen celler. Uttrykket av CHIP ble redusert i bukspyttkjertelkreft vev [13]. Men mekanismen av CHIP lav-uttrykk fortsatt behov for flere undersøkelser.
Selv om økende bevis har vist at CHIP spiller en viktig rolle i kreft [6, 28-30], mekanismene for CHIP regulering forble dårlig forstått. Frem til nå, var det bare to publiserte studier fokusert på mekanismene for oppstrøms regulering av CHIP. Shimamoto S
et al
. [31] rapporterte at Ca (2 +) /S100 binder seg til TPR domene og fungere som oppstrøms regulatorer av CHIP. Guo J
et al
. [17] har vist at MIR-764-5p trykt CHIP proteintranslasjon i mus ved binding til den 3′-UTR av brikken mRNA. Men om mirnas kunne regulere CHIP-ekspresjon i humane cancerceller har ikke tidligere blitt bestemt. Vår miRNA skjermen ved hjelp TargetScan programvare spådd at CHIP kan være en av de nedstrøms målene fra Mir-1178. For å bekrefte denne spådommen, utførte vi en luciferase reporter analysen. Vi fant at luciferaseaktivitet ble dramatisk redusert etter ko-transfeksjon av de MIR-1178 etterligner med vektoren som uttrykker villtype CHIP 3′-UTR, sammenlignet med ko-transfeksjon av de etterligner med den vektor som uttrykker en mutert CHIP 3′-UTR . Western blot-analyse videre vist at overekspresjon av MIR-1178 trykkes CHIP proteinekspresjon. I motsetning til nedregulering av MIR-1178 økte CHIP proteinnivå. Disse resultater antyder at MIR-1178 er rettet direkte 3′-UTR av CHIP mRNA for å hemme CHIP proteintranslasjon. Så vidt vi vet, var dette første gang at en miRNA som kan hemme uttrykket av CHIP protein ble oppdaget i humane cellelinjer.
Økende bevis har vist at mirnas kan ha både svulst undertrykkende [32-34 ] og onkogene [35, 36] egenskaper i kreft i bukspyttkjertelen celler. Men fokuserer studiene på funksjonene til Mir-1178 er ikke rapportert. I vår tidligere studie [12], fant vi at CHIP trykt kreft i bukspyttkjertelen celleproliferasjon, migrasjon og invasjon. Vi har derfor en hypotese om at Mir-1178 kan indusere kreft i bukspyttkjertelen cellevekst, migrasjon og invasjon. Denne hypotesen ble støttet av våre observasjoner. Våre data viser at Mir-1178 overuttrykk tilrettelagt bukspyttkjertelkreft celleproliferasjon, G1 /S overgang, migrasjon og invasjon. I motsetning til inhibering av MIR-1178 trykkes disse prosessene. Våre resultater tyder på at MIR-1178 virker som en oncomiR løpet av kreft i bukspyttkjertelen tumorigenesis for første gang.
Pankreascancer viser en rekke forskjellige molekylære endringer som fører kreftceller, ikke bare til å overleve, men også for å invadere omgivende vev og metastasise å fjerne områder. Den vanligste endringen medfører den epidermale vekstfaktor-reseptor (EGFR) genet. Li Y
et al
. [37] viste at Mir-146a hemmet invasiv kapasitet på PDAC celler ved direkte rettet av EGFR. Croce CM [38] rapporterte at Mir-21 stimulert EGFR sti og økt vekst av PDAC celler uavhengig av PTEN degradering. Fordi vår tidligere studie viste at CHIP er en roman post-translasjonell regulator av EGFR [12], begrunnet vi at Mir-1178 kan også regulere aktiviteten av EGFR og dens nedstrøms signalkaskade. I denne studien viste vi at Mir-1178 overuttrykk økte EGFR protein nivå og aktivert nedstrøms AKT /p21 sti og Src /E-cadherin veien. I motsetning til inhibering av MIR-1178 hadde den motsatte virkning. Aktiveringen av AKT /p21 og Src /E-cadherin signalering har blitt rapportert å være involvert i proliferasjon, cellesykluskontroll, migrering og invasjon av kreft i bukspyttkjertelen celler [20-22, 28]. Disse resultatene indikerer at ektopisk aktivering av EGFR /AKT /p21 og EGFR /SRC /E-cadherin trasé kan delvis forklare de effektene av MIR-1178 i kreft i bukspyttkjertelen celler.
For å verifisere om MIR-1178-funksjoner som en oncomiR ved å undertrykke CHIP, ble en «redde» strategi vedtatt å undersøke den funksjonelle relevansen av MIR-1178 /CHIP interaksjon. Våre resultater viste at over-ekspresjon av CHIP inhiberte MIR-1178-indusert ekspresjon av EGFR, p-AKT og p-SRC. I samsvar med inaktiveringen av EGFR og nedstrøms trasé, celleproliferasjon, G1 /S overgang, migrering og invasjon ble også redusert. Dermed konkluderte vi med at det oppregulert EGFR sti og tilrettelegging av tumorigenesis av MIR-1178 kan skyldes redusert CHIP uttrykk i kreft i bukspyttkjertelen celler.
Generelt
in vitro
data er ikke tilstrekkelig for å gjøre klinisk relevante slutninger i bukspyttkjertelkreft [39], spesielt når det gjelder sammenhengen mellom MIR-1178 uttrykk og clinicopathological funksjoner. I vår videre studier, vil vi undersøke de biologiske funksjonene i MIR-1178 i PDX (pasient avledet xenoimplantater) av kreft i bukspyttkjertelen. I tillegg vil vi behandle uttrykket av MIR-1178 i vev av kreft i bukspyttkjertelen for å undersøke sammenhengen mellom MIR-1178 uttrykk og kliniske karakteristika for pasienter med kreft i bukspyttkjertelen.
Konklusjon
I konklusjonen , denne studien viste at MIR-1178 markedsført bukspyttkjertelkreft celleformering, G1 /S overgang, migrering og invasjon gjennom nedregulering av CHIP. Våre data tyder på at MIR-1178 er en endogen attenuator av CHIP som forenkler bukspyttkjertelen tumorigenesis. Så vidt vi vet, er denne studien den første til å demonstrere regulering av CHIP uttrykk av miRNA i humane kreftceller og avklare funksjon av MIR-1178 i bukspyttkjertelkreft. Våre resultater tyder på at Mir-1178 kan tjene som en roman terapeutisk mål for miRNA basert terapi i kreft i bukspyttkjertelen.
Hjelpemiddel Informasjon
S1 Table. Primersekvensene for GAPDH og CHIP
doi:. 10,1371 /journal.pone.0116934.s001 plakater (XLS)
S2 Table. De primære antistoffer for western blot analyse
doi:. 10,1371 /journal.pone.0116934.s002 plakater (XLS)
