Abstract
Kreft i bukspyttkjertelen er en av de dødeligste menneskelige kreftformer, og dens prognose har ikke bedret seg i løpet av de siste 40 årene. Musemodeller som spontant utvikler bukspyttkjertelen adenokarsinom og etterligner progresjon av sykdom hos mennesker er fremstår som et nytt verktøy for å undersøke grunnleggende biologi av denne sykdommen, og identifisere potensielle terapeutiske mål. Her beskriver vi en ny modell av metastatisk bukspyttkjertelen adenokarsinom basert på bukspyttkjertelen spesifikke, induserbar og reversibel uttrykk for en onkogen form for Kras, sammen med bukspyttkjertelen spesifikke uttrykk for en mutant form av tumor suppressor p53. Ved hjelp av høy oppløsning magnetic resonance imaging å følge enkeltdyr i longitudinelle studier, viser vi at både primære og metastatiske lesjoner avhenge kontinuerlig Kras aktivitet for vedlikehold. Men re-aktivering av Kras * etter langvarig inaktivering fører til rask svulst tilbakefall, heve bekymring for at Kras * -resistance kan til slutt bli kjøpt. Dermed identifiserer våre data Kras * som en nøkkel onkogen i bukspyttkjertelkreft vedlikehold, men øker muligheten for ervervet resistens bør Kras hemmere bli tilgjengelig for bruk i bukspyttkjertelkreft
Citation. Collins MA, Brisset JC, Zhang Y , Bednar F, Pierre J, Heist KA, et al. (2012) metastatisk kreft i bukspyttkjertelen er avhengig av onkogene Kras i Mus. PLoS ONE 7 (12): e49707. doi: 10,1371 /journal.pone.0049707
Redaktør: Hana Algül, Technische Universität München, Tyskland
mottatt: 30 mars 2012; Akseptert: 12. oktober 2012; Publisert: 03.12.2012
Copyright: © 2012 Collins et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette prosjektet ble støttet av University of Michigan biologisk Scholar Program og ved GI SPORE, P50CA13810 (Pilot Grant til MPdM) og av det amerikanske National Institutes of Health forskningsstipend P50CA93990. MRI utført av Center for Molecular Imaging støttes av NIH P50 CA093990. MAC er støttet av en University of Michigan-programmet i celle- og molekylærbiologi trening stipend (NIH T32 GM07315) og av en University of Michigan Senter for organ Training Grant (5-T32-HD007515). FB er støttet av American College of Surgeons Resident forskningsstipend og ved NIH T32 HD007505. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
bukspyttkjertel~~POS=TRUNC duktalt adenokarsinom (PDA), den vanligste formen for kreft i bukspyttkjertelen, er ofte assosiert med mutasjoner i Kras onkogen, oftest KRAS
G12D [1], [2]. Mutasjoner av tumor suppressor p53-mest vanlig R175H [3] – er ofte observert i humane prøver [1]. Uttrykk av mutant Kras
G12D (Kras *) og mutant p53
R172H -den mus ortolog av R175H- i musen bukspyttkjertelen ble brukt til å generere KPC modell. KPC mus nærmere etterligne progresjon av sykdom hos mennesker [4], [5] og svare på terapeutika på en lignende måte som humane pasienter. I motsetning til dette, tumorer transplantert i immunkompromitterte mus dårlig predikere terapeutisk respons [6], [7]. Den KPC modellen er dermed ideell for å studere kreft i bukspyttkjertelen formasjon. Men i denne modellen mutant Kras uttrykk er irreversible. Således KPC mus er ikke egnet for å studere rollen til Kras * i tumor vedlikehold. Siden narkotika målretting Kras * er for tiden utilgjengelig, genetisk modellering av Kras hemming er den eneste muligheten til å finne ut om denne onkogen er nødvendig for svulst vedlikehold.
, og andre, har nylig beskrevet induserbar-Kras * p53
+/- (iKras * p53
+/-) musemodell for kreft i bukspyttkjertelen, som gjør det mulig vev-spesifikk, induserbar og reversibel ekspresjon av mutante Kras i kombinasjon med et tap av funksjon allel av p53 tumor suppressor [8 ], [9]. iKras * p53
+/- mus utvikler invasiv, men ikke-metastatisk kreft i bukspyttkjertelen som er avhengig av vedvarende Kras * aktivitet for sin vekst og vedlikehold. Med andre musemodeller av bukspyttkjertelkreft, så vel som i andre tumormodeller, tap av funksjon av p53 akselerert tumordannelse, men bare sjelden ga opphav til metastatisk sykdom. I motsetning til dette, er ekspresjon av mutant p53 blitt vist å være meget pro-metastatisk [10], [11], [12]. Det er en viss variasjon i disse funnene: for eksempel, har metastatisk potensiale blitt beskrevet av andre grupper ved hjelp av KC eller iKras * mus, kombinert med tap av funksjon allel av p53 [9], [13], og dermed kan det være tilleggseffektene å vurdere , slik som genetisk bakgrunn av musene. Gitt at i vår mus koloni p53 tap-funksjon ikke gi metastatisk potensial til iKras * mus, genererte vi iKras * mus som også gjennomført en mutant p53 allel (p53
R172H, herved p53 *). Vårt mål var å skape en metastatisk modell hvor vi kunne ta rollen som Kras * i vedlikehold av metastatisk kreft i bukspyttkjertelen ved å følge mus i longitudinelle studier, ved hjelp av
in vivo
imaging.
(A ) genetiske sammensetningen av iKras * p53 * mus. (B) Forsøksplanlegging: doxy ble administrert kontinuerlig, starter på avvenning. Akutt pankreatitt ble indusert innen 72 timer, så dyrene var i alderen før de utviklet svulster. Kaplan-Meier overlevelseskurve. iKras * p53 *, n = 25; iKras * p53
+/-, n = 9. Log-rank statistisk analyse ga en P-verdi på 0,001. (C) Brutto morfologi bilder av en primærtumor og levermetastaser. T: tumor, S: mage, Sp: milt, Int: tarmen, L: leveren (D). Histologi av en moderat differensiert (øverste rad) og en un-differensiert (nederste rad) i bukspyttkjertelen svulst; lever- og lungemetastaser. T: svulst. Scale bar 100 um.
Resultater
I iKras * p53 * mus, bukspyttkjertel-spesifikke P48-Cre (Ptf1a-Cre) [14] recombines en floxed stopp kassett er satt inn i den Rosa26 locus, og således aktiverer ekspresjon av den transkripsjonelle aktivator rtTA- [15]. Cre rekombinasjon induserer også uttrykk av p53
R172H (p53 *) [16] fra sin endogene locus på rekombinasjon av en floxed stopp kassett. Den rtTA- er transkripsjonelt aktive i nærvær av doksycyklin (doxy), og inaktive i dens fravær. Dermed blir Teto-Kras
G12D (Kras *) [17] allele kan bli transkribert i en induserbar, vev-spesifikk og reversibel måte ved administrering av doksycyklin til dyrenes vann (Fig. 1A). For å indusere carcinogenesis, iKras * p53 * Musene ble plassert på doxy ved avvenning, etterfulgt av et kort utbrudd av akutt pankreatitt for å fremme Panins formasjon som tidligere beskrevet [18], [19]. Dyrene ble deretter holdt på doxy før de utviklet PDA og måtte avlives eller bukket under, mellom 2 og 45 uker etter doxy administrasjon (Fig. 1B og tabell 1). Interessant nok overlevelsen av iKras * p53 * dyrene var lengre enn for iKras * p53
+/- mus (se Kaplan Meier kurve i figur 1B.); Men årsaken til denne forskjellen er fortsatt uklart. Ved obduksjon iKras * p53 * dyr presentert med en tumormasse ofte i hodet av bukspyttkjertelen, sammen med synlige metastatiske lesjoner (Fig. 1C). En undergruppe av dyrene også presentert med hemoragisk ascites (n = 5). Den histologi av primærtumor avslørte moderat til un-differensiert bukspyttkjertelen adenokarsinom med rikelig desmoplastic stroma (Fig. 1D, Fig. 2A og tabell 1) som ligner på det som har blitt funnet i iKras * p53
+/- dyr [8] . Metastatiske lesjoner var svært utbredt i leveren (Fig 1C innfelt, 1D, 2A og tabell 1..), Og sjeldnere i lungene; duodenal invasjon ble også av og til observert (Fig. 1D, Fig. 2A, Tabell 1 og data ikke vist). Både primære svulster og metastaser uttrykt fosfor-ERK1 /2, en nedstrøms effektor av Kras (Fig. 2B). Ytterligere karakterisering av tumorer og metastaser viste ekspresjon av PDA-markører, slik som CK19 (fig. 2C), høy proliferativ indeksen målt ved Ki67-farging (fig. 2D), akkumulering av mutant p53-protein (fig. 2E), genomisk instabilitet som påvist ved γ-H2AX uttrykket (fig. 2F), og akkumulering av desmoplastic stroma inklusive glatt muskel aktin-uttrykkende fibroblaster (fig. 2G). Dermed iKras * p53 * musemodell rekapitulerer den histologi og biologisk oppførsel av menneskelig kreft i bukspyttkjertelen og tidligere musemodeller med den ekstra muligheten til å kontrollere Kras * uttrykk i en tid og orgel-selektiv måte.
(A) Histologi av en primær pankreatisk adenokarsinom og metastaser i lever og lunge. (B-G) Immunhistokjemi av primær tumor og metastaser ved: (B) fosfo-ERK1 /2; (C) CK19; (D) Ki67; (E) p53; (F) γH2AX; (G) αSMA. M: metastase. Scale bar 20 um.
For å bestemme effekten av Kras * inaktive på primærtumor og metastaser, evaluert vi ulike muligheter for
in vivo
avbildning, som ville tillate oss å følge de enkelte dyr over tid i langsgående studier. Fluorodeoxyglucose positronemisjonstomografi (FDG-PET) og magnetisk resonansavbildning (MRI) er blitt omfattende anvendt til bilde ortotopiske modeller av PDA [20], [21], og, i noen tilfeller, for spontane tumorer [22], [23] . Andre har brukt høy oppløsning ultralyd i primær genmanipulerte mus modeller av PDA [6]. Vi utforsket bruk av MR, en klinisk relevant avbildningsteknikk som ville tillate oss å få høyoppløselige bilder av svulster og metastaser og for å måle volumendringer over tid. Vi avbildes KPC mus (p48Cre; LSL-Kras, p53
R172H) [4], parallelt med iKras * p53 * mus å sammenligne tumordannelse i de to modellene. Til å begynne med mus som skal avbildes ble valgt basert på kliniske manifestasjon av sykdommen (dårlig belegge tilstand, oppsvulmet buk), eller, i noen tilfeller, ved palpering av en abdominal masse (Fig. 3A). Kontrollmus ble fotografert for å visualisere normal pankreas, nestet mellom magesekken, tolvfingertarmen, milt, og tilstøtende til høyre nyre (Fig. 3B). I både individuell KPC og iKras * p53 * mus (Fig. 3C og 3D), MR avbildning klart identifisert bukspyttkjertelen tumormassen. I tillegg, i iKras * p53 * muse, MR også visualisert flere metastatiske lesjoner til leveren, som strekker seg fra store til meget små lesjoner (0,11 mm
3) (Fig. 3D, nedre paneler). I etterfølgende bildebehandling eksperimenter ble dyrene avbildes månedlig, med start en måned etter aktivering av Kras * ekspresjon og induksjon av pankreatitt, og uavhengig av hvilket som helst tegn på sykdom. I denne andre kohort av dyr, ble mindre svulster av og til funnet, slik at tumorvekst kan følges over tid (fig. 3E og 4B fig.). Tumormetastaser og totalvolumet ble målt for individuelle dyr (fig. 3F, tumorvolumer, topp, og kombinerte metastaser volum, bunn, for KPC og iKras * p53 * # 1, # 2, # 3) ved de indikerte tidspunkter. Således er denne teknikken en effektiv, ikke-invasiv metode for å bestemme tilstedeværelsen av tumorer og metastaser i det enkelte dyr.
(A) Eksperimentell design. (B) MR av en kontroll mus bukspyttkjertelen og leveren. P: bukspyttkjertelen, S: mage, Sp: milt, K: nyre, L: lever, G: galleblæren. (C) Stor pankreatisk masse (T), men ingen metastatiske lesjoner i et KPC mus. (D) To iKras * p53 * mus på doxy 15 uker (til venstre) og 42 uker (til høyre) viser en stor pancreatic masse og levermetastaser. (E) Identifisering av mindre svulster (iKras * p53 * # 3, venstre panel, 38 uker) kan overvåkes som de utvikler seg til større svulster (iKras * p53 * # 3, panel rett, 40weeks). (F) Volum målinger av både primærsvulster og kombinerte metastaser for individuell KPC og iKras * p53 * dyrene på de angitte tidspunkter.
For å avgjøre om primærtumor og metastaser er avhengig Kras * vi trakk doxy i iKras * p53 * mus, og dermed inaktivere Kras * transgenet, og utført serie avbildning av samme dyr over tid (skjema i fig. 4A og 5A fig.). Etter Kras * inaktivering, primærtumormasse (Fig. 4B og 5B fig.) Tilbakegang til knapt synlig eller målbart innen 3 uker (fig. 4C og 5C fig.). Ved 6 uker etter Kras * inaktivering, bare sjeldne metastaselesjoner vedvarte, selv med redusert størrelse (Fig. 5C). For hvert tidspunkt, var vi i stand til å skaffe volumetriske tiltak både av primærtumor og av metastaser (fig. 4D og 5F fig.). Når musene ble dissekert etter langvarig Kras * inaktive, deres bukspyttkjertelen dukket opp små og gjennomsiktige, og manglet noen tydelig synlig tumormasse (fig. 4E). Histologisk analyse (fig. 4E, midtre panelet) viste fibrotisk parenchyma (
grønn pilspissen
), med acini (
rød pilspissen
) ispedd innenfor utvidede kanaler (
gul pilspissen
) , og er omgitt av fettvev (
blå pilspissen
). Noen av de utvidede kanaler beholdt intracellulær mucin opphopning er identifisert ved positiv PAS-farging (fig. 4E, høyre panel). Vi har også observert cyster foret med CK19-positive celler, som kan tyde på forrige svulst området (Fig. 4F venstre panel). De fibrotiske områdene beholdt kollagenfibre, som markert med Trichrome flekker, men cellene i dem manglet Smooth Muscle Actin ekspresjon og ble ikke proliferativ, noe som indikerer arrvev i stedet for aktiv stroma. Både gjennom de resterende bukspyttkjertelen og innenfor cyster, fosfor-ERK1 /2 uttrykk var sjeldne, begrenset til individuelle celler; Ki67-farging var tilstede i en undergruppe av epitelceller, men mitotiske figurer var sjeldne (fig. 4F). Således konkluderte vi at i denne spontan modell av kreft i bukspyttkjertelen Kras * var nødvendig for å opprettholde både den primære tumor og metastaser, selv i nærvær av en ytterligere onkogen, mutant p53. Avhengighet av en enkelt onkogen for avanserte tumorer har blitt observert før [24], [25], [26], [27], [28], [29]; Men til vår kunnskap, har effekten av onkogen inaktivering i metastaser fra solide tumorer vært sjelden adressert.
(A) Eksperimentell design. (B) MR tatt ved 38 uker etter Kras * aktivering viser normale bukspyttkjertelen morfologi. P: bukspyttkjertelen, S: mage, Sp: milt. Men i samme dyr, det er tegn på en liten bukspyttkjertelen tumor (T) ved 40weeks, 2 dager, som fortsetter å øke i størrelse i løpet av de neste fire ukene. (C) tumorregresjon oppstår følgende Kras * inaktivering. Av tre uker, er det ikke lenger en identifiserbar tumormassen. (D) Tumor volum på angitte tidspunkter. (E) Brutto morfologi i bukspyttkjertelen følgende Kras * inaktive – merk den lille bukspyttkjertelen uten tydelig tumormasse (venstre panel). Histologi av regressed vev (HE, midtre panelet Scale bar 100 um) avslører acini (rød pilspiss) omgitt av fibrose (grønn pilspiss) og fettvev (blå pilspiss) med utvidede kanaler (gul pilspiss) som inneholder noen celler som viser mucin opphopning identifisert av piler (PAS-farging, panel rett, Scale bar 20 um). (F) Histologi av fibrotiske cyster, som indikerer en mulig tidligere svulst hotellet (HE, venstre panel), er foret med celler som er CK19 positive (innfelt). Scale bar 100 um. Gomori Trichrome (Skala 100 um), SMA farging (innfelt), p-ERK1 /2, og Ki67 flekker indikere at den gjenværende fibrose ikke lenger er reaktiv. Skala barer 20 um.
neste satte å avgjøre om kreftceller hadde blitt fullstendig eliminert, eller om en undergruppe av dem hadde overlevd inaktivering av Kras *. For dette formålet, vi re-indusert Kras * uttrykket etter tumor regresjon. Ved doxy administrasjon, observerte vi raskt tilbakefall av primærtumormasse (Fig. 5D og 5F), noe som tyder på at noen kreftceller hadde overlevd transgen inaktivering og var i stand til å gjenoppta rask vekst. I tillegg er ytterligere analyse avslørte fosfo-ERK1 /2-nivåene ble øket i løpet av primærtumor, så vel som i leveren og lungemetastaser (fig. 5E). Denne observasjonen førte oss til å undersøke om tumorceller kan til slutt utvikler resistens mot Kras * inaktivering.
(A) Eksperimentell design. (B) Identifisering av en stor bukspyttkjerteltumormasse 22 uker etter Kras * aktivering. T: tumor, S: mage, Sp: milt, L: lever, G: galleblæren. (C) Bilder tatt 1, 3 og 6 uker etter Kras * inaktivering. Legg merke til sterkt redusert primærtumormasse og metastatisk belastning. (D) Reaktivering av Kras * fører til hurtig svulst tilbakefall. (E) Histologi av primærtumor, så vel som metastaser i lever og lunge etter tumor tilbakefall vis rikelig fosfo-ERK1 /2 ekspresjon (innfellinger). Scale bar 100 um (F) Tumor og total metastaser volum på angitte tidspunkter.
For å møte denne muligheten, og for å være i stand til å skaffe histologisk informasjon av samme svulst over tid, genererte vi primær cellelinjer fra iKras * * p53-tumorer. Primære tumorlinjer i kultur ble karakterisert enten ved epitel eller mesenkymale lignende morfologi (fig. 6A og 6C). Ekspresjon av mutant Kras * RNA ble regulert ved doxy i kultur, som forventet (fig. 6A og 6C). Videre bestemmes vi Ras aktivitet i iKras * p53 * primære cellelinjer var sammenlignbart med nivåene av aktive Ras i celler hentet fra KPC svulster (Fig. 6G). Fosfor-ERK1 /2 plan var opprinnelig regulert av doxy i mediet; ble imidlertid denne reguleringen svekket over tid i kultur, med fosfor-ERK1 /2 nivåer blir konstitutivt forhøyet, selv om Kras * uttrykk var fortsatt doxy avhengig (Fig. 6B og 6D). Interessant, spredning, målt ved prolifererende cell nuclear antigen (PCNA), synes ikke å være doxy avhengige i kultur. Men en av cellelinjene (iKras * p53 * -2) viste økt ekspresjon av apoptose markør spaltet caspase-3 som reaksjon på fjerningen av doxy fra mediet (Fig. 6E og 6F). Dataene er i samsvar med tidligere observasjoner som en undergruppe av menneskelige kreft i bukspyttkjertelen celler er avhengig av onkogene Kras for å overleve [35], [36].
(A) Primary cellelinje iKras * p53 * -1 utstillinger epitel morfologi og demonstrerer doksycyklin avhengig Kras * uttrykket (* p 0,05), og pErk1 /2 nivåer på passasje 5. (B) Den samme cellelinje ved passering 12; Kras * uttrykket er fortsatt avhengig av doxy (*** p 0,001), men pErk1 /2 plan er ikke avhengig av Kras * uttrykk. (C) En andre primær cellelinje, iKras * p53 * -2, har mesenchymale morfologi. Ved passering 6, Kras * uttrykket er avhengig av doxy (** p 0,01), og pErk1 /2 plan avhenger Kras * uttrykk. (D) Analyse ved passering 11: Kras * er fortsatt regulert av doxy (* p 0,05, ** p 0,01), men pErk1 /2 nivåer forblir forhøyet. (E) Western blot-analyse av apoptose, angitt med spaltet caspase-3 (CC3), og proliferasjon, målt ved prolifererende cell nuclear antigen (PCNA), i begge iKras * p53 * -1 og iKras * p53 * -2-cellelinjer. (F) Immunofluorescens av apoptose, angitt med spaltet caspase-3 (CC3), i iKras * p53 * -2-celler enten i nærvær av (48 h) eller fravær (-48 h) av doxy i media. DAPI farging markerer kjerner. Scale bar 100 um. (G) Ras pull-down analysen viser at Ras aktivitetsnivået er sammenlignbare mellom iKras * p53 * cellelinjer og celler fra KPC svulster.
For å bestemme effekten av Kras * inaktive
in vivo
, injisert vi cellene subkutant i NOD /SCID-mus. Mens subkutan injeksjon er ikke egnet for pre-kliniske studier av kreft i bukspyttkjertelen, siden den ikke reflekterer kompleksiteten av svulsten mikromiljøet, gir det likevel en avlesning av evne til kreftceller til å vokse
in vivo
. Alle de linjene som ble testet (n = 3) hurtig dannes svulster når transplantert i NOD /SCID-mus holdt på doxy-vann. Ved doxy tilbaketrekking, svulstene første sluttet å vokse og deretter tilbakegang raskt; Interessant, fullstendig regresjon ble bare observert i cellelinjen som var avhengig av onkogene Kras for å overleve i cellekultur (iKras * p53 * -2). Etter en latenstid, men tumorene vokste tilbake i fravær av doxy (Fig. 7A og 7C fig.). Histologisk analyse viste at de transplanterte tumorer, så vel som fikk tilbakefall tumorer lignet den primære svulsten de var avledet fra (Fig. 7B og fig. 7D, sammenlign med fig. 1 D, henholdsvis topp- og bunnpaneler). Både fosfo-ERK1 /2 og Ki67-ekspresjonsnivåene ble først nedregulert ved Kras * inaktivering (fig. 7D, innfelt), men uttrykt i tilbakefall tumorer (Fig. 7B og fig. 7D). Vi har også observert nedregulering av SMA i fibroblaster som omgir tumorcellene, selv om, som forventet, SMA-ekspresjon ble holdt tilbake i vaskulaturen-assosierte fibroblaster (fig. 7d), som indikerer en endring i epitel-mesenchymale interaksjoner ved Kras * inaktive i epitel. Når vi analyserte uttrykk for onkogene Kras * i svulstene, fant vi at tilbakefall svulster hadde konstitutivt forhøyet uttrykk for Kras *, noe som indikerer tap-av doksycyklin avhengighet i transgenet (Fig. 7E). Det synes derfor sannsynlig at tumorresidiv er på grunn av selektivt trykk for Kras * uttrykk, og ikke for å ervervet uavhengighet fra Kras *. Vi utforsket også om flere onkogene trasé kan bidra til tilbakefall. Vi gjorde ikke oppdage eventuelle endringer i EGF signalveien, men vi observerer en økning i myc uttrykk i tilbakefall tumorer (Fig. 7E, data ikke vist).
(A) Tumor volum målt over tid for iKras * p53 * -1 celler transplantert subkutant i NOD /SCID-mus. Den gule linjen viser tilstedeværelse av doxy, svarte streker viser forekomst av doxy, piler indikerer slakte tidspunkter. N = 5. (B) Histologi og fosfor-ERK1 /2 uttrykk (innfelt) fra iKras * p53 * -1 svulster høstet under den første vekstfasen og for tilbakefall svulster. Scale bar 100 um. (C) Svulstdannelse, regresjon, og tilbakefall i NOD /SCID-mus injisert subkutant med primære cellelinje iKras * p53 * -2. N = 5. En andre kohort av NOD /SCID-mus ble injisert med iKras * p53 * -2-celler, men opprettholdt i fravær av doxy som ikke utvikler tumorer. N = 10. Den gule linjen viser tilstedeværelse av doxy, svarte streker viser forekomst av doxy, piler indikerer slakte tidspunkter. (D) Histologi og pErk1 /2 (innfelt), Ki67 og SMA uttrykk for iKras * p53 * -2 svulster under vekst, regresjon, og tilbakefall faser. Scale bar 100 um. (E) Kvantitativ PCR for onkogene Kras * og myc uttrykk i iKras * p53 * -2 svulster.
I et annet sett av eksperimenter, injisert vi tumorceller i NOD /SCID-mus i fravær doxy, for å bestemme hvorvidt Doxy-uavhengige celler var allerede til stede i tumorlinjer. I dette tilfelle tumorcellene ikke klarte å gi opphav til svulster i løpet av en periode på 13 uker (figur 7C.); således, dysregulering av det Kras * transgenet var ikke sannsynlig å være til stede i den initielle cellepopulasjonen, men det oppsto ble cellene vokser i NOD /SCID-mus. I sammendraget, våre observasjoner tyder på at
in vivo
, svulstcellene er avhengige av onkogene Kras * til å danne og opprettholde svulster. Av notatet, hadde vi ikke observere tilbakefall i iKras * p53 * mus, men bare når cellene ble dyrket og re-etablert i NOD /SCID-mus; Det er derfor mulig at det annet miljø, muligens på grunn av fraværet av et funksjonelt immunsystem, eller på grunn av manipuleringen av cellene, kan være ettergivende for tumorvekst.
diskusjon
Takk til studier i musemodeller som tett etterligner utviklingen av sykdom hos mennesker, samt genomiske data og studier i primære humane svulster, har vi utviklet en sofistikert forståelse av biologien til kreft i bukspyttkjertelen [1], [30], [31]. Gitt den komplekse mutasjons profilen til kreft i bukspyttkjertelen og det blir umulig å målrette hver eneste endring, er det av avgjørende betydning for å forstå genene /trasé som kreves for svulst vedlikehold. Mutasjoner i Kras-genet forekommer tidlig under sykdomsutviklingen [32]. Musemodellstudier har vist en nøkkelrolle av mutante Kras i initieringen av denne sykdom [33], [34]. Videre er en undergruppe av menneskelige bukspyttkjertelen kreft cellelinjer krever Kras * for vekst og overlevelse både
in vitro Hotell og i immunkompromitterte vert mus [35], [36]. I tillegg kan andre humane tumorer så som lunge adenokarsinom og brystcancer viser lignende avhengighet av onkogene Kras [17], [24]. Vi har nylig vist at kreft i bukspyttkjertelen i musen er avhengige av Kras * [8]. Men vår første studien ikke strekker til å analysere rollen Kras * i nærvær av en annen onkogen hendelse, heller ikke det undersøke metastatisk sykdom. Gitt at kreft i bukspyttkjertelen er svært metastatisk hos mennesker, vi følte det var viktig å utvide vår tilnærming til å inkludere denne egenskapen ved å kombinere Kras * uttrykk med mutant p53 *. Selv i nærvær av p53 *, viser vi at Kras * er nødvendig for vedlikehold av primær tumor og metastaser. Men kreftceller levde Kras * inaktivering, og ved Kras * reaktive, ga opphav til fornyet tumorvekst. Dessuten, når tumorceller ble isolert og implantert i immunkompromitterte verter, de raskt utviklet resistens. I andre modeller adressering onkogen avhengighet, har eventuelt oppkjøp av resistens er ofte observert [24], [37]. I vårt system, er det fortsatt ikke bestemt om tilstedeværelse av mutant p53 fremmer motstand mot Kras * hemming, eller om immuno-kompromittert status for verten er givende for svulst tilbakefall, som tidligere antydet [38]. Til sammen våre funn validere begrepet hemme Kras i bukspyttkjertelen kreftpasienter; Men de gir også en advarsel om potensialet for kreftceller til slutt omgå deres onkogen avhengighet. Fremtidige studier bør være rettet mot å forstå mekanismene som gjør at en undergruppe av kreftceller til å overleve Kras * inaktive å gi strategier for fullstendig svulst utrydding.
Materialer og metoder
Mus
Mus ble plassert i patogenfrie fasilitetene på University of Michigan Comprehensive Cancer Center. Denne studien ble godkjent av University of Michigan University komité for bruk og vedlikehold av dyr (UCUCA) retningslinjer. p48Cre (Ptf1a-Grobunn) mus [14] ble intercrossed med Teto-Kras
G12D [17], Rosa26
rtTA- /rtTA- [15] og p53
R172H /+ [16] mus til å generere p48Cre; Teto-Kras
G12D; Rosa26
rtTA- /+; p53
R172H /+ (iKras * p53 *). Littermates mangler Cre eller mutanten Kras og p53-alleler ble anvendt som kontroller. KPC mus [4] og iKras * p53
+/- mus [8] ble beskrevet tidligere.
Doxy ble administrert via drikkevannet, ved en konsentrasjon på 0,2 g /l i en oppløsning av 5 % sukrose, og erstattet hver 3-4 dager.
pankreatitt indusert gjennom to serie på åtte time intraperitoneale injeksjoner av caerulein (Sigma) ved en konsentrasjon på 75 ug /kg, i løpet av en 48-timers periode som tidligere beskrevet [18].
Magnetic Resonance Imaging
Mus ble anestetisert med 1-2% isofluran /luft, og kroppstemperaturen ble opprettholdt ved å blåse varm luft gjennom boringen av magneten ved hjelp en Air-Therm (World presisjonsinstrumenter, Sarasota, FL). MR ble utført ved hjelp av en 7 T Agilent (Palo Alto, California)
Direct Drive
system med en kvadratur rottehode volumic polen (M2M Imaging, Cleveland, Ohio). Mus ble plassert liggende i spolen, tapet under brysthulen på senga for å redusere luftbevegelse. T2-vektede bilder ble anskaffet ved hjelp av en rask spin ekko multi-slice sekvens med TR /TE: 4000/30 ms, 8 ekko tog, 4 gjennomsnitt, 2 dummy skanner, synsfelt (FOV) = 25 x 25 mm
2, matrise size = 128 × 128, skivetykkelse = 1 mm, antall skiver = 25 sammenhengende. Bruke egenutviklet programvare MATLAB (De MathWorks, Inc., Natick, MA) svulsten grensen ble manuelt definert på hvert stykke og deretter integrert på tvers av sektorer for å gi en volumestimat.
Immunohistochemistry
Histologi og Immunhistokjemi ble utført som beskrevet tidligere [8]. En liste av antistoffer er gitt i Tabell 2. Bilder ble kjøpt med et Olympus BX-51 mikroskop, og Olympus DP71 digitalkamera, og DP Controller programvare.
Etablering av primære cellekulturer
Tissue ble høstet fra den primære tumor, hakket, og spaltet med 1 mg /ml kollagenase V (Sigma) ved 37 ° C i 15 minutter. Fordøyelsen ble stoppet ved tilsetning av komplett medium: RPMI-1640 (Gibco) + 10% føtalt bovint serum + 1% penicillin /streptomycin. Celler ble isolert ved filtrering gjennom en 100 um cellefilter og sådd ut i komplett medium inneholdende doxycyclin (Sigma) ved 1 pg /ml.
Subkutan tumor-transplantas
1 x 10
6 iKras * p53 * celler ble injisert subkutant i flanken av NOD /SCID-mus i en 01:01 forhold av Matrigel (BD Biosciences) og komplett medium. Doxy ble administrert gjennom drikkevannet i en konsentrasjon på 0,2 g /l i en oppløsning av 5% sukrose i 3 dager, og i chow (BioServ). Tumorstørrelse ble målt med skyvelære.
Kvantitativ RT-PCR
RNA ekstraksjon, cDNA forberedelse og kvantitativ PCR for Kras * og normalisering til GAPDH ble utført som tidligere beskrevet [8]. Statistisk analyse ble utført med en uparet t-test.
Western Blot analyse
Cellene ble lysert i RIPA-buffer (SigmaAldrich, R0278) og protease-inhibitor (Sigma-Aldrich, P8340). Like mengder protein ble underkastet elektroforese på 12% eller 4-15% gradient SDS-PAGE-geler, overført til PVDF-membran (Bio-Rad). Membranene ble blokkert med 5% melk, og primært antistoff inkubasjoner ble utført over natten ved 4 ° C. Primære antistoffer og fortynninger er gitt i tabell 2. Sekundært antistoff HRP-konjugert anti-kanin (1:5,000) ble anvendt, og detektert med Western Lightning Plus-ECL (Perkin Eimer). Proteinbånd ble visualisert på Kodak Biomaks XAR film.
Aktiv Ras Pull-down analyse
Pull-down og immunoblotting av aktiv Ras ble utført ved hjelp av en Active Ras rullegardinsett (Pierce) etter den produsentens instruksjoner.
takk
Vi takker Esha Mathew for kritisk lesing av manuskriptet og Marsha Thomas for laboratorium støtte. Den CK19 antistoff (Troma III) ble hentet fra Iowa Developmental hybrid Bank.
