Abstract
jernnivå har vært assosiert med kreftutvikling hos mennesker. Intraperitoneal administrering av treverdig nitrilotriacetat initierer en Fenton reaksjon hos nyre proksimale tubuli av gnagere som til slutt fører til en høy forekomst av nyrecellekarsinom (RCC) etter gjentatte behandlinger. Vi utførte høy oppløsning microarray komparativ genomisk hybridisering å identifisere egenskaper i de genomiske profiler av denne oksidativt stress-indusert rotte RCC. Resultatene viste omfattende storskala genomiske forandringer med en preferanse for delesjoner. Slettinger og presiseringer var mange og noen ganger fragmentert, viser at en Fenton reaksjon er en årsak til slike genomisk endringer
in vivo
. Frekvens plotting indikerte at to av de mest endret loci tilsvarte en
Cdkn2a Twitter /
2b
sletting og en
Met
forsterkning. Tumor størrelser ble proporsjonalt forbundet med
Met
uttrykk og /eller forsterkning, og clustering analyse bekreftet våre resultater. Videre har vi utviklet en prosedyre for å sammenligne hele genomisk mønstre av kopitall endringer mellom ulike arter basert på kromosom syntenic forholdet. Mønstre av rotte RCC viste den sterkeste likhet med de menneskelige RCC mellom fem typer kreft hos mennesker, etterfulgt av menneskelige ondartet mesothelioma, en jernoverskudd-assosiert kreft. Derfor forårsaker en jern-avhengig Fenton kjemisk reaksjon i stor skala genomiske forandringer i løpet av karsinogenese, noe som kan resultere i forskjellige genomiske profiler. Basert på egenskapene til omfattende genom endringer i menneskers kreft, våre resultater tyder på at denne kjemiske reaksjonen kan spille en viktig rolle under menneskelige kreft
Citation. Akatsuka S, Yamashita Y, Ohara H, Liu YT, Izumiya M Abe K, et al. (2012) Fenton Reaksjon indusert kreft i villtype Rats rekapitulerer Genomisk Endringer Observert i Human Cancer. PLoS ONE 7 (8): e43403. doi: 10,1371 /journal.pone.0043403
Redaktør: Kamaleshwar Singh, Texas Tech University, USA
mottatt: 2 mars 2012; Godkjent: 19 juli 2012; Publisert: 29. mars 2012 |
Copyright: © Akatsuka et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet av Princess Takamatsu Cancer Research Fund (10-24213); en Grant-in-Aid for kreftforskning fra Helsedepartementet, Arbeids- og velferds av Japan; og en Grant-in Aid fra departementet for utdanning, kultur, sport, vitenskap og teknologi i Japan. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Kreft er en sykdom av akkumulert genomisk endringer, antagelig forårsaket av en systematisk prosess under cellular skade og reparasjon. Forårsakende midler for karsinogenese er mange, blant annet γ-stråling, ultrafiolett stråling, inflammasjon, kjemikalier og jern overbelastning [1]. Genomiske data fra en rekke humane kreftformer er for tiden analysert enten med matrisebaserte komparativ genomisk hybridisering (CGH) [2] eller neste generasjons sekvensering [3], [4]. Disse prosjektene er utført for å finne årsaks genmutasjoner som vil føre til identifisering av nye kjemikalier eller antistoffer rettet for interaksjoner av ansvarlige signalmolekyler. Dette arbeidet forventes å resultere i utviklingen av effektive medikamenter. Imidlertid er kreftforebygging i dagliglivet like viktig som sin terapi.
I denne studien har vi søkt å løse roller av jern-mediert oksidativ stress under kreftutvikling ved hjelp av matrise-basert CGH. Oksidativt stress er konstitutivt skyldes metabolismen av molekylært oksygen, [5], men er i hovedsak regulert av forskjellige antioksidant systemer. Imidlertid, i en rekke patologiske tilstander, oksidativt stress belastninger overskrider antioksidant kapasitet [6]. Jern er det mest tallrike av tungmetaller i pattedyr, slik som gnagere og mennesker. Mens jern er nødvendig for oksygentransport som en del av hemoglobin, og overskudd av jern blitt forbundet med kreft [7], [8], antagelig via en Fenton reaksjon [9]. Ioniske former av jern er knapt løselig ved en nøytral pH-verdi, men treverdig nitrilotriacetat (Fe-NTA), et jernchelat, er oppløselige ved pH 7,4 og er en effektiv katalytisk middel for Fenton reaksjonen [10]. I 1980-årene, vår gruppe etablert som gjentatte intraperitoneale administrasjoner av Fe-NTA indusere en høy forekomst av nyrecellekreft (RCC) hos gnagere [11], [12]. Senere viste vi at nyreskade skjer gjennom en Fenton reaksjon med en rekke hydroksylradikal-mediert kjemiske produkter, slik som 8-hydroksy-2′-deoksyguanosin [13], [14] og 4-hydroksy-Nonenal [15] [16]. Det er fastslått at et jernoverskudd i mange patologiske tilstander som er assosiert med tilstedeværelse av katalytisk jern [17], [18].
Følgelig ved å evaluere hele genomet av RCC, kunne finne et generelt prinsipp for genomisk endringer i henhold til oksidativt-stressede forhold. Vi rapporterte en
Cdkn2a /2b
sletting bruker mikroanalyse i denne modellen [19]. I denne studien evaluerte vi hele genomet av Fe-NTA-induserte rotte RCC og deres cellelinjer ved hjelp av matrisebaserte CGHs. Videre har vi transformert dataene inn en menneskelige genom gjennom kromosom syntenic forhold og analysert foreningen.
Resultater
Genome-wide Utsikt mot DNA-kopi Antall Endringer i Fe-NTA-indusert Rat RCC
Fifteen rotte RCC DNA-prøver, som inkluderte 13 primærtumorprøver og 2 cellelinje prøver, ble hybridisert på Agilent oligonukleotid mikromatriser for CGH med 181978 genomisk loci (GEO tiltredelse: GSE36101). Sammenligning av forskjellige rekkebaserte CGH profiler på en kvantitativ måte er vanskelig. En endring i gjennomsnittlig kopiantallet er forårsaket av polyploidi og forurensning av normale celler. Derfor har vi utviklet en statistisk metode som vurderer disse faktorene for å anslå kromosomkopiantall (Methods S1). I denne utredningen, er matrise-basert CGH profilerte dataanalyser basert på de estimerte kopiantall ved hjelp av denne metoden.
Array-basert CGH profilering avslørt at genomer av Fe-NTA-indusert rotte RCC er ofte komplekse og har mange omfattende kromosom forandringer (fig. 1A og S1). En hel genom frekvensanalyse med 15 prøver identifiserte vendende regioner av et eksemplar nummer avvik i Fe-NTA-indusert RCC (Fig. 1B). Kopier nummer avvik ble bestemt basert på fordelingen av log2 ratio verdiene som ble omregnet med estimert antall kopier for et sett med 13 primærsvulster og 2 cellelinjer (fig. S2). I denne fordelingen ble terskler som representerte gevinst og tap valgt på ± 0,377. En terskel som representerer amplifisering ble valgt på 0,811, mens en homozygot delesjon (fullstendig tap) ble tildelt til den posisjon hvor kopitallet ble estimert som 0. Det mest karakteristiske trekk globale avdekket ved frekvensanalysen var en predisposisjon for å miste en stor utstrekning bred region av kromosomer, spesielt for kromosomer 3, 5, 6, 8, 9, 14, 15, 17 og 20. Den andre funksjonen var en hyppig forsterkning over en lang pericentromeric region på kromosom 4.
(A) representative arraybaserte CGH profiler fra to RCC svulster. De røde linjer viser log2 forhold mellom det estimerte kopiantallet over utledede kreft ploiditet versus den genomiske posisjon for alle de CGH microarray prober. (B) Frekvensfordeling av kopinummer avvik over hele rotte genom. De relative frekvenser av forsterkning (mørk rød), forsterkning (tomat), tap (grønn gul) og homozygot delesjon (mørkegrønn) innen 13 RCC-tumorer og to RCC-cellelinjer er plottet ved hver genomisk posisjon. To kreftrelaterte loci,
Met Hotell og
Cdkn2a
, som ble hyppigst rammet av kopi antall avvik er angitt med pilene.
Hyppig kromosom tap i Rat kromosom 5 og Homozygot sletting på
Cdkn2a /2b
Locus
kromosom 5 gikk en omfattende tap i kopiantall, ikke mindre enn i andre kromosomer (f.eks kromosomer 6, 8 og 20 ) (fig. 1B). Som det er relatert til omfattende tap, ble homozygot slettinger oftest observert på
Cdkn2a /2b
locus på kromosom 5 (Fig. 2A). Dette vanligvis slettet regionen inkludert to loci (
Cdkn2a Hotell og
Cdkn2b
) for tre forskjellige tumorsuppressorgener (
p16 Hotell og
p19
i
Cdkn2a
;
p15
i
Cdkn2b
) (figur 2B).. Nedleggelse av
p16 /p19 Hotell og
p15
mRNA uttrykk ble bekreftet i prøvene som inneholdt en homozygot delesjon på
Cdkn2a /2b
locus (fig. 2C og 2D) . I prøver med en hemizygous sletting på
Cdkn2a
locus (dvs. FB32-4, FB28-7),
p16 Hotell og
p19
uttrykk ble nedregulert, antagelig fordi promoter-regioner av de gjenværende alleler ble metylert. Men noen av prøvene med enten en hemizygous eller ingen sletting (f.eks FB14-3, BF51-1, FB14-6, FB30-5 og FB33-7) viste en markant overekspresjon av
p16 Hotell og
P19
.
(A) Stolpediagrammet diagrammet~~POS=HEADCOMP representerer regionene kromosom tap (grønn gul) og homozygot delesjon (mørk grønn) sammen kromosom 5 for 13 RCC svulster og to RCC cellelinjer. Den vertikale røde linjen på bakgrunn indikerer plasseringen av
Cdkn2a
locus. (B) Forstørret visning av stolpediagrammet sentrert på
Cdkn2a /2b
loci. De genomiske regioner i alle RefSeq gener som inngår i det viste området av kromosomet er avbildet som vertikale striper på bakgrunnen. (C) Expression analyse av
Cdkn2a product: (
p16
Ink4a Hotell og
p19
Arf
) for 13 RCC svulster og to RCC cellelinjer, ved hjelp av real -time PCR med spesifikke primerpar for hver forskjellig karakterutskrift. Verdiene på
y
-aksen viser relativ mRNA uttrykk nivå i forhold til et gjennomsnitt av de i normale nyrer av tre kontrollrotter. (D) Expression analyse av
Cdkn2b product: (
p15
Ink4b
) for 13 RCC svulster og to RCC cellelinjer ved real-time PCR. Verdiene på
y
-aksen viser relativ mRNA uttrykk nivå i forhold til et gjennomsnitt av de i normale nyrer av tre kontrollrotter.
Hyppige Amplifikasjoner Over den Pericentromeric regionen kromosom 4 og Amplification på
Met
Locus
over en lang del av pericentromeric regionen i kromosom 4, ble det observert hyppig kopiantall gevinst og forsterkning (fig. 1B). Genomisk forsterkning og genekspresjon i de tilsvarende områder av kromosom 4 var for det meste proporsjonal (fig. S3). En bar tomt på det forsterkede regionen langs pericentromeric regionen i kromosom 4 avslørte at
Met
onkogen ligger i den mest vanlige overlapp genomisk delen (fig. 3A). Den mest overlappende seksjon med en lengde på omtrent 222 kb besto av et forsterket område i 11/15 prøver og inneholdt bare ett RefSeq-utvalgt-genet (
Met
) (Fig. 3B). En større enn 5 ganger økning i
Met
mRNA ekspresjon ble observert i 6 prøver blant de 9 svulster som inneholdt en genomisk forsterkning av
Met plakater (fig. 3C).
(A) Stolpediagrammet diagrammet~~POS=HEADCOMP representerer forsterknings områder langs en 65 Mb pericentrometic region av kromosom 4 for 13 RCC svulster og to RCC cellelinjer. Fire grader av forsterkning er angitt med bar fargegradering; Jo mørkere rød, jo større amplitude. (B) En forstørret visning av søylediagrammet ovenfor viser nærheten av de mest overlapping regionen. De genomiske regioner i alle RefSeq gener som inngår i det viste området av kromosomet er avbildet som loddrette streker i bakgrunnen. (C) Expression analyse av
Met
for 13 RCC svulster og to RCC cellelinjer ved real-time PCR. Verdiene på
y
-aksen viser relativ mRNA uttrykk nivå i forhold til et gjennomsnitt av de i normale nyrer av tre kontrollrotter.
Sammen om kromosomavvik på disse to kreft -relaterte loci, hver undersøkt karsinom inkludert de to cellelinjene inneholdt enten
Met
forsterkning eller
Cdkn2a /2b
sletting (tabell 1, fig. 2B og 3B). Andre vanlige genetiske endringer er oppsummert i tabell S1 (20 slettede gener, vanlig i 2-4 RCC svulster) og tabell S2 (340 forsterkede gener, vanlig i 2-9 RCC tumorer). Blant dem
Zbtb38
forsterkning ble bekreftet for overekspresjon (Fig. S4).
Tumor Størrelse Fe-NTA-indusert RCC er regulert av genetiske egenskaper
undersøkte sammenhengen mellom genetiske endringer og ulike RCC trekk inkludert de oppsummert i tabell 1. blant alle relasjoner undersøkt,
Met
uttrykk og tumorstørrelse ble proporsjonalt forbundet (fig. 4A). Videre er en hierarkisk gruppering av tumorer basert på hele mønstre av kromosomale endringer viste at en gruppe av store tumorer (dvs. FB7-7, FB30-5 og FB33-7) tilsvarte en distinkt klynge (Fig. 4B). Derfor en svulst egenskap, størrelse på den tiden svulsten var klinisk åpenbar, var assosiert med hele arraybaserte CGH profiler.
(A)
Met
uttrykk er signifikant korrelert med tumorstørrelse . Pearsons korrelasjonskoeffisient (r) og den tilsvarende P-verdi er skrevet på tomten området. (B) Hierarkisk clustering av RCC svulster basert på hele genom mønstre av kopinummerendringer. De store størrelse svulster danner en distinkt klynge.
Sammenligning av kopiantall til endringer Profiler i Cancer genomer mellom rotter og mennesker
For å finne ut det generelle prinsippet om store genomisk endringer i kreft over pattedyrarter, sammenlignet vi kreft genomer fra rotter og mennesker som et helt spekter av kromosom endringer. Først forvandlet vi rotte matrise-baserte CGH profiler på menneskelige kromosomer ifølge en synteny mellom de to artene. Deretter sammenlignet vi hele mønstre basert på estimerte kopiantall ved hjelp av flerdimensjonale data analysemetoder. Vi fant at Fe-NTA-indusert rotte RCC var mest lik den humane RCC, etterfulgt av human ondartet mesothelioma (fig. 5A og 5B).
(A) Et fargeflekk representerer en likhetsmatrise på tvers av rotte RCC og ulike kreft hos mennesker. rRCC, rotte nyrecellekarsinom; hPDAC, human pancreatic ductal adenokarsinom; hTALL, human T-celle akutt lymfoblastisk leukemi; hGBM, human glioblastoma multiforme; hRCC, human nyrecellekreft. (B) Numerisk oppsummering av likhetsmatrisen. Nummeret i hver firkant angir en gjennomsnittsverdi på likheten indeks (definert mellom -1000 og 1000). Se i Materialer og metoder for detaljer.
Diskusjoner
I denne studien rapporterer vi for første gang analyser av hele data fra matrise-basert CGH brukes på en Fenton kjemi-indusert karsinogenese i en rotte nyre modell [20]. Vi fant at oksidativt stress fører til omfattende genomiske forandringer i den induserte kreft genomet på kromosomalt nivå (Fig. 1A). Det er vel kjent at et flertall av humane maligne faste tumorer besitte gevinster eller tap i flere kromosomer [21], [22], og forsterkningen kan være et egnet mål for cancerkjemoterapi. Under kreftfremkallende prosessen med slike svulster, blir kromosom ustabilitet tenkt å bidra som en drivende faktor [23]. Blant gnager karsinogenisitetsstudier modeller vill-type, men noen modeller rapportere ved hjelp av primærtumorprøver omfattende genetiske endringer på grunn av kromosom ustabilitet [24], [25]. Stråling-induserte muse-malignt lymfom [26] og muse-lunge adenokarsinom indusert av 4- (methylnitrosamino) -1- (3-pyridyl) -1-butanon, et karsinogen til stede i tobakksrøyk [27], viste noe mer grove kromosomale avvik enn de tilsvarende spontane svulster, riktignok lav oppløsning i rapporten (bakteriell kunstig kromosom [BAC] rekke ~6,500). De fakta som styrer rotter utviser ingen RCC [11], [12] og Fe-NTA-indusert rotte RCC modell viser en likeverdighet til kreft hos mennesker i genomiske forandringer på kromosomnivå sterkt støtte ideen om at dette karsinogenisitetsstudier modellen etterligner en faktisk kreftfremkallende prosess i disse menneskene som mangler sterke kreft mottakelighet trekk.
Omvendt mus med flere genetisk modifiserte kreftassosierte gener viser genetisk endring av denne typen [28]. Vi tror at disse eksperimenter samsvarer med en etablert mutator fenotype [29], og dermed til den kreftfremkallende prosess hos mennesker som har sterke cancer susceptibility egenskaper som Li-Fraumeni syndrom (
p53
) [30] eller melanoma slekter (
p16
) [31]. Som en arvelig rotte RCC-modellen, vi også analysert RCC av Eker rotter, som ikke viser aggressive egenskaper, slik som metastaser [32], [33], [34]. Vi observerte at disse RCC viste null eller subtile genetiske endringer (Fig. S5). Følgelig oksidativt stress, herunder at indusert grunn av overflødig jern, kan være en av årsakene til menneskelig nyrekreftutvikling. Faktisk har mange epidemiologiske studier knyttet Jern- og stålindustri arbeidere med økt RCC risiko [35].
En frekvensplott analyse avdekket to bemerkelsesverdige funksjoner. Først kromosomavvik viste en preferanse for tap mot ploiditeten av hver kreft genom. For det meste ble aberrasjon representert ved en delesjon på enten en hel kromosomalt nivå (monosomi) eller ved en sekvensiell nivå (Fig. 1B). Den vanligste målet for tap var
Cdkn2a /2b
locus. Overvekt av tap i profilen til kromosom endringer kan tilskrives tidlig stadium av kreftutvikling. Vi har tidligere vist at celler med en hemizygous sletting på
Cdkn2a
vises så tidlig som noen få uker etter initiering en Fe-NTA administrasjon [36].
Vår nåværende analyse viste at monoallelic tap av kromosom 5 i sin helhet eller av en ekvivalent bred regionen er den viktigste første hendelsen. Faktisk fant vi bare ett tilfelle (6,7%) av et monoallelic tap av en ekstremt smal region (~350 kilobaser, Fig. 2A og 2B). Fe-NTA katalyserer dannelsen av hydroksylradikaler gjennom en Fenton reaksjon spesielt i lumina av renale proksimale tubuli, noe som fører til degenerering og nekrose /apoptose av disse cellene [37], [38]. Fordi nyre er et viktig organ som utfører urea utskillelse, reabsorpsjon av verdifulle molekyler samt ionisk homeostase vedlikehold, fornyelse fra de gjenværende rørformede celler intenst forfremmet. Under kronisk oksidativt stress ved gjentatte Fe-NTA administrasjoner, ville dette degenerasjon og regenerasjon prosessen fortsette i måneder til år, noe som øker risikoen for mitotiske hendelser samtidig med reparasjon av oksidative DNA-skader. Vi tror at dette oksidativt stress fører til unormal DNA replikasjon og kromosom missegregation, noe som fører til fremveksten av aneuploide celler. Overraskende, denne serien av hendelser synes å forekomme i måneder, noe som fører til en høy insidens (~90%) av RCC hos rotter i løpet av to år. Aneuploide celler vanligvis viser fenotyper konsistent med økt energibehov og proteotoxic stress. Imidlertid kan Aneuploidy fremme tumordannelse under de følgende to hypotetiske mekanismer: 1) Aneuploidy kan forårsake en proliferativ fordel ved tap av G1 /S overgang kontroll under betingelser hvor normale euploid celler som ikke deler [39] og 2) Aneuploidy kan gå videre tumorigenesis etter fremme genomisk ustabilitet, dermed øker evolvability av svulster [40]. Den hyppige sletting av
Cdkn2a Twitter /
2b
locus er observert hos rotte peritoneal mesothelioma, en jernoverskudd-assosiert tumor [41], induseres enten av en annen jernforbindelse (treverdig sakkarat) [ ,,,0],42] eller ved asbest [43]. Disse fellestrekk av dyremodeller sterkt at
Cdkn2a Twitter /
2b
er en rektor mål i jern-mediert kreftutvikling. Det samme genetiske endringer er observert i rotte mesothelioma indusert av multi-vegger karbon nanorør [44], der jern engasjement ennå ikke er etablert. Vi ønsker å legge til her for den biologiske betydningen av våre resultater som homozygot delesjon av
CDKN2A /2B
er hyppig observert i menneskelige mesothelioma forbundet med asbest eksponering [45], [46].
noen av svulster med en gjenværende
Cdkn2a Twitter /
2b
allel viste ekstremt høye uttrykk nivåer av to produkter fra denne locus,
p16 /Ink4a Hotell og
P19 /ARF.
Dette er en foreløpig debattert tema i menneskelig kreft [47]. Det er mye som tyder på at flere svulster utviser signifikante P16 nivåer i cytoplasma [48]. Dette kan være et mislykket forsøk på å stoppe celleproliferasjon i tilfelle av nedstrøms
Rb
dysregulering [49] eller kan representere en alternativ mekanisme for modulering av uidentifiserte veier. Våre data utstilling -50% hemizygous sletting av
Rb
. Dette krever videre avklaring med epigenetisk analyse.
Den andre funksjonen bestemmes ved hjelp frekvens tomten analyse ble en høy forekomst av forsterkning langs en begrenset kromosomal region mot cent av kromosom 4, og peker på
Met
locus. En region som strekker seg over 80 Mb fra cent av rotte kromosom 4 er syntenic menneskelig kromosom 7. Ulike menneskelige kreftformer, som glioblastoma [50] og ikke-småcellet lungekreft [51], blir rapportert til båtplass presiseringer i kromosom 7. Tyrosin kinase MET er en reseptor for en hepatocytt vekstfaktor og befinner seg oppstrøms for
ras
i signaltransduksjonsbane, og dermed tjener som en fordel for celleproliferasjon [52]. Derfor er det tenkelig at tumorstørrelse ble proporsjonalt forbundet med
Met
ekspresjonsnivået (fig. 3C og 4A). Fordi vi dissekere dyret så snart vi erkjenner svulsten, tror vi at store store svulster er mer aggressive i naturen. Det er å merke seg at tumorstørrelse ble også relatert til genomet endring mønster (fig. 4B), og er forbundet med forsterkning og overekspresjon av
Zbtb38
lokalisert på kromosom 8 (fig. S4). ZBTB38 (CIBZ) undertrykker transkripsjon av denaturert maler [53], og dermed antagelig regulerer epigenetiske mekanismer. Nedregulering av ZBTB38, en ny substrat av caspase-3, induserer apoptose [54] og dette genet er lokalisert i en prostata cancer susceptibility locus [54]. Disse resultatene bekrefter muligheten for svulst klassifisering ved hjelp av matrise-baserte CGH.
Met
oppsto evolutionally sent og er unikt for pattedyr [52]; Det kan derved være assosiert med den unike forsterkning i det hele genomet.
Genomisk forsterkning er antatt å skje via brudd-fusjons-bro syklus [55], [56], [57]. En Fenton reaksjonen fører til dobbeltkjedet DNA-brudd [10]. Våre resultater viser at disse presiseringer besto av en blanding av bredt spekter lavt nivå presiseringer og fragmenterte, smale høyt nivå presiseringer (fig. 3A). Dette antyder en mekanisme av positiv feedback for forsterkning, med utgangspunkt i et bredt område på lavt nivå forsterkning. Vi mistenker at en involvering av doble minutter, og en tilstedeværelse av utsatt genomisk loci. Denne hypotesen må undersøkes nærmere. Det var interessant at to kreftundertrykkende gener,
Cav1 product: [58], [59] og
ST7 product: [60], omringet
Met
locus (fig. 3B) . Dette kan være grunnen til at
Met
locus var en evner for rotte RCC. Hele exome eller genomsekvensering kan videre avsløre nye funn vedrørende punktmutasjon og translokasjon.
Til slutt, vi sammenlignet dagens rotte resultatene med tilsvarende humane svulster ved å omforme data basert på kromosom synteny (fig. 5A og 5B). Det var forventet at den genomiske endring av Fe-NTA-indusert rotte RCC var mest lik den humane RCC antagelig fordi målceller er de samme. Men overraskende, human mesothelioma var den nest mest lignende. Det er nå fastslått at de fleste menneskelige mesothelioma resultater fra eksponering for asbest, og den primære patogene prosessen involvert er jernoverskudd [8], [61]. Det samme mesodermal opprinnelse tubulære celler og mesothelial celler kan føre til at likheten av arraybaserte CGH profiler. Endodermal svulst, slik som pankreatisk duktus adenokarsinom (PDAC), og ectodermal tumor, slik som glioblastoma multiforme (GBM), oppviste en betydelig forskjell i genomiske profiler.
Som konklusjon viste vi at gjentatt Fenton reaksjoner i vill typen rotter indusert kreft som rekapitulert genomiske forandringer som ligner de i kreft hos mennesker, noe som tyder på involvering av oksidativt stress som en viktig faktor i menneskelig kreftutvikling. I denne nyrekreft modellen, foretrukne endringer var sletting;
Cdkn2A /2B
sletting og
Met
forsterkning var de store målet genet modifikasjoner. En komparativ arts analyse vil bidra til å identifisere kandidatkreftfremkallende stoffer.
Materialer og metoder
Fe-NTA-indusert nyrecellekarsinom Modell
Fe-NTA-indusert karsinogenisitetsstudier forsøkene var utføres ved hjelp av mannlige F1 hybrid rotter som var en mellomting mellom Fischer 344 og Brown-Norge innavlede stammer (Charles River, Yokohama, Japan) som tidligere beskrevet [62]. Tretten RCC tilfeller ble anvendt i denne studien, og den histologiske grad av tumoren ble bestemt i henhold til den modifiserte World Health Organization klassifisering som vi tidligere beskrevet [62]. Detaljene er oppsummert i tabell 1. dyreforsøk komiteer av Graduate School of Medicine, Universitetet i Kyoto Graduate School of Medicine og Nagoya universitet Graduate School of Medicine godkjent denne studien. FRCC001 og FRCC562 cellelinjer ble etablert fra primær Fe-NTA-indusert RCC som tidligere beskrevet [63].
Array-basert Comparative Genomisk Hybridisering
Genomisk DNA fra svulster og cellelinjer var isolert med DNeasy (Qiagen, Valencia, CA). Array-baserte CGH ble utført med en Agilent 185 K rotte genomet CGH mikromatriser (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) som tidligere beskrevet [64]. Tretten primærsvulster og to cellelinjer av Fe-NTA induserte RCC ble analysert ved bruk av referanse-DNA ekstrahert fra en normal nyre fra en rotte fra Brown-Norge imbred belastning. En RCC prøve av en kvinnelig Eker rotte [32] ble analysert ved hjelp av referanse-DNA ekstrahert fra en normal nyre fra et hann Eker rotte. To ekstra RCC prøver av hann Eker rotter ble analysert med Rat Genome CGH Microarray 105A (G4436A, Agilent Technologies), ved hjelp av referansen DNA ekstrahert fra en normal leveren av en annen mannlig Eker rotte. De normaliserte arraybaserte CGH data ble bearbeidet for å generere en segmentert sirkulær profil ved binær segmentering (CBS) [65] med en endret signifikansnivå (alfa = 0,0001). Prosedyren for databehandling for kopiantall estimering er beskrevet i Methods S1.
Kvantitativ RT-PCR analyse
Total RNA ble isolert ved hjelp Isogen reagenser (Nippon Gene Co Ltd., Tokyo, Japan ) i henhold til produsentens protokoll. cDNA ble syntetisert ved anvendelse av en RNA PCR kit ver. 3.0 (Takara Bio, Shiga, Japan) med tilfeldige primere. En Platinum SYBR Grønn qPCR SuperMix-UDG kit (Invitrogen, Carlsbad, California) og en 7300 Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA) ble brukt for kvantitativ real-time PCR-analyse. Rotte β-aktin ble benyttet som en intern kontroll. Primerne som ble brukt var som følger:
p16
Ink4a
, 5′-aaacgccccgaacactttc-3 «og 5′-gttcgaatctgcaccatagga-3»;
p19
Arf
, 5′-accccaagtgagggttttct-3 «og 5′-agagctgccactttgacgtt-3»;
p15
Ink4b
, 5′-tccacaggctagagggaaaa-3 «og 5′-gtgcaggtgactccttggtt-3»;
Met
, 5′-ttaagcgagagcacgacaaat-3 «og 5′-ccacataggaaaacgcactgt-3»;
Zbtb38
, 5′-gtagctgctgctccaaatcc-3 «og 5′-cctgttgagggtggtgaact-3′; β-aktin, 5»-tgtgttgtccctgtatgcctctg-3 «og 5′-atagatgggcacagtgtgggtg-3».
humandata
Vi brukte menneskelige arraybaserte CGH data i bukspyttkjertelen duktalt adenokarsinom (hPDAC) [ ,,,0],28], T-celle akutt lymfoblastisk leukemi (hTALL) [28], glioblastom (hGBM) [66], mesothelioma cellelinje (HMM) [67] og nyrecellekarsinom (hRCC) [56]. De Agilent CGH-array-data for de tidligere fire typer kreft hos mennesker ble hentet fra NCBI Gene Expression Omnibus (GEO) nettside (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/). Geo deponeringsnummer for datasettene er GSE7599 (hPDAC), GSE7603 (hTALL), GSE9177 (hGBM) og GSE22237 (HMM). Den menneskelige RCC data ble innhentet gjennom analyser med BAC mikromatriser (4,361 kloner) [68]. Vi definerte likheten indeks mellom de to arraybaserte CGH profiler som følger. Først må vi beregnet korrelasjonskoeffisienten med log2 forhold mellom det estimerte kopiantallet over utledede kreft ploiditet for de genomiske posisjoner svarende til alle de Agilent 44 K human CGH microarray prober. Deretter multipliseres vi verdien med 1 × 10
3 etter å ha endret den absolutte verdien til sin kvadratroten.
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
Array-CGH profiler fra alle RCC undersøkt. Røde linjer viser log2 prosenter av anslått kopiantallet enn antatt kreft ploidiresultat versus genomisk posisjon for alle CGH microarray prober
doi:. 10,1371 /journal.pone.0043403.s001 product: (PDF)
Figur S2.
Fordeling av log2 ratio verdier av anslått kopi nummer for alle probene i alle mikromatriser utført.
doi: 10,1371 /journal.pone.0043403.s002 product: (PDF)
Figur S3.
Eksempel på global uttrykk endrer seg i takt med genomisk endring. Forskjeller i genomet og transkriptom analyseres mellom to RCC, FB7-7 har bredt spekter forsterkning på kromosom 4 versus FB28-7 har ingen vesentlig genomisk endring på kromosom 4. (A) Sky blå sirkel tomten indikerer forholdet mellom estimerte kopiantall basert på matrise-baserte CGH (FB7-7
vs
FB28-7). Rød sirkel tomten viser forholdet mellom normaliserte signaler på Affymetrix uttrykk mikromatriser (FB7-7
vs
FB28-7). (B) Ekspresjon forholdsverdiene midles langs kromosomet. Her viser rød sirkel tomten gjennomsnittlig verdi på 2 MB vinduer
doi:. 10,1371 /journal.pone.0043403.s003 product: (PDF)
Figur S4.
Zbtb38
mRNA uttrykk beviselig er forbundet med kromosomkopiantall. (A) Array-CGH profiler av to RCC svulster husing forsterkning i løpet av
Zbtb38
locus på kromosom 8. (B) Expression analyse av
Zbtb38
på 13 RCC svulster ved real-time PCR. Verdiene av
y
-aksen indikere relative mRNA uttrykket nivå i forhold til et gjennomsnitt av de i normale nyrer av tre kontrollrotter
doi:. 10,1371 /journal.pone.0043403.s004
(PDF)
Figur S5.
Array-CGH profiler av tre arvelig (Eker rotte) nyresvulster.
