Abstract
Motstand mot cisplatin-basert kjemoterapi er en viktig årsak til behandlingssvikt avansert blærekreft (BC) pasienter. Det er økende bevis for at microRNAs er involvert i utvikling og progresjon av BC. Men lite er kjent om funksjonen til microRNAs i å forutsi effekten av adjuvant kjemoterapi på BC overlevelse og regulere respons på cisplatin. For å løse dette problemet, ansatt vi RT-qPCR for å evaluere den kliniske betydningen av Mir-203 uttrykk i 108 vev av BC pasienter som får cisplatin-basert adjuvant kjemoterapi, og utført in vitro studier for å utforske kjemoterapeutiske følsomhet for cisplatin i MIR-203 overekspresjon BC celler. Vi fant MIR-203 nivåene var signifikant lavere i BC progresjon gruppen enn ikke-progresjon gruppe (
P
0,001). ROC kurven analyse illustrert MIR-203 kunne gi en betydelig skille kommet pasienter fra de uten progresjon (
P
0,001), noe som ga et område under ROC-kurven av 0,839 (95% CI, 0,756 til 0,903). Videre lav Mir-203 uttrykk korrelert med forkortet progresjonsfri overlevelse (PFS) og total overlevelse (OS) av BC pasienter, og var en uavhengig prognostisk faktor. Overekspresjon av MIR-203 i 5637 og T24 BC celler kan redusere celleviabilitet, forbedre cisplatin cytotoksisitet, og fremme apoptose. Western blotting og luciferase reporter analysen viste BCL-w og Survivin var direkte nedstrøms mål for Mir-203. Det var også en signifikant invers sammenheng mellom MIR-203 og BCL-w eller Survivin uttrykk i BC vev (r = -0,781, -0,740, både
P
0,001). I konklusjonen, redusert MIR-203 spår progresjon og dårlig prognose for BC pasienter behandlet med cisplatin-basert kjemoterapi mens MIR-203 overekspresjon kan forbedre cisplatin allergi ved å fremme apoptose via direkte rettet mot BCL-w og Survivin
Citation.: Zhang X Zhang Y, Liu X, Fang A, Li P, Li Z, et al. (2015) mikroRNA-203 er en prognostisk indikator i blærekreft og kjemosensitiviteten å Cisplatin via apoptose ved Targeting BCL-w og Survivin. PLoS ONE 10 (11): e0143441. doi: 10,1371 /journal.pone.0143441
Redaktør: Bernard Mari, IPMC, CNRS UMR 7275 UNS, FRANCE
mottatt: 30 juli 2015; Godkjent: 04.11.2015; Publisert: 23.11.2015
Copyright: © 2015 Zhang et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av National Natural Science Foundation of China (https://www.nsfc.gov.cn/) til CW (nr 81271916) ; Foundation National Natural Science of China (https://www.nsfc.gov.cn/) til XZ (nr 81301506); Foundation Natural Science i Shandong-provinsen (https://www.sdnsf.gov.cn/portal/) til XZ (ZR2013HQ063); . Og doktorgradsprogram of Higher Education of China (https://www.cutech.edu.cn/cn/kyjj/gdxxbsdkyjj/A010301index_1.htm) til XZ (nr 20130131120067)
Konkurrerende interesser: Forfatternes har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer.
Innledning
på verdensbasis er blærekreft (BC) er den nest vanligste kreftformen i urinveiene, med ca 386 300 nye tilfeller og 150,200 dødsfall årlig [1 ]. Fordi de fleste lokalavansert BC pasienter opplever tilbakefall etter radikal cystektomi [2], adjuvant kjemoterapi er vanligvis preformed i et forsøk på å forsinke tilbakefall og forlenge overlevelsen. For tiden er cisplatin en av de viktigste cytostatika i BC kombinasjonsregime, slik som MVAC (methotrexate, vinblastine, doksorubicin, og cisplatin) og GC (gemcitabin og cisplatin). Imidlertid har bare 50% av muskel invasive BC pasienter svarte på cisplatin-basert kjemoterapi [3]. Enda verre, noen pasienter bare lider toksisitet uten å oppnå kjemoterapeutiske fordel. Derfor er det et presserende behov for å forutsi effekten av adjuvant kjemoterapi på BC overlevelse og forstå mekanismene som hindrer respons på kjemoterapi.
Nyere studier har funnet resistens mot cisplatin behandling kan være mediert av microRNAs (miRNAs) [ ,,,0],4, 5]. mirnas er en klasse av ikke-kodende regulatoriske RNA bestående av omtrent 22 nukleotider som virker primært for å nedregulere mål- mRNA ved spesifikt å binde seg til sine 3′-ikke-translaterte området (3′-UTR) og deretter fremme nedbrytning og /eller inhibering av oversettelses [6, 7]. Flere publikasjoner har dokumentert mirnas kan fungere som tumor suppressors eller onkogener er involvert i tumordannelse, vedlikehold og metastaser, og er potensielle biomarkører for kreftdiagnose, terapeutisk utfall og prognose [8-10]. Blant disse MIR-203 fungerer vanligvis som en svulst suppressor, og er nedregulert i flere typer av humant maligniteter inkludert BC [11]. Nylig har MIR-203 uttrykk vært knyttet til utviklingen av resistens mot kjemoterapi i mange kreftformer. For eksempel ble MIR-203 nivåer redusert i oppkjøpte kjemoterapi narkotika-resistente brystkreft celler [12]. Overekspresjon av MIR-203 forbedret anticancer effekten av paclitaxel i tykktarm kreft celler gjennom å hemme celleproliferasjon, fremme celle apoptose og død [13]. I kontrast, Zhou et al [14] fant eksogene uttrykk for MIR-203 indusert motstand mot oksaliplatin i kolorektal kreftceller. Inntil nå, det er lite kjent om den potensielle rolle MIR-203 i cisplatin-baserte BC kjemoterapi og videre forskning er nødvendig.
I denne studien, MIR-203 ble undersøkt i klinisk resected vev av BC behandlet med radikal cystektomi og cisplatin-basert adjuvant kjemoterapi, og sammenhengen mellom MIR-203 og prognose ble analysert. Videre ble mekanismene bak rollen MIR-203 i chemoresistance av BC undersøkt. Vi fant lav uttrykk for MIR-203 ble korrelert med progresjon og dårlig overlevelse av BC pasienter som får cisplatin-basert adjuvant kjemoterapi. Videre restaurering av MIR-203 uttrykk kan øke følsomheten av cisplatin i BC cellene gjennom å fremme celle apoptose ved å målrette BCL-w (også kjent som BCL2L2) og Survivin (også kjent som BIRC5), som indikerte MIR-203 kan ha noen potensiell verdi i prognose prediksjon og terapeutisk anvendelse.
Materialer og metoder
Pasienter og vevsprøver
studiet ble godkjent av etikkomiteen av Qilu Hospital of Shandong University, og skriftlig informert samtykke fra hver pasient ble også oppnådd. Den første studien inkluderte totalt 149 BC pasienter behandlet med radikal cystektomi og cisplatin-basert kjemoterapi ved Qilu Hospital, Shandong University mellom april 2007 og mars 2010. Alle pasientene hadde histologisk bekreftet lokalisert overgangsordning celle carcinoma, iscenesatt som pT3a-4a /N + og M0 i henhold til 2010 AJCC /TNM klassifisering. Standarden kjemoterapeutiske regime (MVAC eller GC) ble gitt mellom 3 til 10 uker etter fullstendig reseksjon, med maksimalt 6 sykluser med mindre progresjon eller uakseptabel toksisitet dukket opp. Av disse 25 radioterapi, BCG behandling eller neoadjuvant kjemoterapi, og 16 ble ekskludert på grunn av ufullstendig reseksjon. De varetekts 108 pasienter ble fulgt opp med cystoskopi kvartalsvis for de første 2 årene, deretter halvårlig til 5 år, og deretter årlig frem til januar 2015. Progresjon ble definert som lokoregionalt tilbakefall, fjernmetastaser eller død på grunn av BC. Progresjonsfri overlevelse (PFS) ble beregnet fra tidspunktet for operasjonen til datoen for første progresjon, og total overlevelse (OS) ble beregnet fra tidspunktet for operasjonen til dødsdato. Pasienter uten over hendelsen ble sensurert ved studiestart ferdigstillelse. Alle vev var snap-frosset og bekreftet ved patologisk analyse, og deretter lagret ved -80 ° C til RNA ekstraksjon.
Cellelinjer og kultur
Den menneskelige BC cellelinjer (5637 og T24) og HEK 293T cellelinjen ble anskaffet fra American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA) og holdt i RPMI 1640 (Thermo Fisher Scientific) supplert med 10% føtalt bovint serum (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) og dyrket ved 37 ° C med en fuktig miljø med 5% CO
2 i luft.
Transfeksjon
Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) ble anvendt for speil 203 ligner /miRNA ligner negative kontroll transfections i henhold til produsentens instruksjoner. MIR-203 etterligner (Dharmacon, Lafayette, CO, USA) var dobbelt-RNA oligonukleotider utformet for å etterligne endogen, Eldre MIR-203. miRNA ligner negativ kontroll (Dharmacon) var basert på cel-MIR-67, modne sekvens: UCACAACCUCCUAGAAAGAGUAGA, og hadde identisk design og modifikasjoner som Mir-203 etterligner
RNA ekstraksjon og RT-qPCR
Total RNA ble ekstrahert fra vev ved hjelp av standard TRIzol metode (Invitrogen, Carlsbad, California) etter produsentens protokoll, og målt ved Nanodrop spektrofotometer (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). RT-qPCR ble utført i ABI PRISM 7500 Sequence Detection System (Applied Biosystems). Påvisning av MIR-203 ble utført som beskrevet tidligere [15]. For BCL-w og survivin mRNA kvantifisering, RNA ble revers-transkribert ved hjelp av High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), deretter 10 ganger fortynnet cDNA ble forsterket med Power SYBR Grønn PCR Master Mix ( Applied Biosystems). Den relative uttrykket nivået av MIR-203 og BCL-w og Survivin mRNA ble beregnet ved hjelp av to
-ΔΔCT metoden gjennom normalisert til referanse gener U6 snRNA og GAPDH mRNA, henholdsvis.
Celleviabilitet analysen
Celleviabilitet ble kvantifisert ved hjelp av Cell Counting Kit-8 (CCK-8; Diojindo Laboratories, Kumamoto, Japan) i henhold til produsentens instruksjoner. Celler (5 x 10
3 celler /brønn) ble sådd ut i 96-brønners plater i triplikat 24 timer etter transfeksjon og inkubert med 0, 5, 10, 15, 20, 25 og 30 pm cisplatin i 100 ul kulturmedium for en annen 24 timer. Deretter ble WST-8-substrat tilsatt ved 37 ° C i 2 timer, og absorbansen ble avlest ved spektrofotometer ved 450 nm.
Strømningscytometri for apoptose assay
Strømningscytometri-analyse av apoptose ble analysert ved anvendelse av en Annexin V-FITC /PI farging kit (BestBio, Shanghai, Kina) i henhold til produsentens instruksjoner. Tjuefire timer etter transfeksjon ble celler (1 x 10
4 celler /brønn) ble stimulert med 5 uM cisplatin i 48 timer og deretter samlet inn. Etter vasking 3 ganger med med kald PBS ble cellene resuspendert i bindingsbuffer, etterfulgt av farging med Annexin V-FITC i 15 minutter og PI i 5 min i mørke. 1 × 10
4 celler ble vurdert på en FACS Calibur flowcytometer (BD, Bedford, MA, USA). Alle forsøk ble utført in triplo.
TUNEL assay
celler (1 x 10
4 celler /brønn) ble sådd ut i 96-brønners plater i triplikat etter transfeksjon og inkubert med 5 uM cisplatin i 100 ul kulturmedium i 24 timer. Celler ble fiksert i 4% paraformaldehyd i 30 minutter, deretter nøytralisert med 2 mg /ml i 5 min Glycine, permeabilisert i 0,1% Triton X-100 i 10 minutter, og til slutt merket med fluorescein-12-dUTP ved bruk av terminal deoksynukleotidyltransferase. Den lokaliserte grønn fluorescens av apoptotiske celler (fluorescein-12-dUTP) ble oppdaget av fluorescens mikroskopi.
Western blotting-analyse
Førti-åtte timer etter transfeksjon ble cellene lysert i iskald radio immunoutfelling assay (RIPA) buffer i 30 min, og proteinkonsentrasjonen ble kvantifisert ved anvendelse av Bio-Rad proteinanalyse-reagens (Bio-Rad, CA, USA). Tretti pg proteinprøver ble lastet og separert på 10% SDS-polyakrylamidgeler, og overført til polyvinylidenfluorid membraner (Millipore, Bedford, MA, USA). Membranene ble først blokkert med 5% ikke-fett skummet melk i 2 timer og deretter inkubert med anti-Bcl-w (1: 1000; Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA), anti-Survivin (1: 1000; Abcam, Cambridge, Massachusetts, USA) eller anti-β-actin kanin monoklonalt antistoff (1: 1000; Cell Signaling Technology) over natten ved 4 ° C, etterfulgt av inkubasjon med HRP-merket sekundært antistoff (1: 5000; Cell Signaling Technology) i 1 time ved romtemperatur. Til slutt ble båndene visualisert ved hjelp chemiluminescence deteksjon kit (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA) på FluorChem E Chemiluminescent Western Blot Imaging System (Cell biovitenskap, Santa Clara, CA, USA).
Luciferase reporter analysen
pmiR-RAPPORT
TM vektorer (RiboBio, Guangzhou, Kina) ble konstruert med villtype (WT) eller mutant (MUT) 3′-UTR av BCL-w og survivin, og alle sekvensene var innsatt mellom hRluc og hLuc genet. HEK293T-celler (1 x 10
4 celler /brønn) ble sådd ut i 96-brønners plater og ko-transfektert med MIR-203 /negativ kontroll miRNA og WT-Survivin 3′-UTR vektor /Mut- Survivin 3′-UTR vektor eller WT-BCL-w 3′-UTR vektor /Mut- BCL-w 3′-UTR vektor bruker Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Førti-åtte timer etter transfeksjon ble cellene samlet og analysert ved hjelp av Dual-Luciferase Assay System (Promega, Madison, WI, USA). Hver analyse ble utført i tre eksemplarer.
Statistical Analysis
Mir-203 uttrykk i vevsprøver ble bestemt som ikke-normalfordelingen ved hjelp av Kolmogorov-Smirnov test. Dermed ble Mann-Whitney U test eller Kruskal-Wallis test som brukes til å vurdere betydningen av MIR-203 forskjeller mellom gruppene. Mottaker opererer karakteristikk (ROC) kurve ble utført for å evaluere diskriminering makt MIR-203 for kresne kommet pasienter fra de uten progresjon, og den optimale verdien cutoff ble fastsatt på basis Youden indeks (følsomhet + spesifisitet-1) [16]. Overlevelseskurver ble konstruert av Kaplan-Meier-metoden, og sammenlignet med log-rank test. Cox modellen ble benyttet for identifikasjon av uavhengige faktorer av PFS og OS. Student t-test ble utført for å bestemme betydningen av data i levedyktighet assay, apoptose-analyse og luciferase reporter-analyse. Forholdet mellom MIR-203 og target genekspresjon ble utforsket av Spearman korrelasjon. Alle statistiske analyser ble utført ved hjelp av SPSS statistikk 17.0 for Windows (IBM Corporation, Armonk, NY, USA).
Resultater
Pasient egenskaper
Median alder for de 108 f.Kr. pasienter som får cisplatin-basert adjuvant kjemoterapi var 62 (spredning 42-81) år, og median oppfølgingsperiode var 51,5 (range 6-65) måneder. Under oppfølging, 45 pasienter viste progresjon, hvorav 32 tilfeller hadde lokoregionalt tilbakefall, 11 tilfeller viste fjernmetastaser, og 39 til slutt døde med BC. De detalj baseline karakteristika for pasienter ble vist i Tabell 1.
Redusert Mir-203 uttrykk var assosiert med sykdomsprogresjon
Mir-203 nivåene ble betydelig redusert i progresjon sammenlignet med gruppen ikke-progresjon gruppe (
P
0,001; figur 1A og S1-fil). ROC-kurver analyserer illustrert MIR-203 ga et areal under ROC-kurven (AUC) verdi av 0,839 (95% CI, 0,756 til 0,903) å skille pasienter med progresjon fra de uten progresjon, som var mer nøyaktig enn å gjette (
P
0,001; figur 1B). Men ingen signifikante sammenhenger ble funnet mellom MIR-203 nivåer og alder, kjønn, klasse, T scenen, lymfeknutestatus, og kjemoterapiregimer (alle på
P
0,05; tabell 2).
(A) MIR-203-nivåer ble påvist ved RT-qPCR fremgangsmåte og normalisert mot U6 RNA i 108 tilfeller av blærekreft vev. Nivåer av MIR-203 i progresjon gruppen var signifikant lavere enn i ikke-progresjon gruppe (
P
0,001, Mann-Whitney U-test). (B) ROC kurven stående pasienter med progresjon fra dem uten progresjon ved hjelp av MIR-203, med et areal under ROC-kurven verdi av 0,839 (95% CI, 0,756 til 0,903). (C, D) Kaplan-Meier PFS og OS kurver basert på Mir-203 uttrykk for blærekreftpasienter. Den optimale avskåret verdi (0,345) beregnet ved ROC-analyse ble brukt for å klassifisere pasienter som høye og lave MIR-203 uttrykk grupper. Lav uttrykk for MIR-203 var signifikant korrelert med forkortet PFS eller OS. (Begge
P
0,001, log-rank test)
MIR-203 spådde prognose i BC pasienter etter kjemoterapi
Basert på den optimale avskåret verdi (0,345) beregnes ved ROC-analyse for BC progresjon etter kjemoterapi, 79 pasienter med MIR-203 nivåene var over 0.345 ble klassifisert som høy Mir-203 uttrykk gruppe , de resterende 29 sakene ble klassifisert som lav Mir-203 uttrykk gruppe. Kaplan-Meier overlevelseskurve viste lav uttrykk for MIR-203 var signifikant korrelert med forkortet PFS og OS (Begge på
P
0,001; figur 1C og 1D).
Univariat Cox regresjonsanalyser viste signifikante assosiasjoner mellom MIR-203, T scenen, lymfeknutestatus og PFS (alle på
P
0,05, tabell 3), samt MIR-203, T scenen og OS (alle på
P
0,05, tabell 3). Ved å sette ovenfor betydelige faktorer i multivariat Cox modell, MIR-203, T scenen, og lymfeknutestatus viste uavhengig prognostisk verdi for PFS (alle på
P
0,05, tabell 3), og MIR-203, T stadium viste uavhengig prognostisk verdi for OS (alle på
P
0,05, tabell 3).
Overuttrykte MIR-203 forbedret cisplatin overfølsomhet hos BC celler
for å utforske effekten av MIR-203 på cisplatin kjemosensitivitet i BC celler, konsentrasjonsavhengig kurver for 5637 og T24 BC cellelinjer transfektert med Mir-203 etterligner og negativ kontroll ble plottet. Som vist i figur 2A, 24 timer etter transfeksjon, Mir-203 uttrykk nivåer i 5637 og T24 celler transfektert med Mir-203 etterligner var 5297 og 8089 ganger høyere enn de transfektert med negativ kontroll (
P
0,001). Celle viabilities av MIR-203-overekspresjon 5637 og T24 celler ble dramatisk redusert sammenlignet med celler transfektert med negativ kontroll i en konsentrasjon gradient av 5, 10, 15, 20, 25 og 30 um for 24 timer (alle på
P
0.05, fig 2B og 2C). Den halve maksimale inhiberende konsentrasjon (IC50) verdier av cisplatin til 5637 og T24 celler ble 11,1 (95% IC 9/7 til 12/5) pM og 14,3 (95% IC 12,7 til 16,1) pM, respektivt. Overekspresjon av MIR-203 sank signifikant IC50 verdier til 8,3 (95% IC 06.09 til 09.06) um og 9,0 (95% IC 07.06 til 10.04) mikrometer, henholdsvis. I tillegg ble effekten av MIR-203 på gemcitabin og cisplatin kombinasjon vist i S2 File.
(A) Mir-203 uttrykk nivåer i 5637 og T24 celler transfektert med Mir-203 etterligner /negativ kontroll. MIR-203 nivåer ble signifikant økt i celler transfektert med MIR-203 etterligner sammenlignet med celler transfektert med negativ kontroll (*
P
0,001, t test, n = 6). (B, C) konsentrasjonsavhengig kurver for 5637 og T24 cellelinjer transfektert med MIR-203 etterligner og negativ kontroll ved 24h. Celle viabilities av MIR-203-overekspresjon celler ble dramatisk redusert sammenlignet med negative kontrollceller på 5, 10, 15, 20, 25 og 30 um cisplatin (alle på
P
0,05, t-test). (D) Strømningscytometri-analyse av apoptose via dobbel farging av celler med Annexin V-FITC og propidiumjodid (PI). (E) Kvantifisering analyse av apoptose er vist i fig 2B. Overekspresjon av MIR-203 signifikant utvidet apoptose i 5637 og T24 cellelinjer (*
P
0,01, t-test, n = 6). (F) TUNEL-analysen indikerte 5637 og T24 cellelinjer transfektert med MIR-203 etterligner viste forhøyede nivåer av DNA-spaltning, sammenlignet med normal kontroll (40 x). Cellene ble farget med DAPI og utsatt for TUNEL analyse for å påvise DNA og apoptotiske celler.
Da vi utførte en flowcytometri analyse for å kvantifisere apoptose via dobbel farging av celler med annexin V FITC og propidiumjodid ( PI). Resultatene viste overekspresjon av MIR-203 betydelig utvidet apoptose i begge BC cellelinjer (både på
P
0,05; Fig 2D og 2E). For å verifisere at økningen i apoptose var på grunn av aktivering av den ovenfor nevnte apoptose vei, målte vi DNA-fragmentering ved TUNEL-analyse og bekreftet at celler transfektert med MIR-203 viste forhøyede nivåer av DNA-spaltning (figur 2F).
BCL-w og survivin var direkte nedstrøms mål for Mir-203
BCL-w og survivin ble spådd som potensielle direkte mål for Mir-203 med to store mål prediksjon programmer, TargetScan 5.1 (http: //www.targetscan.org/) og Miranda (https://www.microrna.org/). Videre BCL-w og Survivin spilt viktige roller i BC utvikling, og deres downregulation var assosiert med økt følsomhet for cisplatin-indusert apoptose [17-20]. De predikerte MIR-203 rettet mot områder i 3’UTR regioner av BCL-w (også kjent som BCL2L2) og Survivin (også kjent som BIRC5) ble vist i figur 3A. En dobbel-reporter luciferase assay ble ansatt for å bekrefte om 3’UTR av BCL-w og Survivin mRNA hadde måls for MIR-203. Vi konstruerte et luciferase reporter vektor som koder for villtype-3′-UTR-sekvens av Bcl-w mRNA eller Survivin mRNA, inklusive de anslåtte MIR-203 målområder, og en tilsvarende mutant reporter vektor. Som vist i figur 3B, MIR-203 signifikant hemmet luminescens intensiteten av WT-Bcl-w 3′-UTR-vektoren og WT-Survivin 3′-UTR-vektor (både
P
0,01), mens mutasjon av bindingssetet blokkert reduksjon av luciferase aktivitet, noe som indikerer det var en direkte interaksjon mellom MIR-203 og 3’UTR av BCL-w mRNA eller survivin mRNA.
(A) Illustrasjon av den anslåtte MIR-203 rettet mot områder i 3’UTR regioner av BCL-w og survivin. (B) To-luciferase aktivitetsanalyse ble utført i HEK293T celler ko-transfektert med kontroll /MIR-203 og pmiR-RAPPORT vektorer med vill-type /mutant 3′-UTR av Bcl-w (ovenfor) og Survivin (nedenfor). *
P
0,01, t test, n = 6. (C) Western blot viser nedregulering av BCL-w og Survivin proteiner etter transfeksjon av Mir-203 etterligner i 5637 og T24 cellelinjer. β-aktin ble benyttet som en kontroll. (D) RT-qPCR viser nedregulering av BCL-w og Survivin mRNA etter transfeksjon av Mir-203 etterligner i 5637 og T24 cellelinjer. *
P
0,01, t test, n = 6. (E) Spearmans korrelasjonsanalyse viser en signifikant invers sammenheng mellom MIR-203 og BCL-w mRNA eller Survivin mRNA uttrykk i blæren kreft vev (r = -0,781, -0,740, både på
P
. 0,001)
For ytterligere å bekrefte deres forhold i BC, transfektert vi 5637 og T24 cellelinjer med Mir-203 etterligner eller negativ kontroll, og analyserte mRNA og protein uttrykk av Bcl-w eller survivin ved RT-qPCR og vestlige-blotting analyser. Resultatene viste at endogene uttrykk for Bcl-w og Survivin ble signifikant redusert i både mRNA og proteinnivåene for MIR-203 transfekterte celler BC (fig 3C og 3D). I samsvar med dette, det var også en signifikant invers sammenheng mellom MIR-203 og BCL-w eller Survivin mRNA uttrykk i BC vev (r = -0,781, -0,740, både på
P
0,001; figur 3E ). Til sammen kan MIR-203 utøve sin funksjon ved direkte rettet mot BCL-w og Survivin genet i BC.
Diskusjoner
Postoperativ cisplatin-basert kjemoterapi har vært mye brukt for muskel invasiv eller metastatisk BC resulterer en respons i opptil 70% av pasientene [21]. Dessverre grunnet chemoresistance av kreftceller, responsen er ikke opprettholdes i mer enn 50% av tilfellene, noe som resulterer i et 5 års overlevelse på 15% [22, 23]. Derfor er det viktig å bedre forstå de faktorer som bestemmer kjemoterapi respons og prognose. Nordentoft et al [24] har funnet 15 mirnas i respons til cisplatin behandling, og 5 mirnas assosiert med overlevelse, hvorav 3 mirnas (MIR-886-3p, MIR-923, MIR-944) ble vurdert som predikator for både cisplatin respons og prognose. Tidligere studier har dokumentert redusert uttrykk av MIR-203 var assosiert med tumorprogresjon og dårlig prognose i enkelte kreftformer, som menneskelig hode og hals plateepitelkarsinom [25], hjernesvulst [26], og esophageal adenokarsinom [27]. I samsvar med funnene som er beskrevet ovenfor, denne studien kvantifisert MIR-203 nivåer i en kohort av BC pasienter behandlet med radikal cystektomi og cisplatin-basert adjuvant kjemoterapi, og fant MIR-203 ble betydelig redusert hos pasienter med progressiv sykdom, samtidig som det ikke er knyttet til andre clinicopathological egenskaper. Videre ROC analyse viste MIR-203 hadde noen diagnostisk makt i diskriminerende pasienter med eller uten progresjon. Basert på den optimale grenseverdi på MIR-203, klassifisert vi alle pasienter i høy og lav Mir-203 uttrykk grupper. Kaplan-Meier analyse viste lav Mir-203 uttrykk gruppe hadde dårlige PFS og OS. Multivariat Cox regresjonsanalyse viste at MIR-203 var en uavhengig prognostisk faktor for BC pasienter. Således mi-203 kan anvendes for prognose forutsigelse av BC pasienter behandlet med cisplatin-adjuvant kjemoterapi.
Cellular resistens overfor cisplatin oppviser ofte en multifaktoriell art, herunder svekket intracellulært medikamentopptak, økt DNA-skade reparasjon, og redusert utførelse av den apoptotiske programmet [28]. Drayton et al [29] fant MIR-27a bidratt til cisplatin motstand gjennom regulering av intracellulære glutation. Vinall et al [30] viste samtidig behandling med MIR-34a og cisplatin resulterte i en dramatisk inhibering i proliferasjon av kreftceller i forhold til behandling med cisplatin alene. Omvendt, induserer cisplatin demetylering av Mir-34a promoter og øker MIR-34a uttrykk, videre sensibiliserende BC celler til cisplatin [31]. I denne studien fant vi at transfeksjon av BC celler med Mir-203 etterligner sensibiliserte celler til cytotoksiske aktiviteten av cisplatin. I mellomtiden data fra apoptose-analysene viste ved tilsetning av 5 uM cisplatin, ble mer apoptose funnet i MIR-203-overekspresjon blærekreftceller, tyder på at inhibering av BC-celler levedyktighet kan være relatert i det minste delvis, til den forbedrede følsomhet overfor cisplatin-indusert apoptose. Dermed kan det hende at kombinasjonsbehandling av Mir-203 etterligner og cisplatin forbedre BC pasientens behandlingsresultatene.
For å få en videre forståelse av rollen til MIR-203 i BC utvikling, dens potensielle nedstrøms mål ble analysert. Som medlem av BCL-2-familien, kan BCL-w fremme celle overlevelse ved å hemme indre vei av apoptose [32]. Chen et al [33] funnet Bcl-w er over-uttrykt i BC-prøver i forhold til tilstøtende normale vev, noe som antyder den spilte en viktig rolle i kreftutvikling av BC. Survivin, som var et viktig medlem av inhibitoren av apoptose protein (IAP) familie [34], utført sin funksjon ved å blokkere antiapoptotic caspaser aktivitet i et kompleks med X-bundet hemmer av apoptose protein (XIAP) [35]. En multisenter studie fant Survivin uttrykk var assosiert med en forhøyet risiko for BC tilbakefall og kreftspesifikk dødelighet [36]. Våre data viser at MIR-203 kan direkte binde 3′-UTR av både BCL-w og Survivin, noe som resulterer i nedregulert uttrykk for BCL-w og Survivin på post-transkripsjonsnivået. Disse ble støttet av kliniske data der vi fant Mir-203 uttrykk var og negativt korrelert med BCL-w og survivin mRNA uttrykk i BC vevsprøver. Således kunne MIR-203 betraktes som en potensiell terapeutisk middel ved samtidig hemming av antiapoptotic faktorer Bcl-W og Survivin.
Som konklusjon, viser vår studie som ble redusert MIR-203 kan brukes som en prediktor for progresjon og prognose for BC pasienter behandlet med cisplatin kjemoterapi. Videre kan overekspresjon av MIR-203 forbedre cisplatin allergi ved å fremme apoptose via direkte rettet mot BCL-w og Survivin. Ekstra multisenter studier er nødvendig for å bekrefte om MIR-203 kan være nyttig som en indikator på kjemosensitivitet til cisplatin-basert kjemoterapiregimer samt et terapeutisk mål for BC i klinikken.
Hjelpemiddel Informasjon
S1 File . Mir-203 uttrykk nivåer av NMIBC pasienter, Progresjon gruppe med 45 saker og ikke-progresjon gruppe med 67 tilfeller
doi:. 10,1371 /journal.pone.0143441.s001 plakater (XLSX)
S2 fil. Virkningene av MIR-203 på gemcitabin og cisplatin kombinasjon
doi:. 10,1371 /journal.pone.0143441.s002 plakater (docx)
