Abstract
Bakgrunn
LIM og SH3 protein 1 (LASP-1) er en bestemt brennvidde heft protein involvert i flere ondartede svulster. Imidlertid er dens rolle i muntlig plateepitelkarsinom (OSCC) ukjent. Hensikten med denne studien var å karakterisere rolle og molekylær status /mekanisme LASP-en i OSCC.
Metoder
Vi evaluerte
LASP-en
mRNA og proteinuttrykk i OSCC-avledede cellelinjer og primære OSCCs. Ved hjelp av et shRNA system, analyserte vi effekten av LASP-1 på biologien og funksjonen av de OSCC cellelinjer, HSC-3 og Ca9-22. Cellene også ble subkutant injisert for å vurdere tumorvekst
in vivo
. Data ble analysert ved Fishers eksakte test eller Mann-Whitney U test. Bonferronikorreksjon ble brukt for multippel testing.
Resultater
Betydelig oppregulering av LASP-en ble oppdaget i OSCC-avledede cellelinjer (n = 7,
P
0,007) og primær OSCCs (n = 50,
P
0,001) sammenlignet med normale kontroller. LASP-1 knockdown celler betydelig hemmet celleproliferasjon sammenlignet med shMock-transfekterte celler (
P
0,025) ved å arrestere cellesyklusprogresjon på G2 fase. Vi observerte dramatisk reduksjon i veksten av shLASP-1 OSCC xenografter sammenlignet med shMock xenografter
in vivo
.
Konklusjon
Våre resultater antydet at overekspresjon av LASP-en er koblet nøye til oral tumourigenicity og videre gi romanen bevis på at LASP-en spiller en avgjørende rolle i tumorcellevekst ved å formidle G2 /M overgang
Citation. Shimizu F, Shiiba M, Ogawara K, Kimura R, Minakawa Y , Baba T, et al. (2013) Overuttrykte LIM og SH3 Protein en Fører til Accelerated G2 /M Fase Overgang bidrar til økt tumorgenesen i Oral Cancer. PLoS ONE 8 (12): e83187. doi: 10,1371 /journal.pone.0083187
Redaktør: Jörg D. Hoheisel, Deutsches Krebsforschungszentrum, Tyskland
mottatt: 21. august 2013, Akseptert: 11. november 2013, Publisert: 26.12.2013
Copyright: © 2013 Shimizu et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Disse forfatterne har ingen støtte eller finansiering for å rapportere
konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesse eksisterer
Innledning
Betydelig bevis har antydet at plutselige økninger i celleformering oppstå på grunn av forstyrrelse av cellesykluskontrollmekanisme. Tidligere studier har rapportert en sammenheng mellom cellesyklus regulering og utvikling av muntlige plateepitelkarsinom (OSCCs) [1], [2], [3]. Til tross for å akkumulere data, har den nøyaktige mekanisme av den kliniske nytten av cellesyklusregulering i OSCCs ikke er klarlagt.
Cancer celleproliferasjon skjer som et resultat av ødeleggelse av cellesykluskontrollmekanismer og kontinuerlig signalisering etter mitose. Nyere studier har rapportert at feilregulering i G2 /M overgang fremmer cellulær proliferasjon i mange tumortyper, [4], [5], [6]. Blant de gener som korrelerte med G2 /M fase, nucleic LIM og SH3 protein (LASP-1) på G2 /M fase anses vesentlig for onkogene aktivitet hos pasienter med brystkreft [7]. LASP-1 ble identifisert opprinnelig fra et cDNA-bibliotek av metastatisk brystkreft metastaser [8]. Det er lokalisert innenfor flere områder av dynamisk F-aktin forsamlingen som fokale kontakter [9] og er involvert i cytoskeletal arkitektur [10]. I humane kreft avledet celler, mens tie av LASP-1 resulterte i en sterk hemming av cellevekst [11], overekspresjon av LASP-en betydelig forfremmet tumorvekst
in vivo product: [12]. Videre overekspresjon av LASP-1 er blitt observert i en rekke av maligne tumorer, slik som metastatisk brystkreft [11], eggstokk-kreft [13], blærekreft, [14], medulloblastom [15], og hepatocellulært karsinom [16].
Nylige studier har vist LASP-1 sammen med en annen fokal adhesjon protein spiller en viktig rolle i G2 /M overgang ved inhibering av cdc2 [17], [18], som tyder på en mulig relasjon til cellesyklus i kreft. Basert på disse observasjonene vi en hypotese om at LASP-en er nært knyttet til oral tumorigenesis med akselerert G2 /M overgang.
I denne studien har vi funnet avvikende uttrykk for LASP-en og evaluert sammenhengen mellom sitt uttrykk og clinicopathological egenskaper i OSCCs. Vi utførte også funksjonell analyse for å definere de biologiske virkningene av LASP-en.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
Studien protokollen ble godkjent av etisk komité Graduate School of Medicine, Chiba University (The godkjenningsnummer, 236) og ble utført i samsvar med de etiske normer nedfelt i Helsinkideklarasjonen. Skriftlig informert samtykke ble mottatt fra alle pasienter.
Alle forsøksdyr ble behandlet og ivaretatt i samsvar med retningslinjene i Chiba University. Forsøksdyrene ble avlivet ved cervikal dislokasjon. Vi har gjort vårt ytterste for å lindre smerten av forsøksdyr. Protokollen ble godkjent av komité for etikk av dyreforsøk i Chiba University (The godkjenningsnummer, 25-221).
Cell Kultur og vevsprøver
Den menneskelige OSCC cellelinjer (HSC -3, ble KON, og HO-1-N-1) som er kjøpt fra human Science Research Resources Bank, Osaka, Japan. Riken BRC (Tsukuba, Japan) gitt Sa3, HO-1-u-en, HSC-4, og Ca9-22 gjennom nasjonal Bio-Ressurs-prosjektet i departementet for utdanning, kultur, sport, vitenskap og teknologi i Japan. Cellular identitet ble bekreftet av kort tandem repeat profilering. Primære dyrkede humane normale orale keratinocytter (HNOKs) ble oppnådd fra tre friske donorer og tjente som normale kontroller [19], [20], [21]. Alle celler ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (Sigma, St. Louis, MO, USA) supplert med 10% føtalt bovint serum (Sigma) og 50 enheter /ml penicillin og streptomycin (Sigma) i en fuktet atmosfære av 5% karbondioksyd /luft ved 37 ° C.
Femti par av primær OSCC prøver og tilsvarende normale muntlige epitelvev ble oppnådd intraoperativt ved Chiba universitetssykehus. The Institutional Review Board of Chiba Universitetet godkjent denne studien. Informert samtykke ble oppnådd fra alle pasientene. De resected vev ble delt for RNA isolering og immunhistokjemi (IHC); Den tidligere var frosset umiddelbart og lagret ved -80 ° C, ble den sistnevnte fiksert i 20% bufret formaldehyd-oppløsning. Hvert vev ble diagnostisert histopathologically ifølge Verdens helseorganisasjon kriterier ved Avdeling for patologi, Chiba universitetssykehus. Clinicopathological iscenesettelse ble bestemt i henhold til svulsten-node-metastaser klassifisering av International Union mot kreft. Alle OSCC prøvene ble bekreftet histologisk at svulsten var til stede i over 90% av prøvene.
mRNA Expression Analysis
Total RNA ble ekstrahert ved hjelp Trizol Reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) i henhold til produsentens instruksjoner. cDNA ble generert fra 5 mikrogram total RNA ved hjelp av Ready-To-Go You-Prime First-Strand Perler (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK) og oligo (dT) primer (Hokkaido System Science, Sapporo, Japan). Real-time kvantitativ revers transkriptase polymerase chain reaction (QRT-PCR) ble utført ved hjelp av LightCycler® 480 PCR system (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Tyskland) for å behandle uttrykket nivået av
LASP-en
mRNA i OSCC -avledede cellelinjer og HNOKs. Primersekvensene brukes for QRT-PCR var:
LASP-en
, fremover, 5′-CAGCCCCAGTCTCCATACAG-3 «; omvendt, 5»-ATACTGATGTCGCGGCGG-3 «; og universell probe # 77. Primere og prober ble utformet ved hjelp av ProbeFinder qPCR analyse Design Software, tilgjengelig på www.universalprobelibrary.com. QRT-PCR-amplifikasjoner ble utført som følger: innledende denaturering ved 95 ° C i 10 minutter, 45 sykluser med amplifisering ved 95 ° C i 10 sekunder, denaturering ved 55 ° C i 30 sekunder for utglødning /forlengelse, og kjøling ved 40 ° C i 30 sekunder. Utskriften beløp for
LASP-en
ble beregnet ut fra de respektive standardkurver og normalisert til
glyseraldehyd-3-fosfat dehydrogenase product: (
GAPDH
) (forover 5 « -CATCTCTGCCCCCTCTGCTGA-3’cell, reverse 5»-GGATGACCTTGCCCACAGCCT-3 «, og universell probe # 60) avskrift beløp fastsatt i tilsvarende prøver.
Immunoblotting Analyse
cellene ble lysert i buffer ( 7 M urea, 2 M tiourea, 4% w /v CHAPS og 10 mM tris [pH 7,4]) med proteinase inhibitor cocktail (Roche) og inkubert ved 4 ° C i 30 minutter. Proteinkonsentrasjonen ble evaluert ved anvendelse av en Bio-Rad Protein Assay (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA). Proteinekstrakter ble separert ved natriumdodecylsulfat-polyakrylamid-gel-elektroforese i 10% gel og overført til nitrocellulosemembraner før inkubering over natten med primære antistoffer mot LASP-1 (Applied biologiske materialer, Richmond, BC, Canada), cyklin A, cyclin B, eller fosfo -cdc2 (Tyr15) (Cell Signaling Technology, Danvers, MA) ved 4 ° C. Membranen ble vasket med 0,1% Tween-20 i Tris-bufret saltvann, inkubert med sekundære antistoffer, pepperrot-peroksidase-konjugert anti-kanin eller anti-mus IgG (Promega, Madison, WI, USA) i 1 time ved romtemperatur. SuperSignal Chemiluminescent substrat (Thermo, Waltham, MA, USA) ble anvendt for proteindeteksjon. De immunoreaktive bånd ble visualisert på et avkjølt CCD-kamera system (Atto, Tokyo, Japan), og CS Analyzer versjon 3.0 (Atto) ble anvendt for signalintensiteten kvantifisering.
IHC
IHC ble utført på parafininnstøpte prøvene skåret i 4-mikrometer seksjoner ved hjelp av kanin anti-LASP-en polyklonale antistoff (Applied biologisk materiale). Den endogen peroksidase-aktivitet er blokkert av en 30-minutters inkubasjon i 0,3% hydrogenperoksidløsning i 100% metanol. Seksjonene ble inkubert i 1,5% blokkerende serum (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Dallas, TX, USA) i fosfat-bufret saltvann (PBS) i 2 timer ved romtemperatur før omsetning over natten med anti-LASP-1-antistoff (1: 1000 fortynning) ved 4 ° C i et fuktig kammer. Før inkubering med det primære antistoff, ble platene vasket tre ganger i PBS og ble behandlet med Histofine Simplestain Max-PO (G) (Nichirei, Tokyo, Japan). 3,3′-diaminobenzidintetrahydroklorid (DAKO, Carpinteria, CA, USA) ble brukt som et kromogen, og vevssnitt ble kontra lett med hematoxylin, dehydrert med etanol, renset med xylen, og montert med Marinol (Muto Pure Chemicals, Tokyo , Japan). For å unngå ikke-spesifikk binding av et antistoff til andre enn antigen-proteiner, ble en immuniserende peptid-blokkerende eksperiment utført. Tredoble delene ble immunostained uten å reagere primære antistoff som negativ kontroll for å bekrefte flekker spesifisitet.
For å bestemme LASP-1 uttrykk nivåer, ble platene undersøkt ved hjelp av en IHC scoring systemer som er beskrevet tidligere [22], [23]. De fargeintensitet ble scoret som en, svak; 2, moderat; og 3 = sterk. IHC-stillingen ble beregnet ved å multiplisere prosentandelen av positive tumorceller, og den fargeintensitet. Saker med en poengsum som overstiger 113,0 (3 standardavvik [SD] score for normalt vev) ble definert som LASP-1-positive. De ± 3 SD cutoff, som statistisk er bare 0,2% av målingen og er forventet å falle utenfor dette området, ble brukt fordi det var ikke til å bli påvirket av en tilfeldig eksperimentelle feil som produseres av prøven manipulering [24]. To uavhengige patologer som ikke hadde noen kjennskap til pasientens kliniske status gjort disse dommene.
Transfeksjon med shRNA Plasmid
OSCC cellelinjer, HSC-3 og Ca9-22, med høyere LASP- 1 proteinekspresjon ble stabilt transfektert med den LASP-1 shRNA (shLASP-1) eller styre shRNA (shMock) (Santa Cruz Biotechnology, Inc.) under anvendelse av Lipofectamine Plus LTX og Reagenser (Invitrogen). Transfekterte celler ble valgt i medium som inneholder 1 mg /ml puromycin (Invitrogen).
celleproliferasjon Analyser
For å bestemme effekten LASP-en knockdown på celleproliferasjon, shLASP-1- og shMock- transfekterte celler ble sådd ut i seks-brønns plater ved 1 x 10
4 celler /brønn, trypsinert, og tellet i triplikat hver dag i 7 dager ved bruk av et hemocytometer.
Cell-syklus Analyse
Syv dager etter etableringen av LASP-1 knockdown celler, ble cellesyklus distribusjon kontrollert. Å synkronisere celler i G2 /M overgang, ble cellene behandlet med 200 ng /ml nocodazol (Sigma) i 20 timer [25]. Cellene ble pelletert, renset med PBS, og probet med CycleTEST Plus DNA-reagenssettet (Becton-Dickinson, San Jose, CA, USA) i henhold til produsentens protokoll. Etter sentrifugering ved 400 x g i 5 minutter, ble 250 ul av oppløsning A (trypsin-buffer) tilsatt, og blandingen ble inkubert i 10 minutter ved romtemperatur. To hundre mikroliter av oppløsning B (trypsininhibitor og RNase i en buffer) ble deretter tilsatt, og blandingen ble inkubert i 10 minutter ved romtemperatur. Til slutt ble 200 pl oppløsning C (propidiumiodid fargende oppløsning) tilsatt, og blandingen ble inkubert i mørket i 10 minutter på is. Strømningscytometrisk bestemmelse av DNA-innholdet ble analysert ved anvendelse av Accuri C6 Flowcytometer (Becton-Dickinson). Cell-syklus distribusjoner ble kvantifisert ved hjelp av FCS Express 4 (De Novo Software, Los Angeles, CA, USA). Forsøkene ble utført i tre paralleller.
In vivo
tumorvekst analysen
For å evaluere kreft vekst
in vivo
, 2 × 10
7 shLASP-1- og shMock-transfekterte celler ble uavhengig injisert subkutant i ryggen av kvinnelige nakne mus, BALB /c-nu, kjøpt fra Oriental Yeast Co. (Tokyo, Japan). Alle forsøksdyr ble behandlet og ivaretatt i henhold til institusjonelle retningslinjer. Tumorene ble målt ved bruk av målepunkter hver 3 til 4 dager etter at de nådde et volum på 100 mm
3. Tumorvolumet ble beregnet ved bruk av formelen 4π /3 x (bredde /2)
2 x (lengde /2). Musene ble avlivet etter 28 dager. Tumorvev ble fiksert i 10% formalin, og parafinsnitt (4 mikrometer) ble utarbeidet for immunhistokjemi av LASP-en og hematoxylin og eosin (H E). Farging
Statistical Analysis
Statistisk signifikans ble bestemt ved bruk av Fishers eksakte test eller Mann-Whitney U test.
P
0,05 ble betraktet som signifikant. Bonferroni korreksjon ble benyttet for multippel testing. Dataene er uttrykt som gjennomsnitt ± standard feil av gjennomsnittet (SEM).
Resultater
Evaluering av LASP-1 Expression in OSCC cellelinjer utvunnet
For å analysere uttrykket status for
LASP-1
, utførte vi QRT-PCR og immunblotting-analyser ved bruk av syv OSCC-avledede cellelinjer (HSC-3, HSC-4, KON, HO-1-u-1, HO- 1-N-1, Ca9-22, og Sa3) og HNOKs.
LASP-en
mRNA var signifikant (
P
0,007) oppregulert i alle OSCC cellelinjer sammenlignet med i HNOKs (figur 1A). Figur 1B viser representative resultatene av immunoblotting analyser. En betydelig økning i LASP-1-protein-ekspresjon ble observert i alle OSCC-avledede cellelinjer sammenlignet med HNOKs. Ekspresjon analyse indikerte at både transkripsjons- og translasjonselementer produkter av LASP-1, ble sterkt uttrykt i OSCC-avledede cellelinjer.
(A) Kvantifisering av
LASP-1
mRNA-ekspresjon i OSCC-avledede celle linjer ved QRT-PCR analyse. mRNA uttrykk nivåer er normalisert til GAPDH. Betydelig oppregulering av
LASP-1
mRNA er sett i syv OSCC-avledede cellelinjer sammenlignet med det i HNOKs. Data er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM av tre eksemplarer resultater (*
P
0,007, Mann-Whitney U test med Bonferroni korreksjon). (B) Immunoblotting analyse av LASP-1 protein i OSCC-avledede cellelinjer og HNOKs. LASP-1-proteinet uttrykket er oppregulert i de OSCC-avledede cellelinjer sammenlignet med den i HNOKs. Densitometriske LASP-1 protein data er normalisert til GAPDH protein nivåer. Verdiene er uttrykt som en prosentandel av HNOKs.
Evaluering av LASP-1 Expression i Primær OSCCs
For å finne ut uttrykket status for LASP-en i grunnskolen OSCCs og dens relasjoner til clinicopathological egenskaper, undersøkte vi LASP-1 protein uttrykk i primær OSCCs og paret normale muntlige vev fra 50 pasienter ved hjelp av IHC scoring system. Sterk LASP-en immunoreaktivitet ble funnet i cytoplasma i OSCCs, mens normalt vev viste negativ farging (figur 2B, C). De LASP-1 IHC score varierte 43-265 i OSCCs (median, 178) og 2,5 med 97 i normale orale vev (median, 35). IHC score i primær OSCCs var signifikant (
P
0,05) høyere enn i de vanlige orale vev (figur 2A)
(A) Statusen LASP-1 protein uttrykk i. primære OSCCs (n = 50) og normale motstykker basert på et IHC scoringssystem. IHC score er beregnet som følger: IHC poengsum = 1 x (antall svakt fargede celler i feltet) + 2 x (antall moderat fargede celler i feltet) + 3 x (antall intenst fargede celler i felten). De LASP-en IHC score for normale orale vev og OSCCs spenner 2,5 til 97 (median, 35) og 43-265 (median, 178), henholdsvis. LASP-1 protein uttrykk nivåer i OSCCs er betydelig høyere enn i vanlige orale vev (*
P
0,001; Mann-Whitney U-test). (B, C) Representant IHC resultatene av LASP-en i normale muntlige vev og primær OSCCs. Original forstørrelse, × 100. Skala barer, fem mikrometer. LASP-en er sterkt overuttrykt i OSCCs sammenlignet med vanlige orale vev.
Tabell 1 viser korrelasjoner mellom clinicopathological kjennetegn ved pasientene med OSCC og status for LASP-1 protein uttrykk ved hjelp av IHC scoring system. Blant de kliniske klassifikasjoner ble LASP-1 positive OSCCs korrelerte signifikant (
P =
0,02) med tumorstørrelse. Videre er en signifikant (
P =
0,04) forskjell ble funnet i den LASP-1 ekspresjonsnivåene mellom T1 /T2 gruppe og T3 /T4-gruppen, noe som indikerer LASP-1-ekspresjonen nivåene er høyere i fremskredne stadier sammenlignet med tidlige stadier. Ingen signifikante sammenhenger ble funnet i alder, kjønn, N-regional lymfeknute, histopatologiske type, og svulst nettstedet.
Etablering av LASP-en Knockdown Cells
For å studere mulige funksjon av LASP-1 i OSCCs de OSCC-avledede cellelinjer, HSC-3 og Ca9-22, ble transfektert med LASP-1 shRNA og kontroll shRNA (shMock). Uttrykket nivåer av
LASP-en
mRNA og protein i shLASP-en-transfekterte celler viste signifikant (
P
0,025) nedgang i forhold til shMock-transfekterte celler (figur 3A, B .)
(A) uttrykk for
LASP-en
mRNA i shMock- og shLASP-en-transfekterte celler (HSC-3- og Ca9-22-avledet transfektanter, 2 kloner hver) .
LASP-en
mRNA uttrykk i shLASP-en er signifikant (*
P
0,025, Mann-Whitney U test med Bonferroni korreksjon) lavere enn i shMock-transfekterte celler . (B) Immunoblotting analyse av LASP-1 protein i shMock- og shLASP-1-transfekterte celler (HSC-3- og Ca9-22-avledede transfektanter, 2 kloner hver). Den LASP-1 protein i shLASP-en transfekterte celler er oppbrukt markant sammenlignet med shMock-transfekterte celler.
Redusert Cellular Veksten i LASP-en Knockdown Cells
For å studere virkningen av LASP-1 på cellulær proliferativ evne, overvåket vi celleveksten i shLASP-1-transfekterte celler i syv påfølgende dager. Både HSC-3 og Ca9-22 shLASP-1-transfekterte celler hadde en signifikant (
P
0,025). Nedgang i cellevekst sammenlignet med shMock-transfekterte celler (figur 4)
for å bestemme virkningen av shLASP-1 på cellulær proliferasjon, shLASP-1- og shMock-transfekterte celler ble sådd ut i seks-brønns plater ved en tetthet på 1 x 10
4 levedyktige celler /brønn. Den shLASP-1 transfekterte HSC-3 og Ca9-22 celler har en signifikant (*
P
0,025; Mann-Whitney U-test med Bonferroni korreksjon) reduksjon i cellevekst sammenlignet med shMock-transfekterte celler.
knockdown av LASP-1 induserer G2 fase Ansamling
for å undersøke mekanismen som nedregulert LASP-en er knyttet til cellesyklusprogresjon, vi deretter undersøkt celle- syklus distribusjoner av shLASP-1-transfekterte celler ved anvendelse av fluorescens-aktivert cellesortering (FACS). Andelen av celler i G2-fasen i shLASP-1-transfekterte celler var signifikant (
P
0,025) høyere enn i shMock-transfekterte celler (figur 5A). Lignende resultater ble oppnådd i tre uavhengige eksperimenter (fig S1, S2), noe som tyder på at nedregulering av LASP-1 inhiberte cellulær proliferasjon, noe som induserte G2 rest.
(A) Strømningscytometrisk bestemmelse av DNA-innholdet ble analysert bruker Accuri C6 Flowcytometer. shLASP-en-transfekterte HSC-3 og Ca9-22 cellene vise signifikant (*
P
0,025, Mann-Whitney U test med Bonferroni korreksjon) G2 fase opphopning i motsetning til de shMock-transfekterte celler. (B) Immunoblotting Analysen viser nedregulering av cyclin A og cyclin B og oppregulering av fosfor-cdc2 i knockdown cellene.
For å identifisere den mekanismen som nedregulert LASP-1 blokker G2 /M overgang, vurderte vi protein ekspresjonsnivået av cyklin A, cyclin B, eller fosfo-cdc2 (Tyr15). Protein uttrykk for cyclin A og cyclin B ble nedregulert mens fosfor-cdc2 (Tyr 15) var oppregulert (figur 5B), som indikerer arrestasjonen av G2 /M fase i shLASP-en transfekterte celler.
LASP-en Fremmes tumorvekst
in vivo
for å definere effekten av LASP-en på kreft vekst
in vivo
, shLASP-1- og shMock- transfekterte celler av HSC-3 og Ca9-22 cellelinjer ble injisert subkutant i ryggen av hunn nakne mus, henholdsvis (3 mus i hver gruppe). I samsvar med våre
in vitro
funn, gjennomsnittlig tumorvolum av de shLASP-1 celler var signifikant (
P
0,05) mindre i forhold til de shMock-transfekterte celler. H E farging bekreftet tilstedeværelsen av tumorceller i alle grupper og LASP-1 immunohistokjemi av tumorsnitt viste LASP-1 knockdown har blitt opprettholdt
in vivo plakater (figur 6). Disse resultatene indikerte at LASP-1 fremmer tumorvekst i nakne mus.
shLASP-1- og shMock-transfekterte celler (HSC-3 og Ca9-22) ble injisert subkutant i ryggen av hunn nakne mus (n = 3). Tumorvekst av shLASP-1-injiserte mus er signifikant (*
P
0,05, Mann-Whitney U-test) hemmet sammenlignet med de shMock-injiserte mus. Immunhistokjemi viste tydelig nedsatt immunfarging for LASP-1 i shLASP-1-avledede tumorer enn shMock injiserte mus. H E farging bekreftet tilstedeværelsen av tumorceller. Original forstørrelse, × 200.
Diskusjoner
I denne studien har vi funnet en høy forekomst av økt LASP-1 uttrykk hos pasienter med OSCC og en signifikant sammenheng med primærtumor størrelse (tabell 1). Videre knockdown av LASP-1 i OSCC-avledede cellelinjer som resulterte i en dramatisk effekt på veksthemming
in vitro Hotell og
in vivo
via arrestasjonen av G2 /M fase. De aktuelle data tilveiebragt en ny innsikt i rollen som avvikende LASP-1 virker som en onkogen prosess i denne sykdommen.
En betydelig oppregulering av LASP-1 ble detektert i alle OSCC-avledede celler ble undersøkt på protein nivåer (figur 1B), som indikerer at LASP-1-ekspresjon er nødvendig for oral carcinogenesis. På den annen side, mRNA-ekspresjon tilstander var avhengig av celler (figur 1A). En mulig forklaring på dette avviket er at LASP-1-proteiner er ulikt påvirket av post-translasjonell ubiquitinering og proteolyse i hver tumorcellelinjer. I denne sammenheng avvik mellom
LASP-1
mRNA ekspresjonsnivåer og proteinnivå har blitt rapportert i blærecancercellelinjer [14].
FACS-analyse viste at LASP-1 er spesielt aktiv i G2 /M fase i OSCC celler (figur 5A). G2 /M sjekkpunkt er nødvendig for cellen for å reparere DNA-skader før mitotisk oppføring. Når DNA er skadet, cdc2, en viktig regulator av celleutvikling, inaktiveres ved økende fosforylering rester av Tyr 15, slik at cellene til å arrestere i G2-fasen [26]. Cyclin A og cyclin B er andre viktige regulatorer av cellesyklusprogresjon. Cyclin A forbinder med cdk2 og cdc2 og kreves ved initieringen av S-fasen og G2 /M overgang [27], [28]. I mellomtiden, cyclin B forbinder med cdc2 og regulerer mitotisk inn- og utstigning [29]. Ekspresjonsnivåene av cyklin A og syklin B er ofte oppregulert i en rekke forskjellige tumorer [30], [31]. Uttømming av cyklin A og cyclin B fører til cellesyklusarrest i G2 [32], [33]. Under G2 fase, er cyclin B /cdc2 kompleks inaktivert av fosforylering på Try15 og Thr14 av cdc2 av Wee 1 og Myt 1 kinaser [34], [35]. Ved begynnelsen av mitose, aktiverer cdc25C fosfatase cdc2 ved fjerning av fosfater ved THR 14 og prøve 15 [36], [37] og hindrer cyklin B1 /cdc2-komplekset fra å bli inaktivert igjen [38].
Ut disse observasjonene, ved fast vi uttrykket status av de relaterte gener som er nevnt tidligere. Som forventet, mens cyklin A og B var signifikant nedregulert, vi har oppdaget oppregulering av phoshpo-cdc2 i LASP-1 knockdown-celler. Dette var konsistent med tidligere studier som implisitte LASP-1 er ansvarlig for cellulær proliferasjon på grunn av cellesyklus-stans i G2-fasen hos pasienter med bryst- og eggstokk-kreft [11], [13].
Som konklusjon, våre data indikerte at LASP-1 kan være forbundet med tumorprogresjon ved å fremme cellesyklusprogresjon i G2-fasen. Det er bemerkelsesverdig at våre
in vivo
data viste dramatisk hemming av tumorvekst ved LASP-en stanse, noe som tyder på at dette molekylet kan være en nyttig biomarkør for spredning og en mulig terapeutisk mål for utvikling av anti-kreft narkotika i human OSCCs fordi de fleste av våre pasienter med en OSCC har overexpressed LASP-1 protein (tabell 1).
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
FACS analyse av shMock- og shLASP-en-transfekterte HSC-3 celler. Prosentandelen av G2 /M fase i shLASP-en-transfekterte HSC-3 celler var høyere enn i shMock-transfekterte celler
doi:. 10,1371 /journal.pone.0083187.s001 plakater (TIF)
Figur S2.
FACS analyse av shMock- og shLASP-en-transfektert Ca9-22 celler. Prosentandelen av G2 /M fase i shLASP-en-transfekterte Ca9-22 cellene var høyere enn i shMock-transfekterte celler
doi:. 10,1371 /journal.pone.0083187.s002 plakater (TIF)
takk
Vi takker Ms. Lynda C Charters for redigering av dette manuskriptet.
