Abstract
bakgrunn
Formålet med denne studien var å demonstrere anti-hudkreft og Kjemopreventivt potensialet av 1,1-bis (3′-indolyl) -1- (p-klorfenyl) metan (DIM-D) ved hjelp en in vitro-modell.
Methods
in vitro celle-cytotoksisitet og levedyktighet analyser ble utført i A431 humane epidermoid-karsinom-cellelinje og normale humane epidermale keratinocytter (NHEK) henholdsvis ved krystallfiolett farging. Apoptoseinduksjon i A431-celler (DIM-D behandlet) og NHEK celler forbehandlet med DIM-D (to timer) før UVB stråling, ble vurdert. Oppbyggingen av reaktive oksygenforbindelser (ROS) i DIM-D forbehandlet NHEK celler (2 t) før UVB eksponering ble også bestemt. Immunocytokjemi og western blot analyse ble utført for å bestemme spaltede caspase 3, og DNA-skade markører i DIM-D behandlet A431 celler og i DIM-D forbehandlet NHEK celler før UVB stråling.
Resultater
IC50-verdiene til DIM-D var 68,7 ± 7,3, 48,3 ± 10,1 og 11,5 ± 3,1 uM mens for Epigallocatechin gallat (EGCG) var 419,1 ± 8,3, henholdsvis 186,1 ± 5,2 og 56,7 ± 3,1 uM til 24, 48 og 72 timers behandling. DIM-D oppviste en signifikant (p 0,05) høyere induksjon av DNA-fragmentering i A431-celler i forhold til EGCG med prosent celledød av 38,9. I tillegg DIM-D indusert høyere uttrykk i A431 celler sammenlignet med EGCG av kløyvde caspase 3 (3,0-fold vs 2,4-fold endringer), Nurr1 (2,7-fold vs 1,7-fold endringer) og NFkB (1,3 ganger vs . 1,1-fold endringer). DIM-D viste også chemopreventive aktivitet i UVB-bestrålt NHEK celler ved signifikant (p 0,05) reduksjon UVB-indusert ROS dannelse og apoptose i forhold til EGCG. I tillegg DIM-D indusert uttrykk for Nurr1 men redusert uttrykk for 8-OHdG betydelig i UVB-bestrålte NHEK celler sammenlignet med EGCG og UV bare.
Konklusjon
Våre resultater tyder på at DIM-D oppviser Nurr1-avhengig transaktivering i induksjon av apoptose i A431-celler, og den beskytter NHEK-celler mot UVB-indusert ROS dannelse og DNA-skade
relasjon:. Boakye CHA, Doddapaneni R, Shah PP, Patel AR, Godugu C Safe S, et al. (2013) Kjemoprevensjon av hudkreft med 1,1-Bis (3′-indolyl) -1- (Aromatisk) Metan Analog gjennom Induksjon av Orphan Nuclear Receptor, NR4A2 (Nurr1). PLoS ONE åtte (8): e69519. doi: 10,1371 /journal.pone.0069519
Redaktør: Rajvir Dahiya, UCSF /VA Medical Center, USA
mottatt: 8. mai 2013, Godkjent: 11 juni 2013; Publisert: 07.08.2013
Copyright: © 2013 Boakye et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av National Center på minoritetshelse og helseforskjeller tilskuddet P20 MD 006738-01 og SC-en bevilgning 5SC1CA161676-03 fra National Institutes of Health. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Hudkreft forekomsten har vært økende, og over 2 millioner nye tilfeller diagnostisert hvert år i USA [1]. Det har blitt anslått at én av fem kaukasiske amerikanere vil utvikle hudkreft minst en gang i løpet av hans /hennes levetid [2]. Melanom er den mest alvorlige formen for hudkreft, og står for 5% av alle tilfeller hudkreft i Amerika, er ansvarlig for de fleste hud kreft dødsfall [3], [4], med en effekt anslått til $ 2360000000 i 2010 [5]. Den økende forekomsten av hudkreft er ventet å fortsette som befolkningen eldes, større mengder UV-stråling nå overflaten av jorden på grunn av nedbryting av ozonlaget, og kontinuerlig bruk av solredskaper [6], [7], [ ,,,0],8].
studier har vist at vedvarende eksponering for sollys er en viktig risikofaktor for utvikling av både nonmelanoma hudkreft (NMSC) og føflekkreft på grunn av skadelige effekter av UVB-stråling som bryter epidermal laget av huden [ ,,,0],9], [10]. Initiering og progresjon av huden kreftutvikling innebærer en kompleks kaskade av cellulære og molekylære hendelser som følger av den første produksjonen av reaktive oksygenforbindelser (ROS) av UVB-stråling [11], [12], [13] og resultater i keratinocyte DNA skader og mutasjon inkludert dannelsen av cyklobutan pyrimidin dimer (CPD). Studier har vist at det er også vesentlig skade påført huden lipider og proteiner ved UVB-eksponering [14], [15].
Mange fytokjemikalier og syntetiske analoger har evnen til å reversere og /eller redusere angrep og progresjon av hud kreftutvikling og angiogenese [16], [17]. Disse fytokjemikalier er primært polyfenoler, som inkluderer, men er ikke begrenset til silymarin, epigallocatechin 3-gallate (EGCG), curcumin, myricetin, quercetin og hesperitin. EGCG er et rikt polyphenol finnes i grønn te ekstrakt og er en potent antioksidant flavonoid som har chemopreventive potensial [18]. EGCG kan indusere cellesyklus og apoptose i hepatomceller ved å indusere p53 og Fas /Fasl apoptotiske sti henholdsvis [19]. Cytotoksisiteten av EGCG in vitro krever relativt høye konsentrasjoner [20] som ikke lett oppnås i serum og både orale og topiske formuleringer av EGCG oppviser minimal beskyttelse mot lyselding og UV-induserte inflammatoriske responser i huden [21], [22] [23].
3,3′-Diindolylmethane (DIM) (fig. S1) er et naturlig produkt avledet fra indol-3-carbinol (i3c) som er til stede i cruciferous grønnsaker som rosenkål, brokkoli og blomkål. DIM har vakt stor interesse i forskning kreft på grunn av sin lave toksisitet og cytotoksiske effekter på kreftceller in vitro, og inhibering av tumorvekst in vivo [24]. For eksempel, DIM indusert ekspresjon av cellesyklus-hemmere som p21 og p27 og downregulated-cyclin proteiner inkludert cyclin D1 og også redusert uttrykk for overlevelse og antiapoptotic proteiner inkludert survivin, BCL-2, Bax og induserte poly (ADP-Ribose) polymerase ( PARP) cleavage, mitokondrie cytokrom c utgivelsen og procaspase cleavage [25], [26], [27]. En serie av nye syntetiske 1,1-bis (3′-indolyl) -1- (p-substituert fenyl) metan-analoger (C-dimmer), er også potente anticancermidler [25], [28], [29] og deres aktiviteter er struktur-avhengig. P-t-butylfenyl og p-bifenyl-derivater aktivere peroksisom proliferator-aktivert reseptor γ (PPARy), mens de usubstituerte p-fenyl og p-metoksyfenyl-analoger aktivere orphan-reseptoren NR4A1 (Nurr77 /TR3) [30]. Studier i vårt laboratorium har rapportert en synergistisk effekt mellom 1,1-bis (3′-indolyl) -1- (p-bifenyler) metan (DIM-C-pPhC6H5) og docetaxel i ikke-småcellet lungekreft celler gjennom forbedret induksjon av spaltet PARP, Bax og N-cadherin og hemming av fosfor-Akt, cyclin D1, survivin, NF-kB, Mcl-en og fosfor JNK2 [29], [31].
Et medlem av nerve vekstfaktor IB Nurr1 (NR4A2) er en annen NR4A-reseptoren, som har vært implisert i forskjellige hormonelle, fysiologiske og patofysiologiske prosesser, inkludert kardiovaskulær, nevrologiske og metabolske sykdommer, inflammasjon og onkogenese. Nurr1 spiller en rolle i hjernefunksjonen og følgelig har vært knyttet til Alzheimers sykdom, schizofreni og Parkinsons sykdom [32]. Nurr1 er sterkt uttrykt i Panc1 og Pan28 bukspyttkjertelen og noen menneskelige blærekreftcellelinjer [28], [33]. I denne studien vi illustrere betydningen av Nurr1 i Kjemopreventivt potensialet av 1,1-bis (3′-indolyl) -1- (p-klorfenyl metan) (DIM-D) i hudkreft ved hjelp av en in vitro UVB indusert hud kreft modell. DIM-D har vist seg å indusere Nurr1 avhengig trans og resultatene av vår studie antyder en mulig rolle for DIM-D /Nurr1 i chemoprevention for hudkreft.
Materialer og metoder
1. Materialer
p-substituerte C-DIM-analoger (DIM-C-pPhCl, DIM-D), (DIM-C-pPhCN, DIM-B) og (DIM-C-pPhBr, DIM-C) var syntetisert som beskrevet [36]. EGCG ble kjøpt fra Selleck Chemicals (Houston, Texas, USA). A431 human epidermoid carcinoma cellelinje og normal human epidermal keratinocytter (NHEK) ble kjøpt fra Invitrogen (Grand Island, NY, USA). Fosfatbufret saltvann (PBS) ble innkjøpt fra Invitrogen. Den NR4A2 (Nurr 1) antistoff ble oppnådd fra Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA). Antistoffene rettet mot 8-hydroksy deguanosine (8-OHdG), CCAAT /-enhancer- bindende protein homologt protein (CHOP), nukleær faktor kappa-lettkjede-enhancer av aktiverte B-celler (NF-kB) og spaltet caspase 3 var også innhentet fra Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, California).
2. Cellelinjer og cellekulturer
A431-celler ble opprettholdt i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM; Sigma Aldrich, St Louis, MO) næringsstoff blanding supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS) fra Invitrogen (Grand Island, NY ) og antibiotika-antimykotisk blanding omfattende penicillin (5000 U /ml), streptomycin (0,1 mg /ml), og neomycin (ved 37 ° C 0,2 mg /ml) fra Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) i nærvær av 5% CO
2 og 95% relativ fuktighet. NHEK-celler ble opprettholdt i Epilife medium (Invitrogen, Grand Island, NY, USA) og ble opprettholdt ved enten epidermal vekst supplement (EDGS) eller human keratinocytt-vekstsupplement (HKGS) fra Invitrogen (Grand Island, NY) og antibiotika-antimykotisk blanding omfattende penicillin (5000 U /ml), streptomycin (0,1 mg /ml), og neomycin (0,2 mg /ml) fra Sigma Aldrich (St. Louis, MO) ved 37 ° C. Begge cellelinjer ble dyrket sub når ca. 80-90% konfluens med 0,25% trypsin-EDTA (Invitrogen, Grand Island, NY). ble dyrket cellene på 1,12 cm
2 0,4 mikrometer pore polykarbonat membran innstikk i 12 mm × 12-Transwell permeable bæreplater (Corning, New York).
3.
In vitro
celle-cytotoksisitet og levedyktighet Assays
celle cytotoksisitet og celleviabilitet analyser ble utført i A431 og NHEK celler henholdsvis ved hjelp av konvensjonelle krystallfiolett farging assay. De A431 og NHEK celler ble begge sådd i 96-brønners plater (10
4 celler /brønn) og inkubert over natten i 5% CO
2 ved 37 ° C. De A431-celler ble behandlet med oppløsningsmidlet kontroll (DMSO) og forskjellige konsentrasjoner av DIM-B, DIM-C og DIM-D og EGCG, mens NHEK-celler ble eksponert for UVB-stråling (150 J /m
2) 2 timers etter behandling og deretter inkubert i 24 timer i vekstmedier. De A431-celler i legemiddel og mediumblanding ble inkubert i 24, 48 og 72 timer. De levedyktige celler ble fiksert med glutaraldehyd og farget med krystallfiolett i 15 min ved romtemperatur. Den krystallfiolett ble vasket; residuet oppløst med natriumhydrogenfosfat og absorbansen ble målt med et spektrofotometer ved bølgelengde på 462 nm. Levedyktighet av NHEK celler behandlet med C-dempes eller EGCG ble uttrykt som prosentandeler av absorbansen til kontrollcellene, noe som ble ansett som 100% levedyktige og IC50-verdier ble bestemt ved den følgende formel, [(50- lavest kill) /(høyest kill – laveste kill) * (høyeste kons -. laveste kons)] + laveste kons
4… TUNEL-analysen
A431-celler ble behandlet med 34,4 uM DIM-D (50 prosent av IC50-verdien), og inkubert i 24 timer. Cellene ble deretter vasket med PBS-buffer og fiksert i 10% formaldehyd på mikroskopiske sider. Den ApoTag Red
In Situ
apoptose deteksjon Kit® (Millipore, Billerica, MA) ble brukt for påvisning av apoptose i samsvar med produsentens protokoll. Kort sagt ble de fikserte cellene inkuberes i 20 mikrogram /ml proteinase K-løsning i 15 minutter ved romtemperatur, etterfulgt av inkubasjon med ekvilibreringsbuffer i 10 sek. Cellene ble vasket i PBS og inkubert med TdT-enzym ved 37 ° C i 1 time i et fuktet kammer for inkorporering av konjugerte nukleotider i 3′-OH-endene av DNA. De fikserte cellene ble vasket i PBS og inkubert med anti-digoksigenin-konjugat (Rhodamin antistoff) oppløsning og motfarget med DAPI. De mikroskopiske bilder av de faste celler på lysbildene ble visualisert med et Olympus BX40 lysmikroskop utstyrt med en datastyrt digitalt kamera (DP71, Olympus Center Valley, PA, USA). DNA-fragmentering ble indikert ved rhodamin positiv farging (rød). Ubehandlede celler ble holdt som kontroll.
5. Acridinoransje /etidiumbromidfarging
Morfologiske endringer i NHEK cellekjerner etter eksponering for UVB-stråling var fast bestemt på å vurdere den beskyttende effekten av DIM-D og EGCG i de utsatte cellene. Celler ble sådd i 96-brønns plate (10
4 celler /brønn) og behandlet i 2 timer med forskjellige konsentrasjoner av oppløsninger av DIM-D og EGCG i DMSO før UVB-strålingseksponering ved dose på 150 mJ i 30 sek. Cellene ble deretter inkubert i vekstmedium i 24 timer og farging ble utført med akridinorange /etidiumbromid (AO /EB) som beskrevet [34] og analysert ved fluorescens mikroskopi. I korte trekk ble den differensielle opptak av de to fargestoffer som brukes til å fastslå celler levedyktighet. Etter inkubasjon i 24 timer ble cellene vasket med PBS (2X) og farget med en blanding av akridinoransje og etidiumbromid.
6. Fastsettelse av intracellulære reaktive oksygenforbindelser (ROS)
Den fluorescerende fargestoff, 2 «, ble 7»-dichlorofluorescein diacetat (DCF-DA) som brukes for å vurdere opphopning av ROS i NHEK celler etter UVB eksponering. Celler ble sådd i en 24-brønns plate ved en densitet på 0,05 x 10
6 celler /brønn, ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av DIM-D og EGCG i DMSO i 2 timer, suges en tynn film av PBS ble tilsatt, og cellene ble deretter eksponert for UVB-stråledose på 150 mJ i 30 sek. Cellene ble deretter inkubert i 24 timer i vekstmedier bare. DCF-DA-løsning (10 uM) ble tilsatt til de celler (0,05 x 10
6 /ml), og blandingen ble inkubert ved 37 ° C i 1 time i mørke. Celler ble vasket med PBS (2X) og fluorescensintensiteten av cellene ble bestemt ved fluorescens mikroskopi.
7. Immunocytokjemisk analyse
Både A431 og NHEK celler ble behandlet med DIM-D og EGCG (34,4 mikrometer og 210,0 mikrometer henholdsvis) og inkubert i 24 timer. Celler ble deretter fiksert i 10% formaldehyd og cytospun inn i mikroskopiske objektglass. Analysen ble utført etter protokollen spesifisert i SignalStain
TM IHC kit (Cell Signaling, Beverly, MA). Fikserte celler ble hydratisert med varierende konsentrasjoner av alkohol og PBS (3 x), inkubert med primære antistoffer mot spaltes kaspase 3, Nurr1 og 8-OHdG over natten ved 4 ° C og detektert av HRP-konjugert sekundært antistoff. Cellene ble farget med Nova Red flekken og kontra med hematoksylin. Mikroskopisk analyse av de faste celler ble utført med et Olympus BX40 lysmikroskop utstyrt med datastyrt digitalt kamera (DP71, Olympus Center Valley, PA, USA).
8. Western blot-analyse
Proteinene ble samlet inn fra begge A431 og NHEK-celler som beskrevet [33]. I korthet, etter 24 timers behandling med DIM-D (17,2 pM) og EGCG (104,8 mm), ble cellene behandlet med RIPA-buffer (50 nM Tris-HCl, pH 8,0, med 150 mM natriumklorid, 1,0% Igepal CA-630 ( NP-40), 0,5% natrium-deoxychlorate, og 0,1% natriumdodecylsulfat) med protease inhibitor (500 mM fenylmetylsulfonylfluorid). Proteinkonsentrasjoner ble bestemt i henhold til BCA-proteinanalyse-reagens-protokollen (Pierce, Rockford, IL) og standard plottet ble generert ved bruk av bovint serumalbumin, 50 ug supernatant protein fra kontrollgruppen og alle de forskjellige behandlings Prøvene ble denaturert ved koking i 100 ° C i 5 minutter i SDS-prøvebuffer, og ble deretter underkastet elektroforese på 10% SDS-PAGE-gel, overført til nitrocellulosemembraner, blokkert med 5% skummet melk i tris-bufret saltvann med tween 20 (10 mM tris-HCl (pH 7.6 ), 150 mM NaCl og 0,5% Tween), og probet med antistoffer mot Nurr1 (1:400), NFKB (1:500) og spaltet caspase 3 (1:1000) for A431-celler. Proteiner ble påvist med HRP konjugerte sekundære antistoffer ved hjelp SuperSignal West pico kjemiluminescens løsning (Pierce, Rockford, IL). Kvantifisering og analyse av resultatene ble utført med bilde J programvare (v1.33u, NIH, USA). Resultatene ble uttrykt som prosentvise forhold mellom protein uttrykk for p-actin (satt til 100%).
9. Statistisk analyse
Resultatene er uttrykt som gjennomsnitt ± S.D i minst tre replikater og sammenligning mellom flere grupper ble etablert ved en en-veis analyse av varians (ANOVA) og mellom to grupper ved students t test analyse. En p-verdi 0,05 ble betraktet som signifikant
Resultater
1.. Anticancer aktivitet av DIM analoger
1,1 Effekt av DIM analoger på A431 hud kreftceller.
A431 celler ble behandlet med tre forskjellige DIM analoger, som skiller seg strukturelt på p-fenyl stilling (fig. S1). A431-celler ble behandlet med DIM-B for 24, 48 og 72 timer, og IC50-verdier for cytotoksisitet var 56,8 ± 10,7, 30,8 ± 6,6 og 7,2 ± 1,2 uM henholdsvis (figur 1A.). IC50-verdiene for DIM-C etter behandling for 24, 48 og 72 timer var 78,3 ± 16, 50,2 ± 12,2 og 7,2 ± 1,5 mikrometer henholdsvis og tilsvarende IC50 verdier for DIM-D var 68,7 ± 27,3, 48,3 ± 10.1and 11,5 ± 3.1 uM etter behandling for 24, 48 og 72 timer. I motsetning til dette IC50 verdier for EGCG etter behandling for 24, 48 og 72 timer var 419,1 ± 8,3 og 186,1 ± 5,2 og 56,7 ± 3,1 uM henholdsvis (figur 1B.), Som var signifikant høyere enn det som observeres for C-dimmer (tabell 1) . Alle tre DIM derivater viste mer potens enn EGCG med små variasjoner mellom deres potensialer. DIM-D ble imidlertid valgt for videre studier som modell narkotika fordi det utstilt flere fotostabilitet enn DIM-B og DIM-C.
(A) Cytotoksisitet profil (Plot av% celledød vs konsentrasjon av stoffet på A ) 24 hr, B) 48 timer og C) 72 timer der, DIM-B = DIM-C-pPhCN, DIM-C = DIM-C-pPhBr og DIM-D = DIM-C-pPhCl). Data representerer middelverdi ± SD. (B) Cytotoksisitet profil (Plot av% celledød vs konsentrasjon av stoffet) på A) 24 timer, B) 48 timer, C) 72 timer for EGCG i A431 celler.
1,2 apoptotisk aktivitet av DIM-D mot A431-celler.
virkningene av DIM-D på apoptose i A431 celler ble undersøkt ved tunel metoden ved hjelp av flowcytometri. A431-celler ble behandlet med DIM-D (34,4 uM) i 24 timer signifikant celledød (38,9%) sammenlignet med DMSO kontroll (Fig. 2A). Vi undersøkte også effekten av DIM-D og EGCG på DNA fragmentering av A431 celler ved hjelp TUNEL metoden ved mikroskopisk analyse (Fig. 2B). I kontrollceller behandlet med PBS, ble minimal DNA-fragmentering observert mens DIM-D betydelig økt DNA-fragmentering som gjenspeiles av økt rød fluorescens. Tilsvarende EGCG (104,8 mm) økte også DNA-fragmentering, men relativt mindre sammenlignet med DIM-D (Fig. 2B).
(A) Påvisning av apoptotiske celler ved tunel metode med flowcytometrisk analyse. A431 celler ble farget for apoptotiske celler med FITC av Tunel metoden før og etter 24 timers behandling. (I) Dot plott som viser FSC versus SSC profilen til celler etter behandling. (Ii) Dot plott som viser profilen av FITC fluorescens versus FSC for celler etter behandling. De fleste av de TUNEL-fargede apoptotiske celler er litt mindre enn ufargede levende celler. (Iii) histogram som viser cellene før behandling i porten R1. Svært få apoptotiske celler oppdages. (Iv) Histogram som viser celler etter behandling med DIM-D (DIM-C-pPhCl) i porten R1. Apoptotiske celler (lyst farget ved TUNEL) registreres. (B) Påvisning av apoptotiske celler ved TUNEL-metoden ved hjelp av mikroskopisk analyse. A431-celler ble farget for apoptotiske celler med rhodamin ved TUNEL-metoden for 24-timers behandling. Celler ble kontra med Hoechst fargestoff (DAPI).
1,3 Effekt av DIM-D på apoptotiske proteiner og Nurr1.
A431-celler ble behandlet med 34,4 um DIM-D og 104,8 mikrometer EGCG i 24 timer og hele cellelysatene ble analysert ved hjelp av Western blot (fig. 3A). ble observert DIM-D betydelig indusert uttrykk for spaltede (aktivert) caspase-3 og Nurr1 proteiner og lignende resultater for EGCG. Kvantifisering av disse resultatene (Fig. 3B) viste at DIM-D var mer potent at EGCG som induserer spaltet caspase-3 (3,0 fold vs 2,4 ganger) og Nurr1 (2,7 fold vs 1,7 ganger), mens effekter på NFkB (p65) var minimal (1,3 ganger vs 1,1 ganger). Uttrykk for spaltet caspase-3 og Nurr1 ble betydelig indusert av DIM-D og EGCG (p 0,05). DIM-D (34,4 pM) og EGCG (104,8 mm) også indusert CHOP uttrykk som indikert ved farging av A431-celler etter behandling i 24 timer (fig. 3C). Kvantifisering av disse resultatene viste betydelig økning av CHOP positivt fargede celler (79%) i DIM-D behandlede celler sammenlignet med 67% av cellene positivt fargede etter EGCG behandling. Disse resultatene tyder på at anti-kreftfremkallende hud potens av DIM-D er større enn EGCG under identiske betingelser.
(A) Ekspresjon av spaltet kaspase 3, Nurr1 og NFkB i forhold til kontroll β-aktin i Dim -D og EGCG behandlet A431-celler ved western blot. Ubehandlede celler ble holdt som kontroll. (B) Western blot analyse av uttrykket av ulike proteiner økt betydelig i DIM-D behandlede celler. (C) ICC peroksidasefarging av A431 celler behandlet med DIM-D og EGCG, henholdsvis for den pro-apoptotiske proteiner, CHOP. Brune flekker ble ansett positivt resultat. Ubehandlede celler ble holdt som kontroll. Data er beregnet fra tredoble eksperimenter og presentert som gjennomsnitt, og feil barer henvise til SD, * P 0,05, ** P 0,01 sammenlignet med kontroll
2.. Chemopreventive aktivitet av DIM-D på normal human epidermal keratinocyte (NHEK) celler
2,1 cytotoksiske effekten av DIM-D på NHEK celler.
For å undersøke effektene av DIM-D mot normal hudceller, NHEK-celler ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av DIM-D (15-140 uM) i 24 timer, og resultatene indikerte at DIM-D var minimalt toksisk for NHEK-celler (fig. 4A). Ved maksimal konsentrasjon på 140 uM, var prosenten celledød 56,2 ± 1,3, mens på IC50-konsentrasjonen (68,7 ± 7,3 uM) observert i A431-celler, ble NHEK celledød redusert til 48,7 ± 2,1%. Derfor konsentrasjon av DIM-D 68,7 ± 7,3 mikrometer ble ansatt for alle senere undersøkelser. På den annen side, vil eksponering av den forbehandlede NHEK celler overfor UV-stråling, redusert cellelevedyktighet ytterligere. Dette var imidlertid ikke signifikant med økning i prosent celledød til 67,5 ± 2,6 og 65,9 ± 3,1 for 140 mikrometer og 68,7 mikrometer henholdsvis (fig. 4A).
(A) Linjediagram av cytotoksisitet profil (Plot av% celledød vs konsentrasjon av stoffet) av NHEK celler behandlet med DIM-D (DIM-C-pPhCl) ved forskjellige konsentrasjoner med og uten UVB stråling. Data representerer middelverdi ± SD. (B) Produksjon av reaktive oksygenforbindelser (ROS) med DIM-D og EGCG behandling før UVB eksponering. Hver verdi er uttrykt som gjennomsnitt ± standardavvik. (C) hydroksyl radikaler, dvs i et in vitro cellefritt system behandling av DIM-D. Dataene er uttrykt som prosentandel av kontroll, hvor det cellefrie system ikke ble behandlet med DIM-D. (D) apoptose bestemmelse i NHEK celler behandlet med DIM-D (DIM-C-pPhCl) og EGCG ved forskjellige konsentrasjoner.
2,2 Anti-oxidant potensial og apoptotisk aktivitet av DIM-D på NHEK celler .
Den antioksidantaktivitet av DIM-D og beskyttelse mot UV-indusert ROS ble også undersøkt i NHEK celler behandlet med 34,4 mikrometer DIM-D og 209,6 mikrometer EGCG i 24 timer. UVB-indusert ROS-nivåer i NHEK celler forbehandlet med DIM-D ble betydelig redusert i forhold til EGCG; Dette viser at DIM-D har mer potent antioksidant aktivitet enn EGCG (Fig. 4B). I tillegg til evnen til DIM-D nøytralisere hydroksylgrupper (-OH) radikaler i et cellefritt in vitro-system ble anvendt for å bekrefte den forbedrede anti-oxidant potensialet av DIM-D i forhold til EGCG. Resultatene i figur 4C viste at ved konsentrasjoner på 34,4 uM til 280 uM, DIM-D var i stand til å slukke omtrent 30% til 90% av hydroksylradikaler.
Deretter apoptotisk aktivitet ble analysert i NHEK-celler, som ble forbehandlet med EGCG (17,2 mikrometer og 68,7 mm) og DIM-D (8,6 og 34,4 mm) før UVB eksponering. For effektiv sammenligning mellom EGCG og DIM-D med hensyn til beskyttelse mot apoptose, IC50 og en fjerdedel IC50 konsentrasjoner av DIM-D ble ansatt for EGCG forbehandling av cellene, mens halvparten av de respektive konsentrasjoner ble ansatt for DIM-D forbehandling. Den acridinoransje /etidiumbromid dobbel farging ble brukt til apoptotiske analysen fordi acridinoransje fargestoff har evnen til å flekke kjernen av levedyktige celler grønne mens ethidium fargestoff, en interkalerende forbindelse yret apoptotiske eller nekrotiske celler til å vanære sine kjerner oransje. Vi har vist at i celler som ble behandlet med DIM-D, var det en signifikant reduksjon apoptotisk celledød (røde flekker) sammenlignet med celler behandlet med EGCG (fig. 4D). Ingen apoptotisk celledød ble observert i kontrollcellene, som ble behandlet med enten PBS eller bærer bare. DIM-D-behandling forårsaket signifikant reduksjon i induksjon av apoptose av UVB-stråling i NHEK celler. EGCG viste imidlertid minimal beskyttelse av celler mot apoptose. Cellene forbehandlet med EGCG før UVB stråling ble markert farget rød av etidiumbromid. Samlet er disse funnene tyder på at selv om det var nedgang i celle levedyktighet i DIM-D + UV-behandlede celler i forhold til DIM-D bare behandlede celler (som vist i figur 4A.); DIM-D behandling relativt forhindrer induksjon av apoptose av UVB-stråling og dermed forbedrer celleviabilitet mer betydelig enn EGCG.
2,3 Effekt av DIM-D på UVB-indusert-oksidativt stress.
Å videre undersøke om DIM-D hemmer UV-stråling-indusert oksidativt stress og inflammasjon gjennom forbedring av Nurr1 i UV-eksponert hudceller, undersøkte vi uttrykket av Nurr1 og 8-OHdG i NHEK celler (fig. 5). Etter UVB bestråling ble cellene behandlet med DIM-D (34,4 mm) og EGCG (209,6 mm) for 24 timer og dannelsen av 8-OHdG ble bestemt ved farging (Fig. 5A). UVB økt betydelig 8-OHdG men begge DIM-D og EGCG betydelig redusert UVB-indusert respons dermed bekrefter antioksidantaktivitet av begge forbindelser. Deres relative styrke var tydelig av farging. Kun 3,6% av cellene ble positivt farget i DIM-D behandling i forhold til EGCG behandlede celler (20% celler).
(A) immunocytokjemisk peroksidasefarging av Nurr1 og 8-OHdG i NHEK celler behandlet med dim D og EGCG. Tilstedeværelse av brun flekk angitt positiv farging for det primære antistoff. (B) & amp, (C) Western blot-analyse av ekspresjon av Nurr1 i forhold til kontroll β-aktin i Dim-D og EGCG behandlet NHEK celler. Ubehandlede celler ble holdt som kontroll. Data beregnet fra triplikate eksperimenter og presentert som gjennomsnitt ± SD, * P 0,05, ** P 0,01 sammenlignet med kontroll
immunocytokjemisk analyse viste at, det Nurr1 ekspresjonen var vesentlig sterkere i forhold til. EGCG og UV bare (fig. 5A). Kvantifisering av disse resultatene viste at ca. 83% av cellene ble positivt farget for Nurr1 i DIM-D-behandlede celler sammenlignet med EGCG behandlede celler (66%). Resultatene viste tydelig at DIM-D var mer potent at EGCG som induserer Nurr1. Videre disse resultatene ble bekreftet ved western blot-analyse. For dette formål ble NHEK-celler behandlet med DIM-D (34,4 pM) og EGCG (209,6 mm) i 24 timer og hele cellelysater ble analysert (fig. 5B). NHEK celler behandlet med DIM-D viste Nurr1 uttrykk ble økt betydelig mer i DIM-D behandlede celler (1,8 ganger) i forhold til EGCG (1,4 ganger) (Fig. 5C).
Diskusjoner
Dårlig klinisk utfall av dagens behandlingstilbud veier har ført til behovet for utvikling av nye terapeutiske strategier for behandling av hudkreft. Det er et presserende behov for å identifisere molekylære mål å bruke kosttilskudd forbindelser, som har både terapeutisk så vel som chemopreventive aktivitet. Nurr1 er en foreldreløs kjernefysisk reseptor og foreløpige rapporter tyder på en rolle for Nurr1 i leddgikt og kreft gjennom modulering av apoptose. Videre har det også blitt vist at DIM analoger aktiverer foreldreløs atom reseptor Nurr1 og hemmer blærekreft vekst [28]. Men det er ingen rapporter om chemopreventive potensialet i DIM-D aktivert Nurr1 i hudkreft. Derfor, i den første delen av denne studien har vi fokusert på kreft eller terapeutisk aktivitet av DIM-D bruker A431 hud kreftceller. I den andre delen av vår studie undersøkte vi chemopreventive aktiviteten til DIM-D gjennom Nurr1 mediert signale hjelp NHEK.
I første del av studien, vurderte vi den cytotoksiske effekten av DIM-D på A431 hudceller. Det er viktig å påpeke at DIM-D viste cytotoksisk effekt på disse cellene og dens cytotoksiske effekten var større enn EGCG. I likhet med EGCG har tidligere undersøkelser vist at DIM hemmer veksten av kreftceller avledet fra svulster i prostata, bryst, tykktarm, bukspyttkjertel cervix og [34]. Rollen av apoptose ble ytterligere undersøkt ved å bestemme ekspresjon av apoptotisk protein som spaltes caspase-3 i A431-celler. Den vestlige blot analyse viste signifikant økning i ekspresjon av caspase-3 etter DIM-D behandling i A431 celler. Vi har også studert DNA fragmentering i A431 celler etter DIM-D behandling fordi DNA fragmentering er et kjennetegn på apoptose, som forplikter cellene dør. DNA-fragmentering ble sterkt indusert av DIM-D i forhold til EGCG, noe som bekrefter at apoptose er en viktig vei forbundet med anticancer aktivitet av disse forbindelser. Dette ble godt korrelert med vår tidligere studie av forbedring av anticancer aktivitet av en DIM forbindelsen i menneske ikke-småcellet lungekreft celler [29]. Tidligere studier har vist at DIM-D aktiverer endoplasmatiske retikulum stress i bukspyttkjertelen og eggstokkreft celler [35], [36]. DIM-D indusert uttrykk for endoplasmatisk retikulum stresset protein GRP78 gjennom økt uttrykk for CHOP og dette ble ledsaget av hemming av tumorvekst [37]. Tilsvarende våre immunocytokjemiske studier viste at DIM-D økte ekspresjon av CHOP i A431-celler etter behandling i 24 timer. Disse resultatene viser at DIM-D utøver sin anti-kreft effekt gjennom målrettet mot flere molekylære mål knyttet til celleoverlevelse og apoptose.
Overuttrykte Nurr1 reduserer inflammatoriske mediatorer, åtseldyr reseptor uttrykk og senker LDL akkumulering i makrofager [38] , [39]. I vår studie var uttrykk for spaltet caspase-3 økte i A431 celler etter DIM-D behandling.
