Abstract
Epidermal growth factor-lignende domene holdig protein 7 (EGFL7) er oppregulert i menneskelige epiteltumorer og så er en potensiell biomarkør for malignitet. Faktisk har tidligere studier vist at høy EGFL7 uttrykk fremmer infiltrasjon og metastasering av magekreft. Epitel-mesenchymale overgang (EMT) initierer metastatisk kaskade og begaver kreftceller med invasiv og vandrende kapasitet; er det imidlertid ikke kjent om EGFL7 fremmer metastase ved å utløse EMT. Vi fant at EGFL7 ble overuttrykt i flere human magekreft (GC) cellelinjer og at overekspresjon fremmet celle invasjon og migrasjon som avslørt av grunnen såret og Transwell migrasjon analyser. Omvendt, shRNA-mediert EGFL7 knockdown redusert invasjon og migrasjon. Videre EGFL7-overekspresjon cellene vokste til større svulster og var mer sannsynlig å spre seg til leveren i forhold til underexpressing CG celler etter subkutan injeksjon i mus. EGFL7 overekspresjon beskyttet GC cellelinjer mot anoikis, noe som gir en plausibel mekanisme for denne forbedrede metastatisk kapasitet. I utskårende menneskelige mage svulster, uttrykk for EGFL7 var positivt korrelert med uttrykket nivåer av mesenchymale markør vimentin og EMT-forbundet transkripsjon repressor sneglen, og negativt korrelert med uttrykk av epitelceller markør E-cadherin. I GC cellelinjer, EGFL7 knockdown reverseres morfologiske tegn på EMT og redusert både vimentin og Snail uttrykk. I tillegg EGFL7 overekspresjon fremmet EGF-reseptor (EGFR) og proteinkinase B (AKT) fosfo-aktivering, effekter markert undertrykt av EGFR-tyrosinkinase-inhibitor AG1478. Videre AG1478 også redusert forhøyet invasiv og vandrende kapasitet på GC cellelinjer overekspresjon EGFL7. Sammen er disse resultatene sterkt at EGFL7 fremmer metastase ved å aktivere EMT gjennom en EGFR-AKT-sneglen signalveien. Forstyrrelse av EGFL7-EGFR-AKT-sneglen signalering kan en lovende terapeutisk strategi for magekreft
Citation. Luo B-H, Xiong F, Wang J-P, Li J-H, Zhong M, Liu Q-L, et al. (2014) epidermal vekstfaktor-Like Domain-inneholder protein 7 (EGFL7) Forbedrer EGF reseptor-AKT Signa, epithelial-Mesenchymale Transition, og metastasering av Gastric kreftceller. PLoS ONE 9 (6): e99922. doi: 10,1371 /journal.pone.0099922
Redaktør: Claudia D. andl, Vanderbilt University, USA
mottatt: 15 november 2013; Godkjent: 19 mai 2014; Publisert: 19 juni 2014
Copyright: © 2014 Luo et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av National Natural Science Foundation of China (nr 81001080) og Open-End Fund for de verdifulle og presisjonsinstrumenter av Central South University (nr JJ3121). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Magekreft kreft~~POS=HEADCOMP (GC) er den fjerde vanligste ondartet svulst og den nest største årsaken til kreft-relaterte dødelighet på verdensbasis [1], [2]. Omtrent halvparten av alle GC tilfellene oppstår i østasiatiske land, med særlig høy forekomst i Japan, Korea og Kina [3], [4]. Fremgang i systemisk behandling av GC har økt kortsiktig overlevelse; men er fortsatt fem års overlevelse på GC pasienter lav på grunn av tilbakefall og metastasering [5]. Videre har de fleste nylig diagnostiserte pasienter viser GC allerede metastatisk sykdom, som utgjør en stor terapeutisk utfordring for onkologi [6].
Epidermal vekstfaktor-lignende domene-inneholdende protein 7 (EGFL7), også kjent som vaskulær endotelial statin , er en endotelial celle-avledet utskilt faktor som regulerer vaskulær rør formasjon. Parker et al. [7] viste at EGFL7 er avgjørende for angiogenese under sebrafisk embryogenese [8]. Nyere studier har rapportert forhøyet uttrykk for EGFL7 i flere svulster og kreft cellelinjer, inkludert nyre svulster, maligne gliomer, hepatocellulært karsinom og tykktarm kreft [7] – [10]. Vi har tidligere demonstrert at EGFL7 er også overuttrykt i gastrisk karsinom [11], og ekspresjon ble signifikant korrelert med patologiske egenskaper, klinisk progresjon, dårlig prognose, og metastase [10], [12]. Derfor er EGFL7 en kandidat prediktiv faktor for kreft progresjon og metastasering. Imidlertid er mekanismene bak tumorigene virkningene av EGFL7 er uklare.
Metastase er en flertrinnsprosess som involverer en epitelial-mesenkymale overgang (EMT) hvori polariserte epitelceller blir omdannet til mesenchymale celler [13], en fenotype med større invasiv og vandrende kapasitet [14]. EMT er også en reversibel prosess som ofte oppstår ved invasiv foran mange metastatisk kreft [15]. Flere studier har vist at EGF fremmer kreftcellemigrering og invasjon samtidig med aktivering av EMT [16] – [18]. Betydelig, inneholder EGFL7 to EGF-lignende domener, noe som tyder på noen funksjonell homologi [9], [12]. Men om EGFL7 faktisk gjør forbedre EMT og fremme magekreft metastaser har ennå ikke bestemt. Videre de molekylære mekanismer som EMT er regulert i GC fortsatt i stor grad ukjent. Sink finger transcriptional repressor sneglen er kritisk for genuttrykk omprogrammering under EMT, særlig for undertrykkelse av celle-celle adhesjon protein endothelial (E) -cadherin, er tap som regnes som en viktig tidlig hendelse i EMT og nødvendig for senere metastaser [ ,,,0],19].
Denne studien forsøkte å finne ut om EGFL7 fremmer metastase ved å utløse EMT. Vi fant ut at EGFL7 overekspresjon aktiverer EGFR-AKT vei, utløser EMT, og fremmer GC celle invasjon
in vitro Hotell og metastase
in vivo
.
Materialer og metoder
pasienter og Tissue Collection
magekarsinom vev ble oppnådd fra 79 GC pasienter (58 menn og 21 kvinner) behandlet ved kirurgisk reseksjon ved kirurgisk avdeling, Xiangya Hospital, Central South University (Kina). Operasjoner ble gjennomført fra januar 2010 til desember 2012. Pasientene var 54,7 år i gjennomsnitt (område: 28 til 82 år). Og fikk verken får kjemoterapi eller strålebehandling før operasjon
Pasientene ble informert om at kirurgiske prøver ville brukes for konvensjonell patologisk diagnose, og at de gjenværende vev kan brukes til forskning. Ingen personlig pasientdata var nødvendig for denne undersøkelsen og de protokollene gjennomføres uten risiko, så bare muntlig informerte samtykke var nødvendig fra pasientene. Protokollen ble godkjent av etikkomiteen av Xiangya Hospital, Central South University (Permit Number: 201311389).
Sykdom oppsetningen ble definert i henhold til den sjette utgaven av TNM staging system av amerikanske Joint Committee on Cancer [ ,,,0],20], [21]. Svulstene var godt differensiert adenokarsinom i 12 saker, moderat differensiert i 34 tilfeller, og dårlig differensiert i 33 tilfeller. Alle prøver ble umiddelbart løst med 10% formalin, dehydrert, og parafin-embedded. Nøyaktig klinisk informasjon og patologisk diagnose var tilgjengelig for alle pasienter.
Immunohistochemistry
For immunhistokjemi, ble utarbeidet prøvene inkubert ved 60 ° C i 15 timer og kutt i 4 mikrometer tykke seksjoner, deparaffinized i terpentin, tørket, og rehydrert i en avtagende etanol: destillert vann gradient. Endogen peroksidaseaktivitet ble inaktivert ved inkubering i 30 minutter i 0,3% hydrogenperoksyd i 0,01 M fosfat-bufret saltvann (PBS). Skivene ble deretter inkubert i 15-20 minutter i citrat-buffer (pH 6,0) ved 95 ° C i antigen gjenfinning, blokkert med 5% normalt geiteserum i 0,01 M PBS i 15 min ved 37 ° C, og inkubert med primære antistoffer fortynnet i blokkeringsløsning over natten ved 4 ° C i et fuktet kammer. Følgende primærinnsidere antistoffer ble brukt: mus anti-EGFL7 monoklonalt antistoff (Abcam, USA, 1:400) og kanin monoklonale antistoffer dannet mot E-cadherin (CST, USA, 1:1000), vimentin (CST, USA, 1:1000 ), Snail (Proteintech, USA, 1:1000) og CD34 (BOOSTER, Kina, 1:500). Etter vasking, ble prøver suksessivt inkubert med biotinylert sekundært antistoff og streptavidin-pepperrot peroksydase (HRP) avidin arbeidsløsning. Immunolabeling ble visualisert ved hjelp av DAB underlaget kit fra Zhongshan Golden Bridge Company (Kina) i henhold til produsentens anbefalinger. Til slutt ble seksjonene motfarget med hematoksylin (Vector Laboratories, USA), dehydrert i en stigende etanol: destillert vann gradient, og som er montert på objektglass ved hjelp av Permount monteringsmedium (Fisher Scientific, USA)
Kvantifisering av Immunohistokjemiske signaler.
Alle GC og omkringliggende ikke-neoplastiske mage vev ble bekreftet histopathologically av to uavhengige patologer (K.-SW og J.-HL) blinde til den opprinnelige diagnosen. Immunfarging ble gradert ved en semi-kvantitativ metode som betraktes både intensiteten og fordeling av fargings [22]. Kort fortalt fem felt ble tilfeldig valgt under lav forstørrelse (100 ×, Olympus BX51, Tokyo, Japan), og 200 kreftceller telles fra hvert felt. Den fargeintensitet ble scoret som følger: 0, ingen farging; 1, svak gul flekker; 2, gul flekker; 3, brune flekker. Positive celler ble karakterisert ved en klar kant og gul eller brun farging distinkte fra bakgrunnen. Prosentandelen av positive celler (PP) ble gitt poeng som følger: 0, 0%; 1, 1% -25%; 2, 26% -50%; 3, 51% -75%; 4, 76% -100%. De to scorene ble kombinert for å oppnå følgende klassifisering: negativ farging, prøver med immunoreactive score (IRS) fra 0 til 2; svakt positiv farging, prøver med IRS på 3 til 5; sterkt positiv farging, prøver med IRS fra 6 til 7. Prøvene som viste svakt og sterkt positiv farging ble inkludert i den statistiske analysen.
Cellelinjer og kultur
Menneskelig GC cellelinjer SGC7901 (moderat differensiert adenokarsinom), BGC823 (dårlig differensiert adenokarsinom), MKN28 (godt differensiert adenokarsinom), og MKN45 (dårlig differensiert adenokarsinom) samt normal mageslimhinnen epitelceller GES-1 celler ble kjøpt fra Type Culture Collection av den kinesiske Academy of Sciences (Shanghai, Kina). Alle celler ble dyrket og opprettholdt i Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640-medium (Gibco Biocult, Paisley, UK) supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS) (Gibco Biotechnology), 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin ved 37 ° C i en fuktig atmosfære som inneholder 5% CO
2.
Kort hårnål RNA (shRNA) og rekombinant ekspresjon Plasmid Pex-to-EGFL7
For å generere cellelinjer overekspresjon eller underexpressing EGFL7, ble de innfødte cellelinjer stabilt transfektert med en ekspresjonsvektor eller målrettet shRNA. De shRNA sekvenser av menneskelig EGFL7 ble utformet i henhold til den menneskelige EGFL7 DNA-sekvensen (GenBank NO NM_016215.3.) Av Designer 3.0-programvaren (Genepharma, https://www.genepharma.com) og BLAST søk (http: //www. ncbi.nlm.nih.gov/BLAST). De målsekvenser ble sammenlignet med det humane genom databasen ved BLAST søk for å sikre at ingen høy homologi med andre kodende sekvenser. Sekvensene EGFL7-homo-333 og EGFL7-homo-887 ble identifisert som målområder for en bestemt EGFL7 shRNA. I tillegg ble en ikke-spesifikk sekvens (krafse shRNA) som er utformet som en negativ kontroll, og GAPDH-sekvensen ble utformet som en intern kontroll. De shRNA sekvenser var som følger:
EGFL7-shRNA1 mot EGFL7-homo-333: forstand, 5′-CACCGGTGCTGCTGATGTGGCTTTCAAGAGAAGCCACATCAGCAGCACCTTTTTTG-3 «; antisense, 5»-GATCCAAAAAAGGTGCTGCTGATGTGGCTTCTCTTGAAAGCCACATCAGCAGCACC-3 «; EGFL7-shRNA2 mot EGFL7-homo-887: forstand, 5»-CACCGAGTGGACAGTGCAATGAATTCAAGAGATTCATTGCACTGTCCACTCTTTTTTG-3 «; antisense, 5»-GATCCAAAAAAGAGTGGACAGTGCAATGAATCTCTTGAATTCATTGCACTGTCCACTC-3 «; ikke-spesifikk måte, 5»-CACC GTTCTCCGAACGTGTCACGTCAAGAGATTACGTGACACGTTCGGAGAATTTTTTG-3 «; antisense, 5»-GATCCAAAAAATTCTCCGAACGTGTCACGTAATCTCTTGACGTGACACGTTCGGAGAAC-3 «; GAPDH forstand, 5»-CACCGTATGACAACAGCCTCAAGTTCAAGAGA CTTGAGGCTGTTGTCATACTTTTTTG-3 «; antisense, 5»-GATCCAAAAAAGTATGACAACAGCCTCAAGTCTCTTGAACTTGAGGCTGTTGTCATAC-3 «. Den pGPU6 /GFP /Neo (grønt fluorescerende protein, neomycin) vektor (Genepharma Company, Shanghai, Kina) ble brukt for plasmid konstruksjon. Nukleotidene ble varmebehandlet og satt inn i BamHI og Hindlll setene og transformert inn i DH5a-kompetente E. coli. Doble kanamycin /neomycin-resistente kolonier ble valgt, og vektorsekvenser bekreftet ved restriksjonsspaltning og DNA-sekvensering.
EGFL7 cDNA som koder for aminosyresekvensen 533-1353 ble subklonet inn i en pEX-2-plasmid-vektor (Genepharma, Shanghai, Kina) ved Bglll /EcoRI dobbelt fordøyelsen og utpekt pEX-to-EGFL7. Det rekombinante plasmid ble amplifisert i DH5a-kompetente E. coli og vektorsekvensen amplifisert ved hjelp av PCR. DNA-sekvensering bekreftet at det rekombinante plasmid inneholdt en EGFL7 gen fragment identisk med det i GenBank (GenBank NR. NM_016215.3). Kanamycin /neomycin-resistente kolonier ble selektert og sekvensen bekreftet ved restriksjonsspaltning og DNA-sekvensering. Alle primere ble konstruert og syntetisert av Genepharma (Shanghai, Kina).
Stall Transfeksjon og G418 Selection
For å etablere en EGFL7-underexpressing klone (og hensiktsmessig kontroll), BGC823 celler ble sådd i seks -godt kulturplatene på 1 x 10
6 /brønn og inkubert i 24 timer i RPMI 1640 medium inneholdende 10% FBS i en fuktet 5% CO
2 atmosfære holdt ved 37 ° C. Cellene ble transfektert med 4 mikrogram pGPU6 /GFP /Neo-EGFL7-shRNA1, pGPU6 /GFP /Neo-EGFL7-shRNA2, pGPU6 /GFP /Neo-uspesifikke-shRNA eller pGPU6 /GFP /Neo-GAPDH-shRNA hjelp Lipofectamine 2000 transfeksjon reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) etter produsentens anvisninger. Etter 24 timer ble cellene inkubert i G418 (Sigma, USA, 600 ug /ml) for innledende valg, fortynnet, sådd ut ved lav tetthet (~ 1 celle /brønn) og holdt i dyrkningsmedium supplementert med G418 til halve det opprinnelige valget konsentrasjonen i ytterligere 3 uker. De resulterende stabile cellelinjer ble kåret BGC2-13 (cellelinje som følge av pGPU6 /GFP /Neo-EGFL7-shRNA1 stabil transfeksjon) og BGC-NC, og utvidet for senere studier. Ekspresjonsnivået av EGFL7 ble evaluert ved Western blot og sanntids RT-PCR. For å etablere en overuttrykkende linje og matchet kontroll, MKN28 celler ble sådd, transfektert med 4 ug av PEX-2-EGFL7 eller pEX-2-plasmider, og er valgt som beskrevet for BGC823 celler, bortsett fra at 500 pg /ml G418 ble anvendt for innledende valg. De resulterende stabile cellelinjer ble kåret MKN28-EGFL7 og MKN28-NC. Uttrykket nivåer av EGFL7 i G418-resistente kloner ble evaluert av Western blot og kvantitativ real-time PCR (QRT-PCR).
Western Blot analyse
Etter cellene nådde 80% -95% konfluens, total protein ble ekstrahert ved bruk av cellelysat ekstraksjonsbuffer (Beyotime, Kina) inneholdende protease-inhibitor (1 mM fenylmetylsulfonylfluorid). Lysatet total proteinkonsentrasjon ble bestemt ved anvendelse av en syre bicinchoninic proteinanalysesett (Pierce Bioteknologi, Rockford, IL, USA). Like mengder av protein (25 ug) fra hver behandlingsgruppe ble separert per gel kjørefelt med 8% natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) og overført til polyvinylidendifluorid (PVDF) membraner (Millipore, Billerica, USA). Membranene ble sekvensielt inkubert med blokkeringsbuffer bestående av Tris-bufret saltvann (TBS) inneholdende 5% fettfri tørrmelk i 2 timer ved romtemperatur og deretter over natten ved 4 ° C i den samme buffer med en av de følgende primære antistoffer: anti EGFL7 (1:500; Abcam Cambridge Science, UK). anti-E-cadherin, anti-vimentin, anti-Snail (alle på 1:1000, Cell Signaling Technology, CST, USA), anti-GAPDH (1:10000, Protech), anti-EGFR, anti-fosfor-EGFR, anti-AKT, anti-fosfor-AKT, anti-ERK, og anti-fosfor-ERK (alle 1:800, Anbo Biotech Co., Ltd., USA). Immunolabeled Membranene ble deretter inkubert med et HRP-konjugert sekundært antistoff (1:2000, Immunology Consultants Laboratory, Inc., USA) i 2 timer ved romtemperatur. Etter vask med TBST, ble proteinbånd visualisert ved hjelp av forbedret chemiluminescence deteksjonssystem (Advansta Corporation, Menlo Park, California, USA) i henhold til produsentens instruksjoner. Uttrykk for GAPDH ble brukt som en lasting kontroll og proteiner kvantifiseres ved hjelp UTHSCSA Image Tool 3.0. Target protein uttrykk ble beregnet som bandet intensiteten forholdet mellom målet protein til GAPDH.
RNA Utvinning og PCR-analyse
Celler ble lysert i TRIzol reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) og total RNA ble fremstilt i henhold til produsentens instruksjoner. Første belastningsskader cDNA ble syntetisert ved PrimeScript RT reagent Kit med gDNA Eraser (Takara, Otsu, Japan) og forsterket av PCR ved hjelp av følgende spesifikke primere: EGFL7 fornuft, 5′-GACCCTGTCTCCGAGTCGTTC-3 «; antisense, 5»-GATGGTTCGGTAGGTGCTGC-3 «. CDNA av GAPDH ble amplifisert for å kontrollere for mengden av cDNA til stede i hver prøve (forstand, 5»-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3 «, antisense, 5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3»). PCR-amplifikasjon ble utført ved 94 ° C i 5 minutter, etterfulgt av 30 sykluser ved 94 ° C i 30 s, 57 ° C i 30 s, og 72 ° C i 40 sek. PCR produktene ble separert på 1,0% agarosegeler og målet genuttrykk kvantifisert som forholdet målgenet bandet intensitet som for GAPDH ved hjelp av Image Tool 3.0 (The University of Texas Health Science Center, San Antonio, Texas, USA).
real-time PCR
reaksjons~~POS=TRUNC blandingen~~POS=HEADCOMP for real-time PCR bestod av 10 ul Premiks Ex Taq (Probe qPCR), 0,2 mikrometer av hver EGFL7 og GAPDH primer (nedenfor), 0,2 pmol /ml TaqMan prober (EGFL7 eller GAPDH), og 0,4 pl ROX (tetrapropano-6-carboxyrhodamine) Annonse Dye II (Takara Bio, Shiga, Japan). Blandingen ble kombinert med 2 ul cDNA i hver brønn av en 96-brønns mikroampere plate (Applied Biosystems, CA, USA) og destillert vann ble anvendt til å justere til et endelig volum på 20 ul. Følgende primere ble utformet ved hjelp av Primer Premier 6,0 programvarepakke (Premier Biosoft International, Palo Alto, CA, USA): EGFL7: fremover, 5′-GACCCTGTCTCCGAGTCGTTC-3 «; omvendt, 5»-GATGGTTCGGTAGGTGCTGC-3 «; GAPDH: forover, 5»-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3 «; omvendt, 5»-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3 «. Alle reaksjoner ble utført på en 7500 Real-Time PCR System (Applied Biosystems, CA, USA). Thermocycle forholdene var innledende denaturering ved 95,8 ° C i 30 s etterfulgt av 40 sykluser med amplifikasjon ved 95,8 ° C i 6 s og 60,8 ° C i 30 sek.
samme forsøksbetingelser ble brukt for å vurdere ekspresjonen av annen gener med de følgende primere: E-cadherin: forover, 5′-GAGTGCCAACTGGACCATTCAGTA-3 «; omvendt, 5»-AGTCACCCACCTCTAAGGCCATC-3 «; vimentin: fremover, 5»-GACGCCATCAACACCGAGTT-3 «; omvendt, 5»-CTTTGTCGTTGGTTAGCTGGT-3 «; Snail: fremover, 5»-TGCTCCACAAGCACCAAGA-3 «; omvendt, 5»-GCAGAGGACACAGAACCAGAAA-3 «; GAPDH: forover, 5»-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3 «; omvendt, 5»-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3 «. Reaksjonsblandingen for real-time PCR bestod av 10 ul av SYBR Premiks Eks TaqTM II, 1,6 ul av hver primer (0,4 uM), 0,4 ul av ROX referanse Dye, 2 pl templat cDNA, og 6 pl dietylpyrokarbonat-behandlet vann. Sanntids-PCR ble utført på en 7500 Real-Time PCR System (Applied Biosystems, CA, USA) med følgende thermocycle betingelser: innledende denaturering ved 95 ° C i 10 s, etterfulgt av 40 sykluser med amplifisering ved 95 ° C i fem s og 60 ° C i 34 s.
Cell Proliferation Assay
celleproliferasjon ble anslått av 3- [4,5-dimetyltiazol-2-yl] -2,5-difenyl tetrazoliumbromid (MTT) levedyktige celleanalyse. Celler ble sådd ut på 96-brønners plater ved 2000 /brønn og dyrket i 12, 24, 48, 72 og 96 timer. Deretter ble 20 pl MTT (Sigma) stamløsning (5 mg /ml) tilsatt til 200 ul av medium i hver brønn, og platene ble inkubert i ytterligere 4 timer ved 37 ° C. Etter forsiktig aspirasjon av dyrkningsmediet, ble 150 ul dimetylsulfoksid (DMSO) tilsatt til hver brønn for å oppløse formazankrystaller dannet fra MTT av levedyktige celler. Platene ble rystet på en roterende plattform i 10 minutter, og absorbansen målt ved 490 nm ved anvendelse av en mikroplateleser.
Plate kolonidannelse Assay
Cellene ble sådd ut på 200 /brønn i samme seks- brønners plater som brukes til andre analyser for å vurdere kolonidannelse i henhold til celle-adherente betingelser. Etter 10 dager ble cellene farget med 1% Giemsa, og antall synlige kolonier ble tellet. Den relative klone formasjon indeksen ble beregnet som gjennomsnitt antall kolonier /antall seeded celler × 100%.
Scratch sårtilheling Analyser
For å analysere cellemigrasjon, 5 × 10
5 celler /brønn ble sådd ut i seks-brønners plater belagt med 10 pg /ml fibronektin (FN) og inkubert i 24 timer. Monolaget ble deretter avbrutt av en enkelt ripe ved hjelp av en 200 ul pipettespiss. Mikrobilder ble tatt ved 0, 12, 24, 36, 48 og 72 timer etter ripe med et fase-kontrast mikroskop (Olympus BX51, Japan). Antallet av celler i den riper (golde) region av mikro ble tellet i fem felter (forstørrelse: x 200). Alle forsøkene ble utført i duplikat.
In vitro
Invasion og migrasjon analysen
Cell invasjon og migrasjon ble evaluert ved hjelp av Transwell kamre (Corning, New York, USA). Invasjons analyser ble utført i Transwell kammere adskilt av polykarbonatmembranfilterinnsatser (8 um porer) i 24-brønners plater. Hvert kammer ble belagt med 100 pl 1:20 Matrigel (Becton, Dickinson and Company, New York, USA) i kald RPMI 1640 over natten ved 4 ° C. Deretter ble celler (5 x 10
4 /mL x 200 ul) ble sådd ut i det øvre kammer i serumfritt medium. Omtrent 800 ul av medium kondisjonert med 10 pg /ml fibronektin ble plassert i det nedre kammeret av transwellkammeret som et kjemotiltrekkende. Etter inkubering i 24 timer ved 37 ° C, ble de gjenværende tumorceller på den øvre overflaten av kammeret fjernes ved å tørke med våte bomullspinner. Invaderende celler på den nedre overflate ble fiksert med 4% para-formaldehyd, farget med krystallfiolett og tellet under et fase-kontrast mikroskop (Olympus, Japan) ved 200 x. Fire uavhengige eksperimenter ble utført i triplikat for alle behandlingsbetingelsene.
In vitro
migrasjons Analysene ble gjennomført under de samme vilkår som invasjonen analyser, men med ubestrøket nedre kammer og bruker 1 x 10
5 celler /ml (200 mikroliter).
Anoikis assay
poly-hydroksyetylmetakrylat (poly-HEMA, Sigma-Aldrich), som hemmer celleadhesjon til kulturplater og andre vekstflater, ble rekonstituert i 95% etanol til en sluttkonsentrasjon på 12 mg /ml. For å fremstille poly-HEMA-belagte plater, 2 ml av denne løsning ble tilsatt til hver brønn i en 6-brønns plate og fikk tørke natten over under en laminær strømningshette vevskultur. Deretter 5 × 10
4 celler ble sådd ut i tre eksemplarer i hver poly-HEMA-belagt godt med vanlige kulturmedier. Etter 24 timer ble cellene høstet GC, renset med PBS og resuspendert i 500 ul bindingsbuffer fra en Annexin V-PE /7-AAD Apoptose Detection Kit (eBioscience, San Diego, USA). Resuspenderte celler fra hver prøve ble alikvotert (100 ul) i fire rør. Tre rør ble merket med enten Annexin V-PE, 7-AAD, eller begge deler, mens den fjerde ble anvendt som et umerket kontroll. Hver sats ble deretter analysert ved hjelp av strømningscytometri på en Beckman Coulter-FC 500 teller (Beckman Coulter, Inc.). Prosentandelen av apoptotiske celler ble avledet som summen av cellefraksjoner som viser tidlig apoptose (annexin-V-positive) og sen apoptose (7-AAD-positive).
Xenotransplantat Nude Mouse Model
Xenografting av GC cellelinjer ble utført i henhold til de nasjonale retningslinjene for omsorg og bruk av forsøksdyr (publikasjon nr. 86-23, revidert 1985), ble godkjent av Animal Care og bruk komité av den tredje Xiangya Hospital, Central South University ( LLSC [LA] 2013-0010), og likedannet gjeldende kinesisk lov om vern av dyr (LLSC [LA] 2013-0010). Alle forsøk ble gjort for å minimere antall mus brukes og deres lidelser.
Trettifem Balb /c nakne mus alder 4-6 uker ble kjøpt fra SLAC Laboratory Animal Co Ltd (Shanghai, Kina) og holder til i individuelt ventilerte bur. Mus ble tilfeldig delt inn i BGC823, BGC-NC, BGC2-13, MKN28, MKN28-NC, MKN28-EGFL7, og kontrollere PBS grupper (n = 5 mus /gruppe). Dyrkede celler ble høstet og resuspendert i PBS ved 1 x 10
8 celler /0,2 ml. Suspensjonen ble injisert subkutant inn i den venstre øvre ende av hver naken mus med unntak av de i kontrollgruppen som ble injisert med 0,2 ml PBS. Tumorvekst ble evaluert etter 3 dager ved å måle Tumordiametere med Vernier calipers. Tumorvolum (TV) ble beregnet i henhold til formelen: TV (mm
3) = d
2 x D /2, hvor D og D er den korteste og lengste diameter, respektivt. Musene ble avlivet ved 4 uker etter celle implantasjon, og tumorene ble ekstrahert og veiet. Alle lever ble kontrollert for metastasering av hematoxylin og eosin (H 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Resultater
EGFL7 Expression ble hevet i Human magekreft cellelinjer
Western blot og RT. PCR ble utført for å sammenligne EGFL7 uttrykk i den menneskelige GC cellelinjer SGC7901, BGC823, MKN45, og MKN28 til at i normale mageslimhinnen epitelceller GES-1 celler. Forhøyede nivåer EGFL7 ble funnet i alle fire GC-cellelinjer sammenlignet med GES-1, med BGC823 og MKN28 viser den høyeste og laveste EGFL7 uttrykk, henholdsvis, både på protein og mRNA-nivåer (figur 1A og 1B). Derfor ble BGC823 og MKN28 brukt i senere eksperimenter for å vurdere virkningene av EGFL7 uttrykk på spredning, migrasjon, og metastatisk potensial. Vi ansatt stabil shRNA transfeksjon å undertrykke EGFL7 uttrykk i BGC823 celler og utformet et menneske EGFL7 høy-uttrykk plasmid (PEX-to-EGFL7) for å øke EGFL7 uttrykk i MKN28 celler.
(A) Expression nivåer av EGFL7 protein i GC cellelinjer SGC7901, BGC823, MKN45, og MKN28, og den normale gastriske cellelinje GES-1 ble undersøkt ved Western blot. De GC cellelinjer viste høyere EGFL7 protein uttrykk nivåer enn GES-1 celler, med BGC823 celler som har de høyeste EGFL7 protein expression nivåer. (B) QRT-PCR viste at BGC823 hadde høyest EGFL7 mRNA uttrykk. Western blot og PCR-eksperimenter ble utført in triplo, og GAPDH ble benyttet som intern kontroll. (C) QRT-PCR viste at shRNA1 sekvensen resulterte i 75% inhibering av EGFL7 mRNA-ekspresjon, mens den shRNA2 sekvensen resulterte i bare 30% inhibering. (D) BGC823 cellelinjer stabilt transfektert med pGPU6 /GFP /Neo-EGFL7-shRNA1 eller pGPU6 /GFP /Neo-uspesifikke-shRNA er utpekt BGC2-13 og BGC-NC, henholdsvis. MKN28 cellelinjer transfektert med pEX-2-EGFL7 eller pEX-2-ikke-spesifikk er betegnet MKN28-EGFL7 og MKN28-NC, respektivt. Expression of EGFL7 protein var markert lavere i BGC2-13 celler sammenlignet med BGC823 og BGC-NC celler, og markert høyere i MKN28-EGFL7 celler i forhold til MKN28 og MKN28-NC celler. (E) EGFL7 ekspresjonsnivåer ble også analysert ved hjelp av QRT-PCR, og resultatene bekreftet Western blot-data. GAPDH fungert som internkontrollen for både QRT-PCR og Western blot. Feilfelt representerer SD av tredoble eksperimenter (*
P
0,05).
Vi bygget to shRNA plasmidvektorer rettet mot EGFL7 mRNA og gjennomført QRT-PCR for å vurdere effekten av disse kandidat shRNA sekvenser for å undertrykke EGFL7 sammenlignet med ikke-spesifikke sekvenser. De shRNA1 og shRNA2 sekvenser oppnådd 75% og 30% hemning av EGFL7, henholdsvis (figur 1C), slik at mer effektiv shRNA1 ble brukt for alle etterfølgende eksperimenter. De BGC823 linjer stabilt transfektert med pGPU6 /GFP /Neo-EGFL7-shRNA1 eller pGPU6 /GFP /Neo-uspesifikke-shRNA ble utpekt BGC2-13 og BGC-NC, henholdsvis. De MKN28 linjer som stabilt transfektert med pEX-2-EGFL7 og pEX-2-ikke-spesifikk ble betegnet MKN28-EGFL7 og MKN28-NC, respektivt. Uttrykket nivåer av EGFL7 protein og mRNA i G418-resistente kloner ble også undersøkt ved hjelp av Western blot (Fig 1 D) og sanntids RT-PCR (figur 1E). Resultatene viste markert redusert EGFL7 uttrykk i BGC2-13 celler sammenlignet med BGC-NC celler og betydelig forhøyet uttrykk i MKN28-EGFL7 celler i forhold til MKN28-NC celler (alle
P
0,05). Det var ingen signifikante forskjeller i mRNA og protein uttrykk mellom BGC-NC og BGC celler eller mellom MKN28-NC og MKN28 celler (alle
P
0,05).
EGFL7 Forfremmet GC Cell Invasion og migrasjon, men ikke påvirke GC Cell Proliferation
for å undersøke hvilken rolle EGFL7 i GC progresjon, vi først undersøkt om EGFL7 stanse eller overekspresjon endret proliferativ, krenkende, og trekkende kapasiteter på GC-celler. Scratch sårtilheling ble anvendt for å måle migrering av stabilt transfekterte celler. Et sår ble generert på GC-cellemonolagene ved en ripe og antallet av celler i bunnen av sonen sammenlignet ved 0 og 48 timer. Lukking av såret var betydelig tregere i BGC2-13 kulturer (underexpressing EGFL7) i forhold til opprinnelig BGC823 og BGC-NC kulturer (32%
vs.
100% og 98%, både
P
0,05) (figur 2A). I motsetning til nedleggelsen var betydelig raskere i MKN28-EGFL7 kulturer (overekspresjon EGFL7) sammenlignet med MKN28 og MKN28-NC kulturer (99%
vs.
49% og 50%, både
P
& lt 0,05) (figur 2B). Wu et al.
