Abstract
Mutasjoner i
MCPH1 plakater (Microcephalin) og
ASPM plakater (unormal spindel-lignende microcephaly forbundet) gener forårsaker primær microcephaly. Begge er centrosomal assosierte proteiner som er involvert i mitose. Microcephalin spiller en viktig rolle i DNA-skade respons og ASPM er nødvendig for riktig fordeling av proliferative nevro-epiteliale celler av utviklingen av hjernen. Redusert
MCPH1
mRNA uttrykk og
ASPM
mRNA over-uttrykk har vært innblandet i utviklingen av menneske karsinomer. Ovarialcancer (EOC) er preget av høyt aneuploide svulster. Tidligere har vi rapportert lav Microcephalin og høye ASPM proteinnivåer og foreninger med klinisk-patologisk parametre i ondartede celler fra ascitisfluider. For å bekrefte disse tidligere funnene i større skala Microcephalin og ASPM uttrykk nivåer og lokaliseringer ble evaluert av immunhistokjemi i to kohorter; en opplæring sett av 25 prøver, og en validering sett av 322 EOC vevsprøver. Resultatene ble korrelert til de tilhørende histopatologiske data. I normale eggstokkreft vev den Microcephalin atomfargemønsteret var gjennomgående sterk. I kreftvevet, identifiserte vi lav kjernekraft Microcephalin uttrykk i høy klasse og avansert stadium tumorer (
p
henholdsvis 0,0001 og p = 0,0438). ASPM hadde moderat til høy kjernekraft og lav til moderat cytoplasma uttrykk i normalt vev. Cytoplasmatiske ASPM uttrykk redusert med svulst klasse og trinn i serøs subtype av EOC (p = 0,023 og p = 0,011 henholdsvis). Cytoplasmatiske ASPM økt med tumor stadium i endometrioid subtype (p = 0,023). Økende tumor invasivitet (T3) og spredning til lymfeknuter (N1) også korrelert med en nedgang i cytoplasmisk ASPM i EOC (p = 0,02 og p = 0,04 henholdsvis). Vi har validert tidligere funn av deregulert uttrykk for Microcephalin og ASPM i EOC ved å bekrefte foreninger for lave atom Microcephalin nivåer og høye cytoplasmatiske ASPM nivåer i større skala svulstvev studien. Microcephalin og ASPM kan vise seg nyttige biomarkører i EOC
Citation. Alsiary R, Brüning-Richardson A, Bond J, Morrison EE, Wilkinson N, Bell SM (2014) Deregulering av Microcephalin og ASPM Expression er korrelert med epithelial ovarian Cancer Progresjon. PLoS ONE 9 (5): e97059. doi: 10,1371 /journal.pone.0097059
Redaktør: Xifeng Wu, MD Anderson Cancer Center, USA
mottatt: 15 februar 2013; Godkjent: 14 april 2014; Publisert: May 15, 2014
Copyright: © 2014 Alsiary et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet og Dr. Brüning-Richardson ble finansiert av Yorkshire Cancer Research [L328] til legene Morrison, Bond og Bell. The University of Leeds støtter Dr. Bell, Dr Bond og Dr. Morrison. Dr. Alsiary av et stipend fra Saudi Arabian departementet for høyere utdanning, Dr. Wilkinson ved Leeds Teaching Hospitals NHS Trust. Dr. Wilkinson har finansiering fra Wellbeing av kvinner. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Om lag 225 000 nye tilfeller av eggstokkreft ble diagnostisert i 2008 over hele verden, bestående av 4% av alle kvinnelige kreft [1], [2]. De fleste av ovariekreft er epitelial, ofte til stede ved avanserte stadier, og er forbundet med høye dødelighet [3]. Derfor undersøke funksjon og ekspresjon av potensielle prognostiske proteiner er viktig for å fremme forståelsen av den molekylære patogenesen av ovarialcancer (EOC). Dette er spesielt ønskelig med hensyn til identifisering av diagnostiske biomarkører for pasientbehandling [4].
MCPH1 Hotell og
MCPH5
genene koder Microcephalin og unormal spindel-lignende microcephaly-assosiert protein (ASPM) henholdsvis [5], [6].
MCPH1 Hotell og
MCPH5
er to av ti microcephaly gener identifisert, som er involvert i autosomal recessiv primære microcephaly (MCPH) [7] – [13]. Microcephaly er preget av redusert fosterets hjerne vekst som følge av mitotiske feil under embryonal utvikling av hjernen [14]. Microcephalin er en kjernefysisk og cytoplasma protein som består av 835 aminosyrer. Proteinet inneholder tre BRCA1 C-terminale domener (BRCT), en
N
-terminally plassert og to i
C
-terminalen [5]. Microcephalin er involvert i DNA-skade reaksjon med en ytterligere rolle som en regulator av kromosom kondensasjon forhindre celler fra å komme inn mitose før DNA-replikasjon er avsluttet [15] – [17]. Microcephalin er også kjent som BRIT1 (
BRCT
-Gjenta inhibitor av hTERT uttrykk), som opprinnelig ble identifisert som en transcriptional repressor av human telomerase revers transkriptase (hTERT), den katalytiske subenhet av human telomerase [18]. Den ASPM protein består av 3477 aminosyrer [6] organisert i en antatt
N
terminale microtubule bindende domenet [19], [20], to Calponin homologi gjenta motiver, over 80 isoleucin-glutamin (IQ) gjentar [6], [21] som typisk binde kalmodulin og en
C
terminus som består av en enkelt Armadillo lignende sekvens og en region som er involvert i cytokinese [8], [22]. ASPM spiller en rolle i å kontrollere mitotisk spindel funksjon [6], [22]. ASPM er plassert ved spinde polene i metafase og ved kjernen og sentrosomen under interfase [6], [22] – [27]. Videre ASPM lokaliserer til midbody under cytokinese, noe som tyder på at det spiller en rolle i abscission [22], [27].
Flere linjer av bevis indikerer at Microcephalin og ASPM spille en rolle i kreftutvikling. På DNA-nivå, Rai
et al.
Rapporterte at
MCPH1
kopiantall ble redusert i 40% (35/87) av avansert EOC og i 72% (39/54) av bryst krefttilfeller [16]. Tilsvarende på mRNA-nivå
MCPH1
mRNA ble redusert i 63% (19/30) av EOCs [16]. Vi har rapportert redusert Microcephalin proteinnivået i 29% (93/319) av invasive ductal brystcarsinomer med Microcephalin uttrykk avtagende med økende brystkreft klasse. Viktigere, Microcephalin var en uavhengig prediktor for generell brystkreft spesifikk overlevelse [28]. Nylig ytterligere to små brystkreft studier har bekreftet foreningen av redusert Microcephalin uttrykk med tumorprogresjon og prognose [29], [30]. Redusert Microcephalin uttrykk ble også rapportert i en liten studie av prostatakreft [16], noe som antydet at en negativ korrelasjon mellom Microcephalin nivåer, genomisk stabilitet og kromosomfeil. Nylig inaktivering av
MCPH1
av sletting, arrangøren metylering og mutasjon ble identifisert i en muntlig plateepitelkreft studie [31]. Denne studien viste også at Microcephalin løpet uttrykk hemmet spredning, invasjon og forankringsuavhengig vekst og tumorvekst i nakne mus som støtter tumor suppressor funksjon Microcephalin [31].
I motsetning til
ASPM
mRNA nivåene ble øket i tumor og transformerte humane celler [26], [32]. Økt
ASPM
mRNA og proteinnivåer ble også identifisert i glioblastoma multiforme (GBM), hvor de ble assosiert med økende svulst klasse [32], [33]. I tillegg
ASPM
mRNA oppregulering ble identifisert i 66% (162/247) av hepatocellulært karsinom, en observasjon assosiert med økt invasjon, høy scene og tidlig tumorresidiv [34]. Nylig oppregulering av ASPM korrelert med redusert pasientoverlevelse har også blitt identifisert i bukspyttkjertelkreft [35].
Våre siste EOC studie bestemmes en sammenheng mellom Microcephalin og ASPM nivåer med svulst klasse og overlevelse i cellelinjer og i primærkulturer av ondartede celler avledet fra eggstokkene ascites prøver [36]. I dette arbeidet har vi validert våre opprinnelige funn i en større skala studie hvor EOC vevsprøver og har undersøkt rollene til Microcephalin og ASPM i EOC progresjon. Våre resultater tyder på at Microcephalin og ASPM kan være nyttige biomarkører i EOC ledelse.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
Passende etisk godkjenning er innhentet fra den lokale forskningsetiske komité for Leeds Teaching Hospitals NHS Trust, Leeds, UK, (REC referanse 09 /H1306 /96). Alle deltakerne gitt skriftlig informert samtykke og alle data ble analysert anonymt.
Pasientprøver
En kohort av 25 svulst arkivering, formalinfiksert, parafininnstøpte (FFPE) blokker ble hentet fra histopatologi avdeling av St James «s University Hospital, Leeds og brukes til å lage treningssettet. Prøven satt i denne kohorten representert fire store (oftest oppstått) EOC undergrupper (serøs, endometrioid, mucinkjertler og karsinosarkom) og var hovedsakelig av grad 3 svulster. Alle blokkene i denne kohorten ble deretter sammen til en in-house vev microarray (TMA). En normal kohort besto av 16 eggstokkene vevsprøver tatt fra enten normal eggstokk eller fra normalt vev ved siden av svulst pluss fire normal eggleder og 4 normale endometrium prøvene var også tilgjengelig.
En annen uavhengig kohort av 322 EOC prøver ble innhentet fra Tissue Array Networks og ble utpekt valideringssettet. Valideringen sett besto av 294 forskjellige prøver av fem store EOC undergrupper (serøs, endometrioid, adenokarsinom, mucinous og klar celle), pluss 8 normale eggstokkreft vev tatt fra normal eggstokk og 20 fra normalt vev ved siden av svulsten. De 322 tilfellene var representert i 616 kjerner, med doble kjerner for krefttilfeller og en enkelt kjerne for normalt vev. Tissue kjernene var 0,6 mm i diameter med en tykkelse på 5 mikrometer. Kliniske data (klasse, patologi diagnose, International Federation of gynekologi og obstetrikk (FIGO) staging og TNM staging [37]) var tilgjengelig for dette kullet. Gjennomsnittsalderen for de 294 pasientene var 48 år (range: 19 til 76 år). Resultatene for assosiasjon med alder ble oppnådd etter at dataene ble dikotomisert i to grupper ( 50 og ≤50). Detaljerte pasientkarakteristika av valideringssettet er oppsummert i tabell 1.
Tissue microarray Construction
En in-house TMA ble konstruert fra 25 EOC prøver ved Leeds Institute of Cancer og patologi anlegget etter en protokoll beskrevet av Ellis
et al product: [38]. Manuelle vev arrayer slag med en diameter på 0,6 mm (Beecher Instruments, Inc) ble brukt til å lage kjernene. Tissue kjerner ble valgt ut fra den mest representative tumorområdet i hver svulst blokk etter gjennomgang av forbundet haematoxylin og eosin farget lysbilder av spesialist gynekologisk histopathologist (NW).
Immunohistochemistry Påvisning av Microcephalin og ASPM
for å optimalisere Microcephalin og ASPM flekker protokoll, i huset EOC TMA seksjonene ble farget ved hjelp av en rekke antistoff fortynninger og antigen gjeninnhentingsmetodene. Microcephalin og ASPM var farget hver for seg under de samme betingelser med unntak av antistoffet gjenfinning og fortynning. Lysbilder ble deparaffinised og utvannet ved hjelp av xylen og etanol serien. Hvis du vil blokkere hydrogen peroxydaseaktivitet, ble lysbilder dynket i 3% H
2o
2 i metanol. Antigen henting ble utført ved hjelp av Vector antigen gjenfinning buffer (Vector Laboratories Ltd) i en trykkoker i 4 minutter for Microcephalin og 2 minutter for ASPM. Seksjonene ble blokkert med 01:10 vektor kaseinløsning (Vector Laboratories) for å redusere ikke-spesifikk farging. På TMA seksjoner kanin anti-Microcephalin antistoff ab2612 (Abcam) ble brukt på 1/300 og kanin anti-
N
terminale ASPM antistoff 216,1 [36] brukes på 1/400. Platene ble inkubert ved 4 ° C over natten i et fuktet kammer. Etter tre vaskinger med TBS Tween (0,1%) lysbildene ble inkubert i 30 minutter ved romtemperatur med kanin /mus sekundære, peroksidase-konjugert EnVision polymer (DAKO). Etter ytterligere vaskinger reaksjonen ble visualisert ved tilsetning av 2% diaminobenzine + kromogen i DAP substratbuffer i 10 minutter (DAKO). Seksjoner ble kontra med Mayers hematoksylin (VWR International Ltd). Negative kontroller, uten primært antistoff og positive kontroller for normalt ovarievev ble inkludert i hver gruppe med immunhistokjemi.
Microcephalin og ASPM antistoff validering
For å bestemme flekkdannelsen spesifisiteten av antistoffet på Microcephalin FFPE-prøver, en immuniserer peptid blokkerer forsøket ble utført på EOC vevssnitt og på 25 kjernen i huset TMA. Antistoffet ble nøytralisert av pre-absorpsjon med BRIT1 peptid ab13737 (Abcam). Antistoffet ble fortynnet til sin forutbestemte arbeidskonsentrasjon (beskrevet ovenfor) og inkubert med et tidobbelt overskudd av peptid over natten ved 4 ° C før påføring på vev. Vevssnitt med nøytraliserte antistoff ble sammenlignet med tilsvarende vevsdelene farget med antistoff alene.
Vi hadde allerede bestemt antistoff spesifisiteten av ASPM antistoff 216,1 i tidligere arbeid ved peptid blokkere immunofluorescence eksperimenter [36]. Vi ytterligere bekreftet fargemønster av antistoffet observert i IHC ved farging samme in-house EOC TMA med et annet antistoff (279,3) genereres mot
C
terminus av ASPM. Liknende farge resultater ble oppnådd med begge antistoffene med bare små forskjeller mellom cytoplasmatisk fargenivåer.
For ytterligere validering av spesifisitet og sensitivitet av antistoffene og å kontrollere for effekten av formalin fiksering og gjenfinning antigen,
MCPH1 Hotell og
ASPM
ble slått ned i U-2 OS cellelinje (ATCC, Manassas, VA, USA) ved siRNA som tidligere beskrevet [17], [36], [22]. Etter 72 timer ble cellene høstet, pelletert, formalinfiksert og suspendert i 1% agar deretter parafin integrert og brukt som kontroller for antistoff validering.
Immunhistokjemisk Evaluering
Alle TMA seksjonene ble skannet ved hjelp av Aperio Scan Scope lysbilde skanner (Aperios Technologies) på 40x forstørrelse, ved hjelp morfometri verktøy i Imagescope programvare (Aperio). For både Microcephalin og ASPM de replikate kjerner for hver prøve ble bedømt for flekker intensiteter av nukleær og cytoplasmatisk farge (intensitet, 0 = ingen farging, 1 = svak farging, 2 = moderat farging og 3 = sterk farging) i tillegg til andelen av celler med positiv atom eller cytoplasma flekker innen kjernene (andel score). Å analysere Microcephalin flekker semikvantitativ Allred (rask) 8-unit systemet ble brukt [39]. Andelen av positive kjernefysiske eller cytoplasmiske fargede celler i hver kjerne ble definert som 0 = ingen farging, 1 = mindre enn 1% farging, 2 = 1-10% farging, 3 = 11-33% farging, 4 = 34-66% flekker, 5 = 67-100% farging. Sluttresultatet ble oppnådd ved å legge til intensitetspoeng til andelen score, oppnå et minimum score på 0 og en maksimal score på 8. Saker med en score på 4 eller lavere ble kalt lav, mens tilfeller med en score på 5 eller 6 var merket som moderat og prøver med en score på 7 eller 8 ble ansett som uttrykker høye nivåer av Microcephalin. For dataanalyse av ASPM ekspresjon en litt mer følsom dataanalysesystem ble anvendt, hvori fargeintensitet ble multiplisert med prosentandelen av celler med nukleær eller cytoplasmatisk farge [40]. Dermed laveste stillingen 0 og høyeste 300. Prøver med en score fra 0 ble kalt negativ, prøver med en score på 1-100 lav, prøver med en score på 101-200 moderat og prøver med en score på 201-300 var scoret så høyt uttrykk nivåer. For diskontinuerlige dataanalyse alle negative og lave prøver ble utpekt lav og alle middels og høye prøvene ble utpekt høye ASPM nivåer.
Statistical Analysis
Den ikke-parametrisk Kruskall-Wallis (KW) og Wilcoxon -Mann-Whitney (WMW) test ble brukt for å identifisere sammenhengen mellom Microcephalin og ASPM med kliniske variabler (sykdom stadium, klasse, histologi type, metastaser, spredning til lymfeknuter og alder av pasientene). Alle statistiske tester var tosidig, og en
P
≤ 0,05 verdier ble betraktet som statistisk signifikant.
Resultater
Microcephalin og ASPM Antistoff Karakterisering
Microcephalin og ASPM antistoffer ble opprinnelig optimalisert for bruk på parafininnstøpte TMA seksjoner. Immunhistokjemi med disse antistoffene viste at Microcephalin og ASPM ble lokalisert i kjernen og i cytoplasma av både normal (figur 1), og prøvene EOC vev (figur 2). Den kjernefysiske Microcephalin fargingsmønsteret ble opphevet når antistoffet ble pre-inkubert i nærvær av peptidet. Men noen ensartet lavt nivå bakgrunn cytoplasmatisk farge var fortsatt til stede i alle kjerner (fig S1). Derfor har vi ikke tatt med cytoplasma Microcephalin flekker i noen videre analyse
Normal eggstokkepitelet demonstrere sterk Microcephalin uttrykk i både kjernen og cytoplasma (A D). Og sterk kjernekraft og moderat cytoplasma ASPM uttrykk (G J). Normal eggleder demonstrere heterogene moderat kjernekraft og svak cytoplasma Microcephalin farging (B E) og ASPM flekker demonstrere sterke kjerne og moderat cytoplasma uttrykk (H K). Normal Endometriet viser heterogene sterke kjerne og cytoplasma Microcephalin farging (C F) og sterke kjerne og svak cytoplasma ASPM farging (I L). Alle bilder er x15 forstørrelse.
Serous adenokarsinom TMA kjerner viser kjernekraft og cytoplasma Microcephalin (A og B) og ASPM uttrykk (C og D) hhv. Hvit pil viser nukleær farging og sort pil viser cytoplasma farging. A og B er 20x, C og D er 40 gangers forstørrelse.
fargingsmønsteret for ASPM antistoff 279,3 utført i parallell til farging med antistoffet 216,1 avslørte at cytoplasmatisk farge var lik for begge antistoffer. Imidlertid 216,1 viste en mer markert kjernefargemønster enn 279,3 og følgelig dette antistoff ble anvendt for å flekke den EOC valideringssettet. Resultater for fargemønstre av representative kjerner og en oppsummering av de farge Resultatene er vist i figur S2 og tabell S1.
For ytterligere å bekrefte gyldigheten av antistoffer mot flekker parafininnstøpte vev ble antistoffer testet på parafin -embedded U-2 OS celler med og uten siRNA knockdown for Microcephalin eller ASPM. Knockdown celler for begge genene viste veldig svak flekker i forhold til kontroll siRNA (Figur S3).
Microcephalin Expression i Normal og EOC vevsprøver
Normal eggstokkreft, livmorslimhinnen og prøver egglederen vev alt avslørt sterke kjerne Microcephalin farging. Hoveddelen (90%) av normale eggstokk-epitelceller viste positiv farging Microcephalin mens dette var noe lavere (70-80%) i endometrium og eggleder prøver (figur 1 A-F). I starten var uttrykk for Microcephalin evaluert i in opplæring satt TMA. Dikotom analyse i treningssettet viste tap av Microcephalin uttrykk i 16/22 (73%) tilfeller (tabell 2). I EOC valideringssettet, var lav Microcephalin ekspresjon identifisert i 30% (89/294) av EOC prøver (Tabell 3). Siden vi var spesielt interessert i Microcephalin uttrykk nivåer og sin tilknytning til tumorgenesen, undersøkte vi våre IHC data for å identifisere potensielle sammenhenger med tilhørende kliniske data. Interessant, dichotomous analyse i treningssettet viste tap av Microcephalin uttrykk i klasse 3 EOC svulster (tabell 2). Dette funnet ble bekreftet i valideringssettet med lav atom flekker i hovedsak funnet i karakteren 3 svulster (48%, 53/110 p 0,0001). I lavgradige svulster, ble observert moderat eller høy nukleær farging (
p
0,0001) (figur 3). Microcephalin atom uttrykk også gått ned med økt tumorstadium (
p
= 0,0438) (figur 4). Pasienter over 50 år viste lavere atom Microcephalin nivåer (Tabell 3), men forskjellen var ikke statistisk signifikant (
p
= 0,0581). Ingen vesentlige endringer i Microcephalin uttrykket ble identifisert mellom ulike patologiske undergrupper (
p
= 0,486) (tabell 3). Imidlertid viste flertallet (8/10, 80%) av tydelige cellekreft moderat eller sterk Microcephalin farging. Dette kan gjenspeile det faktum at 6/8 av disse tilfellene var stadium I og eller at de ulike undergrupper av EOC følger ulike molekylære stier. Vi har også bemerket høy forekomst av tap av Microcephalin i serøs og mucinous adenokarsinom (68/207, 33% og 15/44, 34%, henholdsvis tabell 3). Figur 5A-D viser uttrykk for Microcephalin i de ulike ovarialcancer subtyper.
Ai. Normal eggstokkene epitelvev med høy Microcephalin uttrykk. Aii-iv. Adenokarsinom TMA kjerner viser sterk Microcephalin uttrykk i en lav karakter tumor (Aii), moderat Microcephalin i klasse 2 (AIII) og lave nivåer av atom Microcephalin uttrykk i en høy karakter tumor (Aiv). Alle bilder er 40x forstørrelse. B. Sammenhengen mellom atom Microcephalin uttrykk avtar med økende tumorKarakter (
p
0,0001 ved hjelp av en ANOVA test)
Ai.. Normal eggstokkene epitelvev demonstrere høye Microcephalin uttrykk nivåer. Aii-4IV Adenocarcinoma TMA kjerner viser sterk Microcephalin (Aii), moderat Microcephalin (AIII) og lave nivåer av atom Microcephalin uttrykk (Aiv) i fase 1, 2 og 3 svulster hhv. Alle bilder er 40x forstørrelse. B. Svake Microcephalin nivåer i kjernen er forbundet med avansert tumorstadium (
p
= 0,0438 ved hjelp av en ANOVA test).
A. Clear cell carcinoma og B. endometrioid adenokarsinom både viser sterk Microcephalin uttrykk. C. mucinous adenokarsinom og D. Serous adenokarsinom både presentere svak Microcephalin uttrykk. Alle bilder er x40 forstørrelse.
ASPM Expression i Normal og EOC vevsprøver
Den normale eggstokkreft epitel, endometrium og egglederen viste variabel ASPM uttrykk, med moderat til høy atom ekspresjon og lav til moderat cytoplasmatisk ASPM farging (figur 1G-L). Den ASPM uttrykk mønster i EOC ble bestemt ved immunhistokjemi hjelp av trening sett av 25 parafininnstøpte seksjoner. Den fargemønster i disse tumorprøver var nukleær og cytoplasma. I treningssettet, ble høy nukleær farging (kombinert medium og sterk fargemønster) observert i høy grad tumorer (9/14, 64,3%), mens høy cytoplasma ASPM var til stede i alle kjerner uansett klasse. Men oppdeling flekker i svak, medium og sterk viste en økning i høye atom ASPM nivåer i karakteren 3 svulster. Totalt sett er andelen positive atom farging ble kategorisert i sterk (21%, 4/19), medium (31,6%, 6/19) og svak (47,4%, 9/19) (tabell 4). Analyser viste at 10,5% (2/19) av prøvene hadde sterk cytoplasma farging og 89,5% (17/19) hadde moderat cytoplasma farging. Lav cytoplasmatisk farging ble ikke observert. Videre analyser viste en tendens til økt cytoplasmisk og nukleær ASPM farging med Karakter (tabell 4).
I valideringssettet atom og cytoplasma farging ble også observert. De fargemønstre varierte mellom tumorprøver og eksempler på lav og høy ASPM ekspresjon er vist i figur 6A-D. Ingen statistisk signifikante sammenhenger ble identifisert mellom atom ASPM uttrykk og kliniske data. Skjønt, interessant 52/294 (18%) av tilfellene viste høy atom ASPM uttrykk, som økte med karakteren. Analyse av valideringssett med kontinuerlig dataanalyse viste lave nivåer av cytoplasma ASPM signifikant korrelert med høy grad av svulster i serøs subtype (p 0,001) (figur 7A). Diskontinuerlig analyse viste at det var en signifikant korrelasjon mellom lav og høy cytoplasmisk ASPM tumor grad (p = 0,0138), og også tumor FIGO trinn (p = 0,032) (tabell 5). Videre analyse av usammenhengende data ved oppdeling til kreft undergrupper viste at i tillegg til korrelasjonen av lav cytoplasma ASPM med høy svulst klasse, det var også en sammenslutning av avtagende ASPM cytoplasmatiske nivåer med økende grad i serøs subtype (p 0,0001) ( Figur 7B) og en økning av ASPM ekspresjonsnivåer med økende tumorstadium i endometrioid undertype (p = 0,0229) (figur 7C). En signifikant sammenheng mellom avtagende cytoplasma ASPM farging og scene i serøs subtype ble også identifisert (p = 0,0017) (figur 7D). En signifikant sammenheng mellom cytoplasmatiske ASPM nivåer og pasientens alder ble ikke observert (tabell 5).
A og B. TMA kjerne med lav atom og cytoplasmisk ASPM uttrykk. C og D. TMA kjerne med høy kjernefysiske og cytoplasma ASPM uttrykk. Hvit pil viser atom flekken, indikerer svarte pilen cytoplasma flekken. A og C er 6.2x og B, D er 20x forstørrelse hhv.
A. Cytoplasmatiske ASPM nivåene reduseres med karakter i serøs EOC (kontinuerlige data, p 0,0001). B. Cytoplasmatiske ASPM nivåer reduseres med svulst karakter i serøs subtype (diskontinuerlige data, p = 0,0239). C. Cytoplasmatiske ASPM nivåene øker med sykdom stadium i endometrioid EOC (diskontinuerlige data, p = 0,0229). D. Cytoplasmatiske ASPM nivåer reduseres med sykdom stadium i serøs subtype (diskontinuerlige data, p = 0,0017). E. Cytoplasmatiske ASPM nivåer reduseres med tumorinvasjon (diskontinuerlige data, p = 0,02). F. Høye cytoplasmatiske ASPM nivåer korrelerer uten spredning til lymfeknuter (p = 0,04). Alle data analysert ved hjelp av en ANOVA test.
Forholdet mellom Histopatologisk Staging (FIGO og TNM staging) og Microcephalin og ASPM uttrykk
I valideringssettet Microcephalin ble funnet å redusere med økende tumorstadium når du bruker FIGO staging system (
p
= 0,0438) (tabell 3). Tilsvar ASPM cytoplasma farging avtok med økende tumorstadium når du bruker FIGO iscenesettelse system (
p
= 0,0032) (tabell 5). Microcephalin og ASPM ekspresjonsnivåene ble videre undersøkt i sammenheng med sykdommens alvorlighetsgrad som bestemmes av nivået av tumor invasivitet (T1, T2 og T3). Nuclear Microcephalin uttrykk nivåer redusert selv om svulsten var begrenset til eggstokkene (T1; p = 0,0021). Når man sammenligner Microcephalin ekspresjon i T2 med kontrollgruppen, ble resultatet mer signifikant (p = 0,0009). Det var imidlertid ingen signifikant forskjell i Microcephalin uttrykk når prøvene i T1, T2 og T3 grupper ble sammenlignet med hverandre. Videre gjorde Microcephalin uttrykk ikke signifikant korrelert med regional spredning til lymfeknuter (p = 0,1162) eller fjernmetastaser (p = 0,5251) (tabell 3).
For ASPM, en forening mellom cytoplasmatiske fargenivåer og tumor invasivitet var identifisert. Høye cytoplasmatiske ASPM nivåer ble funnet ved T1, som sunket betraktelig med T2 og T3 (p = 0,0198) (figur 7E). Høy cytoplasmatiske ASPM også korrelert med ingen spredning til lymfeknuter (N0) og det ble redusert med spredning til lymfeknuter (N1) (p = 0,04) (figur 7F) (tabell 5).
diskusjon
EOC er ofte først diagnostisert på et avansert stadium på grunn av mangel på symptomer og pålitelige tidlige deteksjonsmetoder. Følgelig identifisering av diagnostiske og prognostiske biomarkører for EOC er av stor klinisk betydning. I denne studien undersøkte vi uttrykket av to MCPH proteiner, Microcephalin og ASPM i EOC svulst vevsprøver. EOC viser en høy grad av Aneuploidy. DNA skade respons proteiner er en viktig forsvar mot genomisk ustabilitet og mangler i disse proteinene kan føre til kreft. Microcephalin har en kjent rolle i DNA-reparasjon og ASPM for spindel funksjon under mitose. Hensikten med denne studien var å finne ut om Microcephalin og ASPM uttrykk er knyttet til clinicopathological parametere hos pasienter med EOC. Begge proteiner hadde vist seg å bli deregulert i andre kreftformer på en måte som var forbundet med tumorprogresjon [16], [28] -. [30], [36]
Nylig rapporterte en sammenslutning av Microcephalin og ASPM nivåer i ondartede celler avledet fra ascitisfluider fra EOC pasienter med forskjellige klinikk-patologisk parametre [36]. I den foreliggende, i større målestokk studium, kjernekraft og /eller cytoplasmatisk Microcephalin farging ble identifisert i tumorcellene. Våre resultater i treningssettet viste en reduksjon i kjernefysisk Microcephalin uttrykk i 73% (16/22) av EOC svulster; denne andelen ble redusert til 30% (89/294) i valideringssettet. Denne forskjellen mellom de to kohortene reflekterer potensielt høyere antall klasse 3 tilfeller i treningssettet (73%, 16/22) i forhold til valideringssett (37%, 110/294). I denne studien lav Microcephalin uttrykk ble identifisert i høy klasse og avansert stadium tumorer (
p
henholdsvis 0,0001 og p = 0,0438). Disse funnene samsvarer med vår tidligere studie på eggstokkene ascites prøver som indikerte at Microcephalin uttrykket ble redusert i cellekulturer avledet fra ascites av EOC pasienter med avanserte svulster [36]. Våre resultater er kompatible med studier som rapporteres om redusert
MCPH1
DNA kopiantall i 72% (39/54) av brystkreft [16] og for våre egne funn av redusert Microcephalin uttrykk i 93/319 (29%) brystkreftprøver, særlig i høyere grad svulster [28].
Tidligere identifiserte vi en sammenheng mellom unormal lokalisering av Microcephalin med svulst karakter i primærkulturer av ondartede celler avledet fra ascitisfluider fra pasienter med EOC . I disse cellene, økt cytoplasma Microcephalin med svulst klasse. Vi foreslo at kan være på grunn av
MCPH1
delesjonsmutasjoner i C-terminal BRCT domener som tidligere har vist seg å resultere i Microcephalin flytte fra en kjernefysisk til cytoplasma lokalisering lik
BRCA1 product: [41 ], [42], [43]. En fersk studie karakteriserer forskjellig
MCPH1
spleisevarianter rapportert mutasjon eller sletting av kjernefysiske lokalisering signaler i
MCPH1
genet resulterte i en lokalisering endring fra kjernekraft til cytoplasma [43]. I denne studien svak til moderat Microcephalin cytoplasma farging ble sett i alle klasse 2 og 3 prøver og økt cytoplasmisk Microcephalin uttrykk var assosiert med økt tumorKarakter (
p
= 0,0051).
