Abstract
Hypoksi spiller en viktig rolle i motstanden av kreftceller til kjemoterapi. Imidlertid er de nøyaktige mekanismer som ligger under denne prosess ikke godt forstått. Videre, i henhold til cellelinjene, hypoksi annen måte påvirker celledød. Studiet av virkningen av hypoksi på apoptose indusert ved 5 kjemoterapeutiske medikamenter i 7 kreftcelletyper viste at hypoksi vanligvis hemmet medikamentindusert apoptose. I de fleste tilfeller er virkningen av hypoksi var den samme for alle legemidler i en celletype. Uttrykket profil av 93 gener involvert i apoptose, så vel som proteinnivået av BCL-2 familie proteiner ble deretter undersøkt. I HepG2 celler som er sterkt beskyttet mot celledød ved hypoksi, nedsatt hypoksi overflod av nesten alle pro-apoptotiske BCL-2 familien proteiner mens ingen av dem er redusert i A549 celler som ikke er beskyttet mot celledød ved hypoksi. I HepG2 celler, redusert hypoksi NOXA og BAD overflod og modifisert den elektro mobilitet av BIM
EL. BIM og NOXA er viktige mediatorer av etoposid-indusert celledød i HepG2-celler og den hypoksi-indusert modifikasjon av disse proteiner overflod eller post-translasjonelle modifikasjoner delvis står for chemoresistance. Til slutt, modulering av overflod og /eller av de post-translasjonelle modifikasjoner av de fleste proteiner av familien BCL-2 av hypoksi omfatter p53-avhengig og trasé-uavhengig og er celletype-avhengig. En bedre forståelse av disse celle-til-celle variasjoner er avgjørende for å overvinne hypoksi-indusert motstand og til å forbedre kreftbehandling
Citation. Sermeus A, Genin M, Maincent A, Fransolet M, Notte A, LECLERE L, et al. (2012) Hypoksi-Induced Modulation av apoptose og BCL-2 Familie Proteiner i ulike kreftcelletyper. PLoS ONE 7 (11): e47519. doi: 10,1371 /journal.pone.0047519
Redaktør: Elad Katz, University of Edinburgh, Storbritannia
mottatt: 04.06.2012; Akseptert: 12. september 2012; Publisert: 05.11.2012
Copyright: © 2012 Sermeus et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. AS og AN er Stipendiat av FNRS (Fonds de la Recherche Scientifique, Belgia). MG og LL støttes av FRIA (Fonds pour la Recherche dans l’Industrie et l’Agriculture, Belgia). HR er mottaker av en FNRS-Télévie stipend. Denne artikkelen presenterer resultatene av den belgiske Program på Interuniversity polakker of Attraction initiert av den belgiske stat, Statsministerens kontor, Science Policy programmering. Ansvaret ligger hos sine forfattere. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Kreft er en av de viktigste årsakene til dødsfall i utviklede land. Behandlinger inkluderer ofte bruk av kjemoterapi, men medikamentresistens er en vanlig årsak til behandlingssvikt og tilbakefall. De fleste cellegifter indusere celledød ved å utløse apoptose. Apoptose er regulert av proteiner av BCL-2 (B-celle lymfom-2) familien som hovedsakelig virker på det mitokondrielle nivå. Denne familien av proteiner kan deles inn i tre kategorier i henhold til funksjon og struktur av proteiner [1]. Først, BAX-lignende proteiner, slik som BAX (BCL-2-assosiert protein x) og BAK (BCL-2 homolog antagonist /spekk), er død faktorer. Når aktivert, oligomerise de i mitokondriene og indusere mitokondrie ytre membran permeabilisation, som provoserer celledød. De BCL-2-lignende proteiner, slik som BCL-2, BCL-xL (B-celle-lymfom-ekstra stor), BCL-w og MCL-1 (myeloid leukemi celle 1), er overlevelsesfaktorer. De danner heterodimerer med BAX /BAK og hemme deres handling. Til slutt, BH3 (BCL-2 homologi domene 3)-bare proteiner, slik som BID (BH3-veksel domene død agonist), BAD (BCL-2-antagonist av celledød), BIM (BCL-2-veksel mediator av celle død), BIK (BCL-2 samspill morder), PUMA (p53 oppregulert modulator av apoptose) og NOXA, indusere apoptose ved å nøytralisere de antiapoptotic BCL-2-lignende molekyler og, for noen av dem, ved direkte aktivering BAX /BAK. Hos friske celler, BH3-bare proteiner er enten ikke finnes eller holdt inaktiv eller sequestered. Etter proapoptotiske signaler, blir de transcriptionally oppregulert og /eller post-translatorisk modifisert (og /eller relocalised) for å få sin fulle proapoptotiske funksjon [1], [2].
En av de viktigste årsakene til motstand mot cellegift indusert apoptose er p53 mutasjon. p53 er faktisk en sentral spiller for induksjon av apoptose i belastede celler [3], [4] En annen velkjent årsak til motstanden er tumor hypoksi [5]. Effektene av hypoksi på kreftceller er celletype avhengig og varierer avhengig av intensiteten og varigheten av mangel på O
2. Alvorlig og langvarig hypoksi kan initiere apoptose eller nekrose mens mild hypoksi er beskyttende [6], [7]. Faktisk, griper mild hypoksi med flere komponenter i den apoptotiske reaksjonsvei på transkripsjons samt ved post-translasjonell nivå.
Tidligere resultater fra vår gruppe viste at hypoksi beskytter tumorceller fra apoptose fremkalt av kjemoterapeutiske midler. Hypoksi beskytter HepG2-celler mot etoposid-indusert apoptose samt MDA-MB231-celler mot paclitaxel-indusert apoptose [8], [9], [10]. Imidlertid i andre celletyper, kan hypoksi har ingen effekt, eller til og med forverre apoptose indusert av kjemoterapeutiske midler. Det er for eksempel tilfellet for etoposid-indusert apoptose av A549 og MCF-7-celler, så vel som for epirubicin-indusert apoptose av MDA-MB231-celler [8], [10]. Disse resultatene er også understreket at celle responser på hypoksi er svært kompleks, med forskjellige signaloverføringsveier samt flere transkripsjonsfaktorer. Spesielt synes p53 transkripsjonsfaktor til å spille en viktig rolle i celle oppførsel under hypoxi [8]. Målet med dette arbeidet er å forstå hvordan hypoksi kan forskjellig påvirke kjemoterapeutiske medikamentindusert apoptose i kreftceller. Derfor må vi først utvidet våre tidligere observasjoner ved hjelp av syv kreftcellelinjer, med opprinnelse fra ulike organer og har forskjellig p53 status, utsatt for 5 apoptose-induserende legemidler brukt i kjemoterapi som er rettet mot ulike cellulære veier. I de fleste tilfeller, hypoksi delvis hindret celledød og virkningen av hypoksi var den samme for alle legemidler i en celletype. For det andre, observerte vi at hypoksi modulert overflod av de fleste proteiner av BCL-2-familien i en celletype-avhengig måte. For det tredje, i HepG2 celler som er beskyttet av hypoksi mot etoposid-indusert celledød, observerte vi en nedgang i dårlig og NOXA protein nivå samt en endring i elektro mobilitet av BIM
EL (BIM ekstra lang) i hypoksi- ruges celler. Resultater fra invalide studier tyder på at den samlede tap av BIM og NOXA under hypoksi i hvert fall delvis utgjorde chemoresistance.
Materialer og metoder
Cell Kultur og hypoksi Inkubasjon
Menneske lever HepG2 celler, menneske lungekarsinom A549 celler, menneskelig bryst adenokarsinom MDA-MB231 celler, menneske hepatoma Hep3B celler, menneske osteogene sarkom U2OS celler, menneskelige kolon adenokarsinom HT-29 celler og menneskelige prostata adenokarsinom PC-3 celler (ATCC) ble opprettholdt i kultur i 75-cm
2 polystyren kolber (Costar) med henholdsvis D-MEM (lav glukose) (Gibco), MEM (Gibco), RPMI 1640 (Gibco), RPMI 1640 (Gibco) inneholdende 50 U /ml penicillin og 50 ug /ml streptomycin (Gibco), Mc Coy s 5A medium (Gibco), RPMI 1640 (Gibco) og F12 Kaighn medium (Gibco) inneholdende 10% FCS og inkubert under en atmosfære inneholdende 5% CO
2.
For hypoksi eksperimenter ble cellene inkubert i serumfritt CO
2-uavhengig medium (Invitrogen) supplert med 0,5 mM L-glutamin (Sigma) med eller uten etoposid (Sigma), metotreksat (Sigma), paklitaxel (Molecular Probes), cisplatin (Sigma) eller kamptotecin (Sigma) i 16 timer. Inkubasjonstiden etter hypoksi ble utført i hjemmelagde inkubatorer som inneholder 99% N
2 og 1% O
2. Nivået av hypoksi i mediet i våre eksperimentelle betingelser er 10 mm Hg av oppløst oksygen i mediet. Dette nivået av hypoksi oppnås etter ca 10 min med inkubasjon. PO
2 nivået ble målt ved anvendelse av en oppløst oksygenmåler (Inolab Oxi 730) er utstyrt med en Cellox 325 probe. Normoksisk kontrollceller ble inkubert i samme forhold, men i normal atmosfære (21% O
2)
siRNA Transfeksjon
siGENOME SMARTpool menneske (Dharmacon; brukt på 50 nM). BCL2L11 ( BIM, M-004383-02), ble PMAIP1 (NOXA, M-005275-03), BAD (M-003870-02) eller TP53 (M-003329-03) transfektert med DharmaFECT1 transfeksjon reagens (Dharmacon, brukt på en 1:500 fortynning). Når man kombinerer BIM og NOXA siRNA ble hver siRNA brukt på 25 nM. Den siGENOME RISC-fri kontroll siRNA (D-001220-01, Dharmacon som anvendes ved 50 nM) eller siGENOME ikke-målsøkende siRNA Pool # 1 (D-001206-13, Dharmacon som anvendes ved 50 nM) ble anvendt som negative kontroller. Celler ble inkubert i 24 timer med transfeksjon medium og mediet ble deretter erstattet med friskt medium med 10% FCS. 6 timer senere (eller 30 timer senere for BIM siRNA) ble cellene inkubert i henhold hypoksi eller normoxia med kjemoterapi eller ikke.
subcellulære fraksjonering
Cells, seeded i 75 cm
2 kolber, ble høstet i sakkarose M /4 og homogenisert med 3 slag av en B stempel i en Dounce. Homogenatet ble sentrifugert 10 minutter ved 1418
g plakater (Labofuge 400R Heraeus Instruments). Supernatanten ble utvunnet og sentrifugert ved 81 085
g plakater (Beckman L7-35, rotor 50 Ti) for en varighet avhengig av volumet. Pelleten ble resuspendert i sakkarose M /4 og navngitt MLP fraksjon. Supernatanten ble konsentrert ved sentrifugering i Amicon ultra-4 rør (Millipore) og kalt S-fraksjonen. Alle prøvene ble endelig homogenisert ved sonikering.
Western Blot analyse
Protein ekstraksjon ble utført som beskrevet i [9]. Proteiner ble separert ved SDS-PAGE på 15% polyakrylamid-gel, på 4-12% Bis-Tris NuPAGE geler med MES-buffer (Invitrogen) eller på 3-8% NuPAGE Tris-acetat-geler (Invitrogen) og deretter overført til en PVDF-membran (Hybond-P, Amersham for chemiluminescence påvisning eller Immobilon-FL, Millipore for fluorescens deteksjon). Kjemiluminescens deteksjon ble utført som beskrevet i [11] ved hjelp av inkubasjon over natten med spesifikke primære antistoffer. For fluorescens-påvisning ble membranene blokkert i 1 time ved romtemperatur i Odyssey blokkeringsbuffer (LI-COR), og deretter over natten ved 4 ° C i Odyssey blokkeringsbuffer med 0,1% Tween inneholdende et spesifikt antistoff. Etter 4 x 5 minutter vaskinger i PBS-Tween 0,1%, den inkubasjon med det sekundære antistoff (geite-anti-kanin eller anti-mus IRDye-merkede antistoff, LI-COR, 1:10,000 fortynning) ble utført i 1 time i Odyssey blokkering buffer med 0,1% Tween, fulgt av 4 vaskinger av 5 minutter i PBS-Tween og 2 vaskinger i PBS. Membranen ble deretter tørket i 1 time ved 37 ° C og skannes ved hjelp Odyssey infrarødt avbildningssystem (LI-COR).
Immunofluorescence Farging
HepG2-celler ble sådd på 40.000 celler /brønn på glassdeksel lysbilder i 24-brønners plater. Etter inkubasjon med eller uten etoposid eller paclitaxel, ble immunofluorescens farging utført som beskrevet i [11]. Primært antistoff for alfa-tubulin-farging var mus anti-alfa-tubulin (# T5186 Sigma) (1/100 fortynning). Alexa Fluor-647-konjugert anti-muse-IgG-antistoff (Molecular Probes) ble benyttet ved 1 /1.000 fortynning.
Caspase-3/7 Aktivitetsanalyse
fluorogent substrat Ac-DEVD-AFC (BD Pharmingen) ble anvendt for å måle caspase-3/7-aktivitet i henhold til [12]. Celleekstrakter ble fremstilt som beskrevet i [13]. Celler ble sådd i 25-cm
2 kolber. Analysen for caspase-3/7-aktivitet ble utført ifølge [8] ved anvendelse av 20 ug av ekstraktene.
laktatdehydrogenase utløsning Assay
Laktat-dehydrogenase (LDH) frigjøring ble målt med «Cytotoksisitet Detection Kit «fra Roche Applied Science som beskrevet i [9]. Kulturmediet fra inkuberte celler ble fjernet og sentrifugert for å pelletere cellefragmenter og apoptotiske legemer. For å lysere cellene, ble Triton X100 (Merck) ved 10% i PBS lagt på denne pellet, så vel som på cellene gjenværende festet på bunnen av brønnene. Den prosentvise LDH-frigjøring ble beregnet som følger: [LDH-aktivitet i medium (1) + LDH aktivitet av celler fragmenter og apoptotiske legemer (2)] /[(1) + (2) + LDH aktivitet av celler som var tilbake i brønnene].
Transient transfeksjon og Luciferase Assay
Cell transfeksjon ble utført i 24-brønners plater (50.000 celler per brønn for HepG2 og MDA-MB231 celler, 30.000 for A549 celler, og 40 000 for Hep3B celler) med Superfect reagens (Qiagen). 923 ng (1385 ng for MDA-MB231-celler) av reporter plasmidet pGL3- (PGK-HRE6) -tk-Luc, som inneholder 6 HRE cis-elementer fra PGK-genet koblet til tymidin kinase basal promoteren og til ildflueluciferase -genet [14], ble ko-transfektert med 577 ng (115 ng for MDA-MB231-celler) på normalisering vektor (pCMVβ vektor som koder for β-galaktosidase, Clontech) i medium uten serum i 6 timer (eller 3 timer for Hep3B cellene før du bytter medium med frisk medium). Deretter ble cellene inkubert i henhold til hypoksi eller normoxia i 16 timer. Etter inkubering ble cellene lysert i passiv Lysis Buffer (Promega) og β-galaktosidase ble analysert i parallell med den ildflue luciferase aktiviteten analysert ved anvendelse av Luciferase Assay System (Promega).
Taqman Low Density Array
Etter inkuberingen, ble total RNA ekstrahert ved anvendelse TRI reagensoppløsning (Applied Biosystems). mRNA som finnes i to mikrogram total RNA ble revers transkribert ved hjelp av «High Capacity cDNA Reverse Transcription kit» fra Applied Biosystems i henhold til produsentens instruksjoner. 100 ng av retrotranscribed total RNA i 50 ul ble deretter blandet med 50 ul av de «Taqman Universal PCR masterblanding» (Applied Biosystems) og lastet inn i en av de 8 fyllportene til mikrofluid matrisen. «TLDA Menneskelig apoptose Panel» er 384-brønns microfluidic kort som inneholder analyser for 96 menneskegener. De gjør det mulig å utføre 96 real-time PCR reaksjoner samtidig i 4 prøver. mRNA uttrykk nivå ble kvantifisert ved hjelp terskelen syklusen metoden med 18S som referanse genet.
RT Real-time-PCR for mRNA Kvantifisering
Etter inkubasjon, total RNA ble ekstrahert ved hjelp av TRI Reagens Solution (Applied Biosystems). mRNA som inneholdes i 2 ug total RNA ble revers transkribert ved hjelp av Superscript II revers transkriptase (Invitrogen). Forover og bakover grunning sekvenser er tilgjengelig i tabell S1 og ble utformet med Primer Express 1.5-programvare (Applied Biosystems). Amplification reaksjons analyser inneholdt 1 x SYBRGreen PCR Master Mix (Applied Biosystems) og primere (Applied Biosystems, 300 nM). RPL13A ble benyttet som referanse genet for normalisering og mRNA-ekspresjonsnivået ble kvantifisert ved hjelp av terskelsyklusen metoden.
Heatmap og Statistiske analyser
Heatmaps ble generert med dataene transformeres logaritme med grunntall 2 i resultater for TDLA (n = 1), og av midlene for tre verdier for QRT-PCR-resultater. Statistiske analyser ble utført med ANOVA en og Tukey er flere sammenligningstester ved hjelp GraphPad Prism.
Resultater
Hypoksi har ulike effekter på Legemiddelutløst celledød i ulike celletyper
for å få ytterligere innsikt i mekanismene initiert av hypoksi som fører til kreft celle motstand, utvidet vi våre tidligere observasjoner ved hjelp av andre kreftcellelinjer som stammer fra ulike organer og har forskjellig p53 status og andre apoptose-induserende cellegifter som er rettet mot ulike cellulære trasé . Cellelinjene som benyttes er HepG2 (p53 villtype hepatomceller), A549 (p53 villtype lunge carcinoma celler), U2-OS (p53 villtype osteogene sarkomceller), MDA-MB231 (p53 mutert bryst adenokarsinomceller), HT-29 (p53-mutant tykktarm adenokarsinomceller), Hep3B (p53 null hepatomceller), og PC-3 (p53 null prostata adenokarcinomceller) celler. De kjemoterapeutiske midler valgt er etoposid (en topoisomerase II-inhibitor), metotreksat (en DNA og RNA-syntese inhibitor), paklitaxel (en inhibitor av mikrotubul-dynamikk), cisplatin (et alkyleringsmiddel) og camptothecin (en topoisomerase I-inhibitor).
Først den konsentrasjon av medikament til bruk i hver celletype ble valgt ved å analysere caspase-3/7-aktivitet etter 16 timers inkubering med medikamentene. I hvert tilfelle ble en konsentrasjon som induserer apoptose moderat valgt. For de midler som induserer ingen kaspase-aktivitet, ble deres generelle toksisitet evaluert ved å måle laktat-dehydrogenase (LDH) frigjøre 40 timer etter inkubering med agenter. Når konsentrasjonene ble valgt, var virkningen av hypoksi (1% O
2) på celledød indusert av hvert middel i hver celletype overvåket av de to samme teknikker (figur 1).
HepG2 , A549, U2OS, MDA-MB231, HT-29, Hep3B og PC-3-celler ble inkubert i henhold til normoxia (21% O
2) eller hypoksi (1% O
2) i fravær (CTL) eller tilstedeværelsen av etoposid (ETO), paclitaxel (SKATT), cisplatin (CIS) eller camptothecin (CPT) for 16 (A, C, E, G, J) eller 40 timer (B, D, F, H, i, K) . Konsentrasjonen anvendt for hvert molekyl er angitt i diagrammene (i uM). (A, C, E, G, J) Caspase-3/7-aktivitet ble analysert ved å måle fluorescensen av fri AFC frigjort fra spaltningen av caspase-3/7-spesifikk substrat Ac-DEVD-AFC. Resultatene er uttrykt i relative fluorescerende enheter (RFU) som middel ± 1 SD (n = 3). (B, D, F, H, I, K) LDH meldingen ble vurdert. Resultatene er angitt i prosenter som middelverdier ± SD-1 (n = 3). (A-K) Statistisk analyse ble utført med ANOVA 1. ns: ikke-signifikant; *: P 0,05; **: P 0,01; ***: P 0,001. Symboler over en normoksisk kolonne er en sammenligning med normoksisk kontroll og symboler over en hypoksisk kolonne er en sammenligning med den tilsvarende normoksiske tilstand (med det samme medikament).
Vi observerte at, generelt, p53 mutert eller null-celler er vanskeligere å drepe enn de p53 villtype-celler. I de fleste tilfeller er virkningen av hypoksi på celledød var den samme for alle molekyler i en celletype. Men denne virkning varierer avhengig av celletype. Vi observerte også at hypoksi hadde oftere en beskyttende effekt mot celledød enn en skjerpende effekt. For eksempel, hypoksi beskyttet HepG2 og MDA-MB231 celler mot celledød indusert av alle molekylene som ble testet mens vi observerte noen effekt eller en forverring av narkotika-indusert celledød ved hypoksi i A549 og Hep3B celler. Hypoksi kan derfor beskytte p53 villtype så vel som p53-mutert celler. Til sammen viser disse resultater genererte en matrise av data om virkningen av hypoksi på apoptose indusert ved 5-molekyler i 7 celletyper (tabell 1). Resultatene viste at effekten av hypoksi er forskjellig i henhold til den celletype, men konstant for alle medikamenter på en celletype. Så langt vi kjenner til, har denne observasjonen aldri vært gjort før.
Expression Profilen til mRNA og proteiner involvert i apoptose i ulike celletyper
For å forstå hvorfor hypoksi beskyttet noen cellelinjer mot medikament-indusert død, men ikke andre, valgte vi fire cellelinjer som bærer forskjellig p53 status og for hvilken virkningen av hypoksi er forskjellig: HepG2, A549, MDA-MB231 og Hep3B celler. Vi brukte etoposid som celledød indus siden det er kraftig i alle fire cellelinjer og dets virkningsmåte er vel kjent. Effekten av hypoksi på paclitaxel-indusert død HepG2 celler ble også undersøkt.
Etoposide og Paclitaxel er aktiv og HIF-1 er aktivert under hypoxi i alle celletyper
Hypoksi er ofte beskrevet til å inhibere den skadelige virkning av kjemoterapeutiske midler [15]. For å sjekke om hypoksi hemmer etoposid-indusert DNA skade og /eller paclitaxel-indusert microtubule stabilisering eller hvis det fungerer på et nivå nedstrøms for skader forårsaket av stoffet, ble ATM (ataxia telangiectasia mutert) fosforylering studert en time etter etoposid inkubasjon og morfologi av mikrotubul fibrene ble undersøkt etter 16 timer paklitaksel eksponering. Etoposid utløser celledød ved indusering av dobbeltkjedet DNA bryter som fører til ATM aktivering. Resultatene viste at den faktisk indusert fosforylering av ATM i de fire celletypene. Ingen effekt av hypoksi ble observert på induksjon av P-ATM, selv i HepG2 og MDA-MB231-celler hvori hypoksi redusert til etoposid-indusert apoptose (figur 2A). I HepG2-celler som er beskyttet med hypoksi mot paclitaxel-mediert celledød, har hypoksi ikke ser ut til å hindre dannelse av tykke mikrotubul fibre indusert av paclitaxel (Figur 2B og data ikke vist). Til sammen viser disse resultater viste at hypoksi beskytter cellene nedstrøms av medikamentet-indusert skade.
(A) Virkning av hypoksi, etoposid og paclitaxel i overflod og fosforylering av ATM. HepG2, A549, MDA-MB231 og Hep3B cellene ble inkubert 1 time under normoxia (N, 21% O
2) eller hypoksi (H, 1% O
2) i nærvær eller ikke (CTL) av etoposid (ETO, 100 mikrometer i Hep3B celler og 50 mikrometer i andre celletyper) eller paclitaxel (TAX, 10 mm) i HepG2 celler. ATM og P-ATM ble påvist i atomproteinekstrakter av western blotting ved hjelp av spesifikke antistoffer. Ett eksperiment representant av tre. Ukuperte Western blot er vist i figur S1. (B) Effekt av hypoksi, etoposid og paclitaxel på mikrotubuli. HepG2-celler ble inkubert i 16 timer under normoxia (21% O
2) eller hypoksi (1% O
2) i nærvær eller ikke av etoposid (50 uM) eller paclitaxel (10 uM). Etter inkubering ble cellene fiksert, permeabilised og farget for alfa-tubulin ved hjelp av et spesifikt antistoff. Observasjon ble utført ved anvendelse av et konfokalt mikroskop med en konstant fotomultiplikator.
Mange beskyttende effekter av hypoksi blir formidlet av HIF-1 (hypoksi-induserbar faktor-1) transkripsjonsfaktor, som er en heterodimer bestående av en konstitutivt uttrykte subenhet, HIF-1beta, og en subenhet stabilisert bare under hypoksiske betingelser, HIF-1alfa [5]. Vi undersøkte derfor om denne faktor ble effektivt aktiveres ved hypoksi i cellelinjene som hypoksi ikke har en beskyttende effekt (figur 3). Hypoksi indusert opphopning av HIF-1alpha men etoposid redusert denne opphopningen i A549, MDA-MB-231 og Hep3B celler. I HepG2 celler, etoposid hadde ingen eller en svak inhiberende effekt i henhold til forsøket. Effekten av etoposid på HIF-1alfa-protein-nivå er allerede blitt observert [16]. Som evaluert av luciferase reporter, HIF-1 var aktiv i hver celletype under hypoksi og dette korrelerer med mRNA overflod av to av sine mål gener (LDHA og BNIP3).
HepG2, A549, MDA-MB231 og Hep3B cellene ble inkubert 16 timer under normoxia (N, 21% O
2) eller hypoksi (H, 1% O
2) (AD) i nærvær eller ikke (CTL) av etoposid (ETO, 100 pM i Hep3B celler og 50 mikrometer i de andre celletyper) eller paclitaxel (TAX, 10 mm) i HepG2 celler (A, C, D). (A) HIF-1alfa ble påvist i de totale celleekstrakter ved hjelp av Western blotting ved bruk av et spesifikt antistoff. Alpha-tubulin ble brukt som lasting kontroll. Ett eksperiment representant av tre. Ukuperte Western blot er vist i figur S1. (B) før inkubering, celler ble ko-transfektert med pGL3- (PGK-HRE6) -tk-luc reporter plasmid som koder for ildflueluciferase og pCMVß normalisering plasmidet. Resultatene er uttrykt som gjennomsnittet av forholdet mellom ildflue luciferase-aktivitet og ß-galaktosidase-aktivitet ± 1 SD (n = 3). Statistisk analyse ble utført med ANOVA 1. ***: P 0,001. Symboler er en sammenligning mellom de normoksisk og hypoksiske betingelser i samme celletype. (C, D) Etter inkubering total-RNA ble ekstrahert, forelagt revers transkripsjon og deretter til amplifikasjon i nærvær av SYBR Green and spesifikke primere for BNIP3 (c) eller LDHA (D). RPL13A ble brukt som husholdningsgenet for data normalisering. Dataene er gitt i fold-induksjon som gjennomsnitt ± 1 SD (n = 3). Statistisk analyse ble utført med ANOVA 1. ns: ikke-signifikant; *: P 0,05; **: P 0,01; ***: P 0,001. Symboler over de hypoksiske kolonner er en sammenligning med tilsvarende normoksiske tilstand (med det samme stoffet).
I konklusjonen, at hypoksi beskytter HepG2 og MDA-MB231 cellene mot døden, men ikke A549 og Hep3B celler kan ikke forklares med forskjell i etoposide- eller paclitaxel-indusert skade eller HIF-1 aktivering.
Expression Profilen til mRNA involvert i apoptose
Resultatene fra Figur 2 viser at differensial effekten av hypoksi på celledød finner sted nedstrøms for induksjon av celleskade. Vi hypotese derfor at hypoksi påvirker signaloverføringsveier som utløser apoptose. Disse banene er spesielt avhengig av p53, men også på andre transkripsjonsfaktorer. Genuttrykkstudier ble derfor utført for å finne gener hvis ekspresjon differensielt regulert av hypoksi i beskyttede celler i forhold til ikke-beskyttede celler. TaqMan lav tetthet Arrays (Applied Biosystems) som gjør det mulig å studere den overflod av 93 mRNA som er kjent for å være involvert i apoptose prosessen (så vel som 3 rengjørings mRNA) ble anvendt. Resultatene er presentert som en varmekart i figur 4, mens de numeriske verdiene som er gitt i Tabell S2. Som forventet, observerte vi induksjon av HIF-1 målgener (BNIP3, BNIP3L og GAPDH) etter 16 timer hypoksi i de fire celletypene. Induksjon av p53 målgener (APAF-1, BAK1 og BAX) ble observert i HepG2 og A549-celler etter 16 timer inkubasjon etoposid, men ikke på p53-mutert (MDA-MB231-celler) eller null (Hep3B celler) celler. P53 målgenet PMAIP1 (NOXA) ble indusert ved etoposid i alle celletyper.
Resultatene ble oppnådd ved anvendelse av «TLDA Humant Apoptose Panel» (Applied Biosystems) (TLDA). HepG2, A549, MDA-MB231 og Hep3B cellene ble inkubert i 16 timer under normoxia (N, 21% O
2) eller hypoksi (H, 1% O
2) i nærvær eller ikke av etoposid (E, 100 uM i Hep3B celler og 50 uM i de andre celletyper) eller paclitaxel (T, 10 pM) i HepG2-celler. Etter inkubering, ble total RNA ekstrahert, sendes til revers transkripsjon og deretter til TLDA analyse. 18S ble brukt som husholdningsgenet for data normalisering. Faktiske numeriske verdier er gitt i Tabell S2. Gener som er vist i uthevet skrift er gener hvis ekspresjon ble validert ved QRT-pst.
Vi deretter søkt for gener hvis ekspresjon profilen er parallell med celledød profilen på hver av de fire celletyper, dvs. gener hvis uttrykket ble nedregulert av hypoksi i HepG2 og MDA-MB231 celler og upåvirket eller økt i A549 og Hep3B celler, eller vice-versa. Imidlertid kan ikke en slik ekspresjonsprofilen holdes. Interessant, uttrykket av BCL2L11 (også kalt BIM), BIK, CASP10, CASP3, DEDD2, NALP1 og Tradd ble redusert med hypoksi i etoposid-inkuberes HepG2 celler mens deres uttrykk ble økt eller uendret i A549 celler, korrelere med apoptotiske profilen disse to celletyper. Videre BIRC3 og MCL1 ekspresjonsprofilen var inverse av den apoptotiske profil for HepG2 og A549-celler. Uttrykket profilen til disse genene ble validert av enkelt real-time RT-PCR reaksjoner. Resultatene er presentert som en varmekart i figur 5, mens de numeriske verdiene som er gitt i Tabell S3. Profilen til BAK1, BAX, BBC3 (også kalt PUMA) og PMAIP1 (også kalt NOXA) ble også validert siden de er kjente formidlere av etoposid-indusert celledød. De fleste av de resultater som er oppnådd ved hjelp av TaqMan lav densitet Arrays ble bekreftet. Det må imidlertid bemerkes at ekspresjonen av nesten alle undersøkte gener ble redusert med hypoksi i alle etoposid-eksponerte celler.
HepG2, A549, MDA-MB231 og Hep3B cellene ble inkubert i 16 timer under normoxia (N, 21% O
2) eller hypoksi (H, 1% O
2) i nærvær eller ikke av etoposid (E, 100 uM i Hep3B celler og 50 uM i den andre celletyper) eller paclitaxel (T, 10 uM) i HepG2-celler. Etter inkubasjon ble total RNA ekstrahert, sendes til revers transkripsjon og deretter til real-time PCR i nærvær av SYBR Grønn og spesifikke primere. Faktiske numeriske verdier er gitt i Tabell S3. Gener som er vist i fet skrift er gener hvis uttrykk ble vurdert på proteinnivået ved western blot analyser.
Expression Profilen til proteiner involvert i apoptose
I tillegg til å være regulert av endringer i genet uttrykk, er de fleste av de som er involvert i apoptose proteiner kjent for å reguleres også ved den post-translasjonelle nivå [2]. Etoposid og paclitaxel indusere apoptose ved å aktivere hovedsakelig den intrinsiske reaksjonsvei [17], [18], [19], som er regulert av overflod og den subcellulære lokalisering av proteiner av BCL-2-familien. Vi studerte derfor proteinet overflod av BCL-2-familieproteiner i de fire celletypene, så vel som den subcellulære lokalisering av noen av dem i HepG2 og A549-celler (figur 6).
HepG2, A549, MDA-MB231 og Hep3B cellene ble inkubert i 16 timer under normoxia (N, 21% O
2) eller hypoksi (H, 1% O
2) i nærvær eller ikke (CTL) av etoposid (ETO, 100 uM i Hep3B celler og 50 mikrometer i de andre celletyper) eller paclitaxel (TAX, 10 mm) i HepG2 celler. (A) Proteiner ble påvist i de totale celleekstrakter ved western blotting, ved hjelp av spesifikke antistoffer. alpha-tubulin ble brukt som lasting kontroll. Ett eksperiment representant av tre. Ukuperte Western blot er vist i figur S1. (B) Etter inkuberingen ble subcellulære fraksjonering utføres, og proteiner ble påvist i MLP (mitokondriene-lysosom-peroksisom) og S (cytosol) fraksjoner ved western blotting, ved hjelp av spesifikke antistoffer. TOM20 og β-actin ble brukt som laste kontroller for MLP og S-fraksjoner hhv. Ett eksperiment representant av tre. Ukuperte vestlige blotter er presentert i figur S1.
Vi først studert pro-apoptotiske BAX og BAK proteiner. BAX totale proteinnivået var litt økt med etoposid i HepG2, A549 og Hep3B celler, men forble upåvirket i MDA-MB231 celler. Hypoksi litt redusert BAX overflod i HepG2 celler, men hadde ingen effekt i andre celletyper. Dette protein var til stede i den MLP (mitokondriene-lysosom-peroksisom) fraksjon, så vel som i cytosol av HepG2 og A549-celler. Etoposid øket BAX overflod i cytosol fra HepG2-celler, og i den MLP fraksjon av A549-celler; denne økningen ble forhindret av hypoksi.
