Abstract
immunterapi som adoptiv overføring av T-celler eller naturlige drepeceller, eller monoklonalt antistoff (MOAB) behandling har nylig blitt anerkjent som effektivt middel for å behandle kreftpasienter. Imidlertid har adoptiv overføring av B-celler eller plasmaceller som produserer tumorspesifikke antistoffer ikke blitt anvendt som en terapi fordi langvarig kultur og selektive ekspansjon av antigenspesifikke B-celler som har vært teknisk meget vanskelig. Her beskriver vi en roman kreft immunterapi som bruker B-celle adoptiv overføring. Vi viser at Germinal-center-like B-celler (iGB celler) indusert in vitro fra mus naive B-celler blir plasmaceller og produsere IgG antistoffer i mer enn en måned i benmargen av ikke-bestrålt mottaker mus. Når overført til mus, iGB celler som produserer antistoff mot et surrogat tumorantigen trykkes lungemetastase og vekst av musemelanomceller som uttrykker det samme antigen og forlenget overlevelse av mottakerne. I tillegg har vi utviklet en ny kultursystem kalt Fais til selektivt å utvide antigen-spesifikke iGB celler som benytter det faktum at iGB celler er følsomme overfor Fas-indusert celledød, med mindre deres antigenreseptorer blir ligert av membranbundne antigener. De valgte iGB cellene effektivt undertrykt lungemetastaser fra melanom celler i adoptiv immunterapi modell. Som humant blod B-celler kan formeres som iGB celler ved anvendelse av dyrkningsforhold som likner på mus iGB cellekulturer våre data tyder på at det vil være mulig å behandle kreftbærende pasienter ved adoptiv overføring av kreft-antigen-spesifikke iGB-celler valgt i vitro. Denne nye adoptiv immunterapi bør være et alternativ til den arbeidskrevende utvikling av Moab legemidler mot kreft som ingen effektive behandlinger i dag eksisterer
Citation. Moutai T, Yamana H, Nojima T, Kitamura D (2014) A Novel og effektiv Cancer Immunterapi Mouse Model Bruke Antigen-spesifikke B-celler selektert in vitro. PLoS ONE 9 (3): e92732. doi: 10,1371 /journal.pone.0092732
Redaktør: Yoshiki Akatsuka, Fujita Health University School of Medicine, Japan
mottatt: 28 desember 2013, Godkjent: 24 februar 2014; Publisert: 19 mars 2014
Copyright: © 2014 Moutai et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Takeda Science Foundation, Grants-in-Aid for Scientific Research (B) (22390097) fra Japan Society for Promotion of Science (JSP) og Grants-i-Aid for Scientific Research på Prioriterte områder (22021042) fra departementet for utdanning, kultur, sport, vitenskap og teknologi fra Japan (MEXT) (til DK), og ved Grants-i-Aid for JSP Fellows (til TM). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Immunterapi har nylig blitt mer allment akseptert som et effektivt middel for å behandle kreftpasienter. Den viktigste spilleren i celleformidlet cancer immunoterapi har vært cytotoksiske T-lymfocytter (CTL) som er rettet mot tumorceller, som gjenkjenner via deres T-celle-reseptor (TCR) et bestemt peptid avledet fra en tumor antigen (Ag) presentert av MHC I i tumorceller. Slike T-celler fra utskåret tumorvev eller pasientens blod blir selektivt ekspandert in vitro på syngeniske Ag presenterende celler (APC) som uttrykker tumor Ag med cytokiner som IL-2, og deretter overføres tilbake til pasientene [1], [2]. Relativt ikke-spesifikke versjoner av cellulær immunterapi er også blitt klinisk testet, inkludert de som ved hjelp av T-celler og NK-celler ekspandert ved stimulering med IL-2 og anti-CD3-antistoffer (ABS), med /uten ytterligere cytokiner [3], [4] . Nylig, in-vitro-ekspanderte dendrittiske celler (DCS), som er meget effektiv APC, har også blitt brukt til å stimulere tumor-Ag-spesifikke CTL så vel som CD4
+ T-celler in vivo, [5] – [7]. Disse behandlingene basert på adoptiv celle overføring har så langt ikke blitt allment vedtatt som et alternativ for kreftbehandling siden deres kliniske suksessen har vært begrenset, mens de krever tidkrevende laboratoriearbeid, inkludert individuell cellekultur i flere uker i et kvalitetssikret clean room .
på den annen side har Ab-baserte immunterapi vært i sterk vekst som en lovende kreft immunterapi. Faktisk mer enn et dusin monoklonalt Abs (MoAbs) er for tiden godkjent for behandling av kreft hos mennesker [8] – [10]. Som et anti-kreft legemiddel, MoAbs har store fordeler sammenlignet med kjemoterapi, siden de bare målrettes mot celler som uttrykker spesielle Ags. Den biokjemiske natur og biologiske funksjoner for hver isotype av Abs er godt kjent, og så er de mekanismer som de formidler målcellen lyse, nemlig Ab avhengig cellulær cytotoksisitet (ADCC) og komplementavhengig cytotoksisitet (CDC) [11], [12]. Som naturlig eksisterende proteiner i alle personer, er Abs forventes å ha færre bivirkninger, og som sådan, er det lettere å forutsi resultatene deres som et rusmiddel. I forhold til den celleformidlede immunterapi er beskrevet ovenfor, er Ab-mediert immunterapi enklere å utføre dersom tilførselen av den MoAb er tilstrekkelig. Imidlertid Moab medikamenter har også ulemper: de er dyre og deres utvikling er fortsatt krevende, krever betydelig tid og kostnad, fra dyr immunisering, ved screening av hybridomer, til genkloning og rekombinasjon fremgangsmåter for deres humanisering, noe som er nødvendig for å unngå en immunrespons hos mottager [10], [13]. Tumor Ags at MoAb stoffene er rettet mot er typisk transmembrane proteiner, som ofte er vanskelige å fremstille som en oppløselig immunogen. Dessuten, selv med humaniserte MoAb, kan gjenværende mus-avledede segmenter av V-regionen være antigene i mennesker og indusere human anti-mus Abs [14]. På grunn av disse problemene, farmasøytiske selskaper har en tendens til å begrense Moab mål til det som uttrykkes av relativt vanlige kreftformer.
Gitt de nevnte fordelene av Moab narkotika og fortjeneste av adoptiv celle overføring terapier som primært å være skreddersydd og koster mindre å utvikle seg, synes det rimelig å utvikle en behandling for å overføre pasient-avledet plasmaceller som produserer tumor-Ag-spesifikke, fullstendig human Ab. Men vi er klar over alle tilfelle hvor en slik terapi har vært vellykket. Plasmaceller er terminalt differensierte celler og således er ute av stand til å vokse i kultur. I stedet, B-celler, en direkte forløper av plasmaceller, kan brukes for overføringen. Imidlertid har til og med B-celler vist seg vanskelig å ekspandere i et tilstrekkelig antall for adoptiv overføring terapi. I tillegg har det ikke blitt fastslått hvorvidt og i hvilken grad de overførte B-celler kan overleve og differensiere til plasmaceller in vivo.
Vanligvis er MoAb avledet fra Ag-spesifikke hybridomer, hybride celler mellom milt-B-celler fra gjentatte ganger immuniserte dyr og en fusjonspartner plasmacytom cellelinje. I dyr som er immunisert med en gitt Ag, blir Ag-bundne B-celler aktivert og proliferere for å danne germinale sentre (GCS) i milten eller lymfeknutene. I GCer, B-cellene gjennomgå isotypeveksling og somatisk hypermutasjon av immunoglobulingener for å øke affiniteten av deres Ag reseptorer (B-celle-reseptor, BCR). Blant dem, er B-celler som uttrykker BCR spesifikke for det immuniserte Ag selektivt ekspandert differensiert og inn i minne-B-celler eller langvarige plasmaceller (LLPCs) [15], [16]. Etter en avsluttende booster-immuniseringen, blir de Ag-spesifikke minne-B-celler aktivert og proliferere for å bli plasmablasts, som vanligvis danner Ag-spesifikke hybridomer. Derfor, selv om Ag-spesifikke minne-B-celler kan finnes i et betydelig antall i immuniserte individer, antigen-spesifikke B-celler er vanligvis sjelden hos ikke-immuniserte individer. Derfor vil noen B-celle adoptiv overføring terapi krever en metode for å selektivt utvide de sjeldne tumor-Ag-spesifikke B-celler fra de ekstremt polyklonale perifere B-celler av pasientene.
For å utvikle et system for å selektivt utvide svulst -Ag-spesifikke B-celler for adoptiv overføring terapi, benyttet vi den induserte GC B (iGB) cellekultur system som vi nylig rapportert [17]. I dette systemet, mus naive B-celler er dyrket suksessivt med IL-4 og IL-21 på en matecellelinje som uttrykker CD40L og BAFF (40 LB), som resulterer i omfattende proliferasjon (opp til 10000 ganger i 8 dager) av klasse- byttet B-celler med en GC fenotype, betegnes iGB celler. Etter kultur med IL-21 og overføre til bestrålte mus, de iGB cellene differensieres til plasmaceller og har en tendens til å kolonisere benmargen (BM) og utskille Abs [17]. Ved å tilpasse systemet til humane B-celler, ville det være mulig å fremstille et stort antall humane B-celler som kan produsere humant helt Abs når de overføres til pasienter. Mot vårt mål om å etablere B-celle-mediert adoptiv overføring behandling for kreft, har vi vurdert i en musemodell hvor mye og hvor lenge de overførte iGB cellene produserer Ab i ikke-bestrålte mus, og om de hemmer veksten av kreftceller som uttrykke en Ag anerkjent av samme Ab in vivo. I tillegg, ved å anvende den iGB kulturen teknikk, har vi utviklet et system for å velge forholdsvis sjeldne B-celler som bindes til en membran-bundet Ag, og viste at de valgte B-celler er effektive ved adoptiv overføring cancer immunoterapi modell.
Resultater
iGB Cells Kolon benmargen og produsere Ab etter overføring til ikke-bestrålte mus
Som vi rapporterte tidligere, de fleste iGB celler etter den sekundære kultur med IL-21 har gjennomgått klasse svitsjing og uttrykke enten IgG1 eller IgE dag 8. Svært få av dem uttrykker IgM, IgG2b eller IgA, og nesten ingen uttrykkelig IgG2c eller IgG3 (figur 1A). Vi viste tidligere at iGB cellene differensieres til plasmaceller i benmarg (BM) når de ble overført til bestrålte mus. Her vurderte vi Ab produksjonen fra iGB-avledet plasmaceller i ikke-bestrålte mus. De iGB Cellene ble samlet fra Hy10 mus, som bærer en hønse-eggehvite lysozym (HEL) -spesifikk tungkjede (VDJ9) og lettkjede (κ5) gener i knock-in og transgene konfigurasjoner, henholdsvis [18]. Blant de iGB celler, IgE
– CD138
– HEL-binding (HEL
+) celler ble FACS-renset og overføres til ikke-bestrålt C57BL /6 (B6) mus, som ble tappet for blod hver uke for å måle konsentrasjonen av anti-HEL IgG1. Som vist i Figur 1B, er en høy grad av HEL-spesifikk IgG1 detektert i sera en uke etter overføringen, og gradvis deretter det falt til en lav, men likevel påvisbar mengde (mer enn 1 ug /ml) etter 10 uker. Anti-HEL lgG1 var ikke påvises i sera hos kontrollmusene som fikk iGB celler avledet fra WT B6 mus. Betydelige mengder anti-HEL IgG1 Ab-produserende celler (APC) ble påvist i BM, men svært få i milten til mus som mottok Hy10-avledede celler iGB 4 uker tidligere (figur 1C). Anti-HEL Ab fra IgG2b klassen, men ikke fra IgG2c eller IgG3 (data ikke vist), var også påvisbar en uke etter overføring med Hy10-avledet iGB celler, men ikke med WT iGB-celler (figur 1D). Selv om den eksakte konsentrasjon av IgG2b anti HEL ikke kunne beregnes på grunn av mangelen på en standard isotype-matchet anti-HEL Ab, den IgG2b titer var langt lavere enn for anti-HEL lgG1 (data ikke vist). Tatt sammen indikerer disse data på at in vitro-genererte iGB-celler er i stand til å differensiere til plasmaceller som koloniserer den BM av ikke-bestrålte mus, og kan fortsette å produsere Ab der i minst 4 uker.
(A ) milt-B-celler fra C57BL /6-mus ble dyrket i 4 dager med IL-4, og deretter i 4 dager med IL-21 på 40 LB-celler. Ekspresjonen av Ig-isotyper, CD19 og CD138 på de ekspanderte iGB-celler ble analysert ved hjelp av strømningscytometri. Data representerer cellene i lymfocytt port er definert ved side- og forover spredning. Tallene angir hvor mange prosent av de iGB celler i kvadrantene eller vinduer. Viste data er representative for tre uavhengige eksperimenter. (B) Naive, HEL-binding eller total B-celler fra milt fra Hy10 eller WT C57BL /6 mus, henholdsvis, ble dyrket som i (A). Etter dyrkningen ble iGB cellene høstet og CD138
– IgE
– iGB-celler (2 x 10
7 celler /mus) ble renset og overført i.v. til ikke-bestrålt C57BL /6 mus. PBS ble også injisert som kontroll. Disse musene ble tappet for blod ved de indikerte uker etter overføring og serum anti-HEL IgG1-konsentrasjonen ble bestemt ved ELISA. Dataene er uttrykt som gjennomsnitt ± S.D. av individuelle serum av mus (n = 5 i hver gruppe). Dataene er representative for to uavhengige eksperimenter. (C) HEL-binding eller total B-celler ble dyrket og overført til ikke-bestrålte mus som i (B). Fire uker etter overføringen, antall AFCS sekresjon HEL-bindende lgG1 blant milt eller benmarg-celler ble bestemt ved ELISPOT-analyse. Det midlere antall ± S.D. av den AFCS i 10
6 milt eller BM-celler er angitt ved hver stolpe. Vist er kollektive data fra tre uavhengige eksperimenter, hver bruker 3 mottaker mus per gruppe. * P 0,001. N.D .: ikke registrert. (D) Anti-IgG2b HEL-titere i serumprøvene (10-gangers fortynninger) ble oppnådd ved en uke i (B) ble bestemt ved hjelp av ELISA. Hver verdi er gjennomsnitt ± S.D. av prøvene (n = 5 for hver gruppe). Dataene er representative for to uavhengige eksperimenter.
iGB Celler Inhibit Lungemetastase av mus-melanomceller in vivo
Disse resultater antyder en mulig anvendelse av iGB cellekultursystem for klinisk bruk, nemlig i Ab-mediert kreftbehandling. Vi testet denne mulighet med en godt studert musemodell av tumormetastase ved hjelp av B16 musemelanomcellelinje. Vi brukte B16 celler med et membran-forankret form av HEL (mHEL) [19] som et surrogat tumor Ag, og genererte en transfektant klon med homogen HEL uttrykk på celleoverflaten, betegnet B16-mHEL (figur 2A). Vi testet om HEL-spesifikk iGB celler kunne hemme metastase og vekst av B16-mHEL-celler in vivo ved å produsere anti-HEL Abs. Siden HEL-bindende affinitet av de Hy10 milt B-celler er kjent for å være heterogen [18], vi sorteres de sterkeste binding HEL fra Hy10 milt B-celler og dyrket dem på 40 LB-tilførselsceller i 3 dager med IL-4 og deretter i 3 dager med IL-21 for å gjøre iGB celler. Milt B-celler fra WT B6 mus ble også dyrket i parallell. IgE
– CD138
– B-celler sortert fra den Hy10 iGB (Hy10-iGB) eller WT iGB (WT-iGB) celler, eller bare PBS som kontroll, ble deretter injisert i.v. til ikke-bestrålte B6-mus som hadde fått B16-mHEL 24 timer før (figur 2B). Lungene av de resipientmus ble inspisert med 3 uker senere. Lungene av musene som fikk WT iGB celler eller PBS bare, hadde mange klumper av allment spres kreftceller, for det meste smelte sammen med hverandre for å danne utvisket massene. Til sammenligning var bare noen små klumper av kreftceller funnet i mus som hadde fått Hy10 iGB celler (figur 2C). Som en kontroll ble mus inokulert med paren B16-celler utviklet tallrike lungesvulster, selv når det ble behandlet med Hy10 iGB-celler (data ikke vist).
(A) Ekspresjon av HEL Ag på B16 melanomceller transfektert med et mHEL uttrykk vektor (B16-mHEL). B16-mHEL celler ble farget med anti-HEL IgG1 Moab (svart linje) eller isotype-matchet kontrollgruppe Moab (skyggelagt), etterfulgt av APC-konjugert anti-mus IgG1 Ab, og analysert ved flowcytometri. Tallet angir hvor mange prosent av mHEL-uttrykkende celler. Data er et representativt for to uavhengige eksperimenter. (B) Eksperimentell strategi. IgE
– CD138
– iGB celler (2 × 10
7 celler /mus) stammer fra HEL-bindende milt-B-celler av Hy10 mus (Hy10-iGB) eller total milt B-celler av WT C57BL /6 mus (WT-iGB), eller PBS alene ble overført iv til ikke-bestrålte C57BL /6-mus, som var blitt overført i.v. med B16-mHEL (C, D, E) eller B16-mHEL-GFP (F, G)-celler (2 x 10
5 celler /mus) 24 timer før. (C) Fotografier av lungene til mottaker mus som er beskrevet i (B) 3 uker etter overføringen. Bilder av to mus tilfeldig utvalgte fra ti per gruppe vises. Når det er mulig, ble lungene av resten av mus inspisert visuelt på dødsdagen. I de ikke-behandlede grupper, det var blanding av enkeltmetastaser i svært store tumormasser, noe som gjør det meningsløst å telle antall svulster. (D) Overlevelse av det samme sett av musegrupper (n = 10 per gruppe) som i (B) ble sammenlignet ved bruk av logrank test. * P 0,001. (E) Konsentrasjon av serum anti-HEL lgG1 i de samme musene som brukes i (D) ble bestemt ved hjelp av ELISA ved de indikerte tidspunkter. Åpne og lukkede symboler angir verdiene for enkeltprøver og gjennomsnitt av hver gruppe, henholdsvis. Data i (D) og (E) er representative for fire lignende eksperimenter. (F) Binding av anti-HEL IgG1 til B16-mHEL celler i lungetumorbærende mus. Lungene av mus som hadde fått Hy10 iGB celler (svart linje) eller PBS (skyggelagt) og B16-mHEL-GFP celler (2 × 10
5 celler /mus) som i (B) ble skåret 3 uker etter overføringen. Enkeltcellesuspensjoner fra lungene ble farget med anti-mus IgG1-APC og analysert av FACSCantoII. Representative histogrammer av prøvene gating på GFP
+ celler er vist. (G) Sammendrag av forsøkene er vist i (F). Barer representerer gjennomsnitt ± S.D. av geometriske anordning (Geom. Mean) av APC fluorescensintensitet av GFP
+ celler fra mus i hver gruppe (n = 3). Dataene er representative for to uavhengige eksperimenter. ** P. 0,05
Long-term observasjon av det samme sett av mus viste at mus som overføres med Hy10 iGB celler overlevde betydelig lengre enn de som er overført med WT iGB celler eller bare PBS (figur 2D ). Blant disse musene, ble serum anti-HEL lgG1 detektert ved relativt høy konsentrasjon i den første perioden av tidsforløpet bare i mus som overføres med Hy10 iGB celler, selv om Ab konsentrasjonen gradvis nedover (figur 2E). Vi kunne vise ved strømningscytometri at anti-HEL lgG1 ble bundet til B16-mHEL celler tatt fra lungesvulster ex vivo 3 uker etter tilførsel av Hy10 iGB celler (figur 2F og 2G). Til sammen indikerer disse data at HEL-spesifikke Abs fremstilt ved iGB-celle-stammer plasmaceller direkte hemmet kolonisering og /eller vekst av B16-mHEL celler i lungen og forlenget overlevelse av de resipientmus. Mulige mekanismer for Ab-mediert svulst undertrykkelse og mulige årsaker til eventuell død av de behandlede mus er omtalt nedenfor.
Utvikling av en kultur System for å selektivt Utvid Ag-spesifikke iGB Cells
resultatene fra disse in vivo-studier antydet at det kunne være mulig å bruke iGB-celle-mediert tumorterapi hos mennesker. Mot dette formål, ville det være nødvendig å velge antagelig sjeldne B-celler med spesifisitet for en gitt tumor Ag. Derfor vi først forsøkt å utvikle et modellsystem for å berike og utvide Ag-spesifikke mus-B-celler til stede i lave nivåer i den polyklonale B-celle bassenget. Vi har utviklet et system basert på Fas /Fasl-mediert apoptose, siden det vesentlige alle iGB celler uttrykker Fas [17] og er sensitiv for Fas-mediert apoptose (data ikke vist). I tillegg iGB celler blir resistente mot Fas-mediert apoptose når deres lgG1 BCR ligeres med membranbundet Ag (data ikke vist), som tidligere er rapportert for aktivert IgM
+ B-celler [20]. Derfor bare Ag-bindende iGB cellene skal overleve under forhold hvor Fas er engasjert (figur 3A). For å teste denne hypotesen, utarbeidet vi et modellsystem og genererte to nye mater cellelinjer, 40 LB-celler som stabilt uttrykker en surrogat Ag mHEL (40 LB-mHEL) og de som stabilt uttrykker mHEL og Fasl (40 LB-mHEL-Fasl). Vi innledet de iGB cellekulturer på konvensjonelle 40 LB feeder-celler med en blanding av milt B-celler fra CD45.1
+ Hy10 mus og CD45.2
+ WT mus i forholdet 1:99. Etter suksessiv kultur med IL-4 og IL-21 på 40 LB-celler (utvidelse), ble de ekspanderte iGB cellene sådd ut på 40 LB-mHEL feeder-celler og dyrket i 6 timer (Ag-stimulering), og deretter på ny sådd ut på 40 LB -mHEL-Fasl i 8 timer (utvalg) og til slutt på 40 LB i 5 dager (recovery), med IL-21 til stede gjennom etter ekspansjonsfasen. Disse spesifikke forholdene ble bestemt etter mange forsøk med forskjellige innstillinger (Figur 3B). Etter at ekspansjonsfasen, bekreftet vi at andelen av CD45.1
+ HEL-bindende celler holdt seg på 1% (figur 3C). Andelen forble den samme etter at Ag-stimulering kultur, og gjorde det i kontrollkulturen på 40 LB mater celler også, selv om intensiteten av HEL flekker ble lavere i tidligere sannsynligvis fordi BCR ble internalisert (figur 3D, «valgt «). Etter etterfølgende valg og gjenvinning av fasene, men andelen av CD45.1
+ HEL-bindende celler økte opp til ~80% i gjennomsnitt, mens ingen anrikning ble sett etter parallellkontrollkulturen på 40 LB-celler ( «non -selected «). De valgte iGB cellene hovedsakelig uttrykt BCR av IgG1 isotype (data ikke vist). Ved hjelp av «valgt» protokoll, i gjennomsnitt 3 x 10
5 HEL-bindende B-celler ble utvunnet fra kulturen som begynte med 10
4 slike celler blant 10
6 B-celler totalt (figur 3E og 3F). Derfor har vi etablert et utvalg kultur protokoll som muliggjør effektiv berikelse og utvidelse av Ag spesifikke B-celler som er til stede som en liten befolkning blant et stort flertall av ikke-spesifikke polyklonale B-celler. Vi kaller dette valget systemet «Fas-mediert antigen-spesifikke iGB celle utvalg (fais) system». Vi har også lykkes i å anrike iGB-celler som er spesifikke for haptenet 4-hydroksy-3-nitrofenyl acetyl (NP), som i utgangspunktet er tilstede på ~ 5%, opp til ~80% ved hovedsakelig det samme systemet ved å bruke Fasl-uttrykkende 40 LB-celler som viser NP-konjugert protein på sin overflate (data ikke vist).
(A) Skjematisk representasjon av prinsippet for Fas-mediert Ag-spesifikke iGB celleseleksjon (Fais) system. Bare iGB celler som BCR er legert med Ag presenteres på feeder-celler blir resistente mot døden via Fas ligation av Fasl på samme mater celler. (B) Protokoll for Fais system. Milt-B-celler fra CD45.1
+ Hy10 mus og CD45.2
+ WT mus ble blandet i et forhold på 1:99 (1%), og dyrket på en 40 LB matersjikt med IL-4 for 3 dager, og deretter med IL-21 i 2 dager. De resulterende iGB cellene ble trinnvis dyrket på mater lag 40 LB-mHEL i 6 timer (Ag-stimulering), 40 LB-mHEL-Fasl for 8 timer (et utvalg), og 40 LB for 120 h (recovery) i «valgt» protokollen. I den «ikke-valgt» protokoll, ble det passende antall iGB celler sådd ut på en mate lag på 40 LB-celler med den samme tidspunkt som den «valgte» protokoll. Ved hver tid replating ble iGB celler isolert fra materen, IgE
+ og CD138
+ celler i begge protokollene. (C-E) Representative strømningscytometriske profiler (HEL-bindende vs. CD45.1; separert på CD19
+ -celler) av de blandede iGB cellene før Ag-stimuleringsfasen (0 h C), etter-Ag stimulering fase (6 h, D), og etter at restitusjonsfasen (134 h, E). På hvert tidspunkt ble renset iGB celler farget med biotinylert HEL og streptavidin-APC, anti-CD19 og anti-CD45.1 Abs og analysert ved flowcytometri. Profilene til iGB celler dyrket av «valgt» (venstre) eller «non-valgte» (høyre) protokollen vises. Tallene i hvert vindu representerer prosentandelen av Hy10 iGB celler (CD45.1
+, HEL-binding) blant totalt CD19
+ iGB celler. Dataene er representative for tre uavhengige eksperimenter. (F) Den absolutte tall (til venstre) og prosentandel (til høyre) av Hy10 iGB cellene etter gjenvinning av kulturen med enten den ikke-valgt eller valgte protokoll som bestemt ved analysen vist i (E) er vist som gjennomsnitt ± S.D. av tre uavhengige eksperimenter. * P 0,05. ** P. 0,01
Neste vi undersøkt om færre Ag-spesifikke B-celler i en uspesifikk bassenget kan bli beriket, i påvente av muligheten for å bruke dette systemet for klinisk anvendelse. Denne gangen startet vi kulturene med CD45.1
+ Hy10 milt B-celler blandet med en frekvens på 0,1 eller 0,01% i 1 × 10
6 vekt B6 milt-B-celler (CD45.2
+) , en frekvens som ble bekreftet like før Ag-stimulering kulturen i iGB-celler (figur 4A). Hver B-celle-blandingen ble dyrket i henhold til den Fais system ( «valgt») eller bare på 40 LB-celler som en kontroll ( «ikke-valgt»). Etter utvinning dyrkningen ble HEL-bindende iGB celler anriket for ~40% og -10% når de var opprinnelig til stede ved 0,1% og 0,01%, respektivt (figur 4B og 4C). Disse dataene tyder på at meget sjeldne Ag-spesifikke B-celler, så få som en i 10
4, kunne bli beriket og ekspanderes ved å gjenta Fais kulturen protokollen.
(A og B) milt-B-celler fra CD45.1
+ Hy10 mus ble blandet med en frekvens på 0,1% eller 0,01% til 1 x 10
6 CD45.2
+ WT milt-B-celler. De blandede celler (1 x 10
6) ble dyrket som beskrevet i figur 3B. Vist er strømningscytometriske profiler (HEL-bindende vs. CD45.1; inngjerdet på CD19
+ celler) av de blandede celler før Ag-stimulering fase (0 H; A) og etter restitusjonsfasen (134 H; B ) i et representativt eksperiment. Tallet er angitt i hvert vindu viser prosentandelen av Hy10 iGB celler (CD45.1
+, HEL-binding) blant totalt CD19
+ iGB celler. (C) Prosent Hy10 iGB cellene etter gjenvinning av kulturen i enten ikke-valgt eller valgte protokollen initiert fra blandingsforholdet på 0,1% (venstre panel, n = 3) eller 0,01% (høyre panel, n = 2), som bestemmes av analysen er vist i (B), er angitt som gjennomsnitt ± SD av uavhengige forsøk. * P 0,01. ** P. 0,05
In-vitro Valgt Ag-spesifikke iGB Cells Undertrykk tumorvekst in vivo
Til slutt testet vi om in vitro utvalgte iGB celler er en effektiv anti-tumor terapi i melanom metastase modell i mus. CD45.1
+ HEL-bindende B-celler fra mus Hy10 ble blandet med CD45.2
+ polyklonale B-celler fra WT B6 mus ved et forhold på 1:99 og dyrket i Fais system eller på 40 LB-celler som et ikke-valgte kontroll, som beskrevet i figur 3 (figur 5A). Etter utvinning kultur, hyppigheten av HEL-bindende iGB cellene nådde 85%, en mer enn 400 gangers anrikning, etter at Fais kultur sammenlignet i kontrollkulturen (figur 5B). Vi overført disse iGB celler (2 × 10
7) enten valgt eller ikke valgt, eller bare PBS, til ikke-bestrålte B6 mus som hadde blitt overført med 2 × 10
5 B16-mHEL celler. Tre uker senere ble B16-cellene mHEL spres gjennom lungene og dannet tallrike klumper av forskjellige størrelser i musene som hadde fått ikke-markerte iGB celler eller PBS. I motsetning til dette bare et lite antall av tumorer, for det meste små i størrelse, ble observert i lungene av mus som hadde fått de valgte iGB-celler (figur 5C). Disse data indikerer at iGB celler valgt in vitro basert på deres Ag bindingsspesifisitet er fortsatt i stand til å differensiere til plasmaceller in vivo og å inhibere veksten av tumorceller som uttrykker det samme Ag.
(A) Eksperimentell strategi. En 1:99 blanding av milt-B-celler fra CD45.1
+ Hy10 mus og CD45.2
+ WT mus ble underlagt Fais system som beskrevet i figur 3B. De valgte eller ikke valgte iGB celler etter restitusjonsfasen, eller PBS alene, ble injisert inn i ikke-bestrålt C57BL /6 mus som hadde blitt overført intravenøst med B16-mHEL-celler, som beskrevet i figur 2B. (B) Representative strømningscytometriske profiler (HEL-bindende vs. CD45.1) av iGB celler etter restitusjonsfasen av «utvalgte» og «ikke-valgte» protokoller. Tallene i hvert vindu indikerer hvor stor andel av de Hy10 iGB celler (CD45.1
+, HEL-bindende, inngjerdet på CD19
+ celler) blant totalt CD19
+ iGB celler. (C) Fotografier av lungene av mus behandlet som i (A) 3 uker etter overføringen. Representative bilder av to mus av tre blir vist.
Diskusjoner
Basert på resultater ved hjelp av vår mus modell, her foreslår vi et nytt system for adoptiv overføring kreft immunterapi ved hjelp av B-celler. Med dette systemet kan man ekspandere naive B-celler til å produsere et stort antall GC-lignende B (iGB) celler og fra dem, kan sjeldne Ag-spesifikke B-celler velges og ytterligere utvidet ved den Fais system for anvendelse ved adoptiv overføring terapi . Vi viste at de overførte iGB cellene kolonis benmargen og produsert Ab, hovedsakelig av den lgG1 klasse, i flere uker. Ved hjelp av dette system, viste vi et eksempel på en effektiv kreftbehandling. Overføringen av iGB-celler som er spesifikke for et surrogat tumor Ag (HEL) trykkes metastase og vekst i lungene til melanomceller som uttrykker det samme Ag og forlenget overlevelse av resipientmus. Ved dette systemet kan tilpasses til å arbeide med humane B-celler, bør B-celle adoptiv overføring være et svært attraktivt alternativ til MoAb i cancer immunoterapi: det vil kreve en kortere tidsperiode fra identifisering av en tumor Ag for å starte behandlingen av pasienter enn å produsere en humanisert Moab, derfor vil fungere som en skreddersydd behandling som kunne målrette sykdommer med lav forekomst. I tillegg bør human-deriverte iGB celler produserer fullstendig human Ab i resipienten.
I den foreliggende undersøkelse, gjenstår det å formelt påvises hvordan overføringen av iGB celler resulterte i undertrykkelse av melanom vekst i lungene . Tatt i betraktning den høye serum-titer av HEL-spesifikke IgG1 opprettholdes i minst 4 uker etter overføringen (figurene 1B og 2E) og bindingen av slike lgG1 til HEL-uttrykkende melanomaceller ex vivo (figur 2F og 2G), tumor suppresjon er sannsynlig å være mediert av anti-HEL lgG1 produsert av iGB-celle-avledede plasmaceller. Således kan de mekanismene som er ansvarlige for tumor suppresjon være ADCC og /eller CDC, de samme mekanismene tilskrevet Moab legemidler in vivo [9], [10]. I denne forbindelse tidligere studier som sammenligner forskjellige isotyper av mus MoAb for deres antitumoreffekt in vivo så vel som in vitro viste at lgG1 viste moderate effekter in vivo og in ADCC, men ikke i CDC, mens IgG2a var den mest effektive i de fleste tilfeller, med IgG2b og IgG3 er variabel blant rapportene ved hjelp av ulike sett av MoAb og målceller [21] – [24]. Derfor, for å tilbøyelighet av B-celler avledet fra mus iGB cellekultursystem bytte nesten utelukkende til enten IgG1 eller IgE-isotyper kan ha begrenset effekt av behandlingen i vår musemodell; alle mus, selv de som ble behandlet med Ag-spesifikke iGB celler, til slutt døde. Det bør bemerkes at slike mus døde med store klumper av melanom tumorer i bukhulen, men bare noen få små tumorer ble funnet i lungene selv ved døden (data ikke vist), noe som indikerer at anti-tumor aktiviteten til Ab isotyper kan variere avhengig av vev blir infiltrert.
