Abstract
leverkreft (HCC) er en av de vanligste menneskelige kreftformer. Derfor utvikler de tidlige, høy følsomhet diagnostiske biomarkører for å hindre HCC er stort behov for. Serum a-fetoprotein (AFP), den kliniske biomarkør er i bruk, er forhøyet i bare -60% av pasienter med HCC; derfor er identifisering av ytterligere biomarkører forventes å ha en betydelig innvirkning på folkehelsen. I denne studien brukte vi sukkermicroarray analyse for å undersøke mulighetene diagnostisk verdi av flere kreft forbundet karbohydratantigener (cacas) som biomarkører for HCC. Vi brukte sukkermicroarray analyse med 58 forskjellige sukker analoger for kvantitativ sammenligning av 593 humane serumprøver (293 HCC prøver; 133 kronisk hepatitt B-virus (HBV) infeksjon prøver, 134 kronisk hepatitt C-virus (HCV) infeksjon prøver, og 33 friske donorprøver ) for å utforske den diagnostiske mulighetene for serumantistoff endringer som biomarkører for HCC. Serumkonsentrasjoner av anti-disialosyl galaktosyl globoside (DSGG), anti-fucosyl GM1 og anti-GB2 var signifikant høyere hos pasienter med HCC enn i kronisk HBV-infeksjon individer ikke i pasienter med kronisk HCV-infeksjon hos pasienter. Samlet sett i vår studiepopulasjonen, de biomarkør kandidatene DSGG, fucosyl GM1 og GB2 av cacas oppnådd bedre prediktiv følsomhet enn AFP. Vi identifiserte potensielle biomarkører egnet for tidlig deteksjon av HCC. Glycan microarray analyse gir et kraftig verktøy for høy følsomhet og høy gjennomstrømming påvisning av antistoffer mot cacas, som kan være verdifulle serum biomarkører for tidlig deteksjon av personer med høy risiko for HCC
Citation. Wu CS , Yen CJ, Chou RH, Li ST, Huang WC, Ren CT, et al. (2012) Kreft-assosiert karbohydratantigener som potensielle biomarkører for leverkreft. PLoS ONE syv (7): e39466. doi: 10,1371 /journal.pone.0039466
Redaktør: Erica Villa, Universitetet i Modena Reggio Emilia, Italia
mottatt: 16 februar 2012; Godkjent: 21 mai 2012; Publisert: 13.07.2012
Copyright: © 2012 Wu et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av National Science Council of Taiwan gir NSC99-2320-B-039-030-My3, NSC99-2632-B-039-001-My3, NSC100-2321-B-039-004, og The University of Texas MD Anderson -Kina Medical University og sykehus Sister Institution Fund DMR-101-115. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
leverkreft (HCC) er den femte vanligste kreft hele verden, med Kina og Nord-Amerika viser en kontinuerlig økning i forekomst og dødelighet [1]. HCC nesten alltid utvikler seg i innstillingen av kronisk hepatitt virus infeksjon eller levercirrhose [2] – [4]. Prognosen for pasienter med HCC er fortsatt dårlig, og 5-års overlevelse etter diagnose eller for de fleste pasienter er mindre enn 5%, hovedsakelig fordi sykdommen er ofte diagnostisert i et avansert stadium [5]. For pasienter med diagnosen HCC på et tidlig stadium, kan overlevelsen forbedres betydelig ved kirurgisk fjerning, levertransplantasjon, og andre helbredende terapi som ablativ behandlinger [6], [7]. Videre overvåking av hos risikopasienter som forbedrer påvisningen og potensielt helbredende effekten av behandlinger for små svulster. Derfor tidlige prognostiske markører er avgjørende for effektiv behandling og forebygging av HCC.
Den vanligste HCC biomarkør brukes til å screene pasienter med levercirrhose er serum a-fetoprotein (AFP), som måles ved 6-måneders intervall [8]. Likevel er AFP nivåer ofte forhøyet hos noen pasienter med kronisk leversykdom som ikke har kreft, og AFP nivåer er ikke forhøyet i 30-40% av pasienter med leverkreft [9]. Serumet AFP-testen har lav følsomhet, og omtrent en tredjedel av pasienter med tidlig stadium HCC og små tumorer ( 3 cm) ha den samme grad av AFP som i normale individer, noe som gjør det AFP-test utilstrekkelig for tidlig påvisning av HCC hos risikopopulasjoner [10]. I tillegg har AFP test en høy falsk-positive rate på ~ 20% hos pasienter med kronisk hepatitt og 20-50% blant de med levercirrhose [5], [11]. I denne forbindelse er det et presserende behov for å identifisere mer følsomme og pålitelige serum biomarkører for påvisning av HCC [12], [13].
Oncogenesis er ofte forbundet med endringer i uttrykket av celleoverflate karbohydrater. I noen tilfeller kan karbohydratet mønsteret være spesifikke for den sykdomstypen [14]. I andre tilfeller kan nivåer av anti-karbohydrat-antistoffer bli vesentlig forbedret med utbruddet av sykdommen [15]. Tidligere studier har vist at mobilnettet glykolyseringsmetoder profiler endres vesentlig i løpet kreftutvikling [14]. Karbohydrater spiller viktige roller i ulike biologiske arrangementer som celle anerkjennelse [16], inter- og intracellulær signalering, embryoutvikling, celle adhesjon [17], og celle-celle interaksjoner [18]. Foreløpig sukker markør funn med sukkermicroarray analyse presenterer et stort potensial for å identifisere biomarkører relevante for diagnostisering av brystkreft [19].
Glycan mikromatriser tillate direkte karakterisering av karbohydrat-protein interaksjoner [20]. Microarray teknikker er effektive og følsomme fremgangsmåter for rask analyse av spesifisiteten av protein-karbohydratvekselvirkninger og karakteriseringen av differensieringsprosesser knyttet til utbruddet av kreft på molekylært nivå [21]. I tillegg kan festingen av sukker til overflater effektivt å etterligne fremstilling av disse forbindelser på membranen av celler og dermed kan brukes til å binde antistoffer [20]. I denne rapporten har vi fokusert på glykaner som er kjent for å være kreftfrem assosiert karbohydratantigener (cacas) i mange kreftformer, men som ikke har blitt studert i HCC. Vi brukte sukkermicroarray analyse for å utforske den diagnostiske mulighetene for serumantistoff endringer som biomarkører for HCC. I tillegg sammenlignet vi nøyaktigheten av biomarkører vi identifisert med den konvensjonelle AFP biomarkør for HCC.
Resultater
Pasient Kjennetegn
I alt 593 deltakere inkludert 293 HCC pasienter , 133 kronisk hepatitt B-virus (HBV) infeksjon pasienter, 134 kronisk hepatitt C-virus (HCV) infeksjon pasienter og 33 friske personer ble rekruttert til studien (tabell 1). Det var ingen signifikante forskjeller i alder og kjønn mellom saker og kontroller. I tillegg HCC gruppen og friske kontroller Gruppen hadde statistisk forskjellige laboratorieresultater for albumin, aspartataminotransferase (ASAT), alaninaminotransferase (ALAT) og total bilirubin (BIL-T) (p 0,05). Den patologisk iscenesettelse (AJCC) av HCC var karakteren jeg i 96 tilfeller (41,3%), klasse II i 80 tilfeller (34,5%), klasse III i 48 tilfeller (20,7%), og klasse IV i 8 tilfeller (3,4%).
Påvisning av antistoffer Against karbohydratantigener med Glycan microarray analyse
Vi testet serum fra pasienter med HCC for antistoffer som binder seg til sukker fragmenter. Glassplater som står i mikromatriseformat med sukkerforbindelser 1-58 (figur S1) ble inkubert med serumprøver, og bundne antistoffer ble påvist ved hjelp av Cy3-merket geite anti-humant IgG sekundært antistoff (figur 1). De fluorescerende skanninger ble bearbeidet for å kvantifisere intensiteten av hver enkelt flekk. De resulterende data ble representert som den midlere relativ fluorescens intensitet fra replikater av hver prøve. Vi bemerket at bakgrunnen intensiteten av karbohydrat antigen binding fra friske individer kan være et resultat av ikke-spesifikk binding; Derfor mener fluorescensstyrkene 35 000 ble fjernet fra analysen. Denne fremgangsmåten ga en begrunnelse for utvikling av en glykan microarray for å påvise tilstedeværelse av 47 forskjellige glykan-antistoffer i serum fra pasienter (etter fjerning av prøvenummer 2, 3, 5, 7, 16, 20, 23, 24, 30, 31, og 47).
(A) en representativ lysbilde bildet innhentet fra et fluorescens-scan etter påvisning av IgG i serumprøver. Hver grid ble skrevet ut med sukker tallene 1-20 i den øverste raden, 21-40 i den midterste raden, og 41-58 i den nederste raden. (B) Gjennomsnitt ± standardavvik bindende spesifisitet av antistoffer mot glykan tallene 1-58 i serumprøver fra pasienter med HCC. Relative fluorescensstyrkene ble beregnet for hver spot (som inneholder 100 mikrometer sukker) i sukkermicroarray.
Vi undersøkte serumprøver fra 155 pasienter med HCC og 33 friske individer for antistoffer som er bundet til karbohydrat antigener på glykan microarray. Fluorescens data reflekterende antistoff reaktivitet til hver glykan ble normalisert til GB5 for hver prøve, og de relative fluorescensstyrkene for IgG-antistoffer fra pasienter med HCC og friske individer er presentert som gjennomsnitt glykan: GB5 IgG-forhold (figur 2). Antistoffer som er bundet til GB5 ble påvist hos pasienter med HCC og friske donorer. Vi har observert at nivået av IgG mot glykan tallene 4 (SLacNAc 6SO
3), 15 (disialosyl galaktosyl-globoside; DSGG), 18 (fucosyl GM1), 35 (Gb3), 36 (GB2), 42 (B19) og 56 (Man7) var signifikant høyere hos pasienter med HCC enn i friske individer.
relativ fluorescens-forhold ble beregnet som relativ fluorescens intensitet av hver glykan analoge dividert med den relative fluorescensintensiteten av GB5, og de er uttrykt som prosentandeler i figuren. Figuren viser gjennomsnittsforholdet ± standardavvik for hver glykan. Stjernene indikerer glykaner i hvilken den midlere glykan: GB5 IgG-forholdet var signifikant høyere i serum fra pasienter med HCC (n = 155) enn i serum fra friske individer (n = 33).
p
verdiene ble beregnet med en Student
t
-test (*
p
0,05; **
p
0,01).
Sammenligning av Nivåer av Seven Anti-sukker Antistoffer blant kvinnelige og mannlige pasienter med HCC og friske individer
i en tidligere studie [22], men hadde en høyere forekomst av HCC enn kvinner. I vår nåværende studie økte vi de HCC prøver tallene opp til 293 pasienter og stratifisert våre resultater etter kjønn for å avgjøre om anti-sukkerantistoffnivåer varieres etter kjønn. Blant kvinner, nivåer av IgG mot sukker tallene 15, 18 og 35 var signifikant høyere hos pasienter med HCC enn hos friske individer (
P
0,01) (figur 3A). Blant menn, nivåer av IgG mot sukker tallene 15, 18, 35, 36 og 42 var signifikant høyere hos pasienter med HCC enn hos friske individer (
P
0,05) (figur 3B). Interessant, observerte vi tilsvarende resultater for glykan tallene 15, 18 og 35 mellom to grupper.
Relativ fluorescens-forhold ble beregnet som fluorescensintensitet for hver glykan analog dividert med fluorescensintensiteten for GB5, og de er uttrykt som prosenter i tallene. Figuren viser gjennomsnittsforholdet ± standardavvik for hver glykan. (A) glykan: GB5 IgG forhold for glykan tallene 15, 18 og 35 var signifikant høyere i serum fra kvinnelige pasienter med HCC (n = 70) enn i serum fra friske kvinner (n = 11). (B) ved sukker: GB5 IgG forholdstall for sukker tallene 15, 18, 35, 36 og 42 var signifikant høyere i serum fra mannlige pasienter med HCC (n = 223) enn i serum fra friske menn (n = 22). Stjernene viser glykaner der middelverdien sukker: GB5 IgG ratio var betydelig høyere i serum fra pasienter med HCC enn i serum fra friske individer.
p
verdiene ble beregnet med en Student
t
-test (*
P
0,01).
Sammenligning av nivået fra Select Anti-sukker antistoffer fra HCC og kronisk leversykdom (CLD) etter kjønn
på verdensbasis er mer enn 52% av HCC tilfeller er forbundet med kronisk HBV-infeksjon, og 25% av HCC tilfeller er forbundet med HCV-infeksjon [23]. Kjent HBV eller HCV-infeksjon kan øke risikoen for å utvikle HCC [7]. For å undersøke forskjeller i HCC pasienter med HBV eller HCV-infeksjon, fordelt vi pasientene inn i HBV-positive HCC (HBV-HCC; n = 132) eller HCV-positive HCC (HCV-HCC; n = 65) for å sammenligne kronisk leversykdom ( HBV-CLD; n = 133 og HCV-CLD; n = 134). For begge kjønn, nivåer av IgG mot glykaner 15, 18, og 36 for kvinner og menn var høyere hos HBV pasienter med HCC fra pasienter uten HCC (
P
0,05) (Figur 4A og B). Det var ingen signifikante forskjeller i anti-glykan nivåer mellom pasienter med HCV-HCC og kroniske HCV-pasienter (figur 5A og B).
Relativ fluorescens-forhold ble beregnet som fluorescensintensitet for hver glykan analog dividert med fluorescensen intensitet for GB5, og de er uttrykt som prosenter i figurene. Figuren viser gjennomsnittsforholdet ± standardavvik for hver glykan. Forholdene for glykan tallene 15, 18 og 36 var betydelig høyere fra HBV-relaterte HCC enn CLD (HBV) hos kvinner (n = 30 og 44, hver for seg) (A) og hanner (n = 102 og 89, hver for seg) ( B).
p
verdiene ble beregnet med en Student
t
-test (*
P
0,05, **
P
0,01, * **
P
. 0,001)
Relative fluorescens forhold ble beregnet som fluorescens intensitet for hver sukker analog dividert med fluorescens intensitet for GB5, og de er uttrykt i prosent i tallene. Figuren viser gjennomsnittsforholdet ± standardavvik for hver glykan. Forholdene for glykan tallene 15, 18, 35, 36 og 42 var ingen signifikant forskjell mellom HCV-relaterte HCC og CLD (HCV) hos kvinner (n = 18 og 61, hver for seg) (A) og hanner (n = 47 og 73 , separat) (B). (
P
0,05).
neste sammenlignet påvisning av sukker analoger og AFP for deres diagnostisk sensitivitet for HCC fra CLD og sunn. For en pasient med en historie med leversykdom, kan konsensus for diagnostisering av HCC oppnås med en forhøyet AFP nivå (≥200 ng /dl), sammen med en dynamisk avbildning studie som viser en levertumor. I Taiwan er cutoff verdi av serum AFP nivå for HCC diagnose settes til 200 ng /ml, og i henhold til retningslinjene for klinisk diagnose og staging kriterier for HCC. Derfor endrer vi cutoff verdi av AFP. Når AFP
200 (AFP ved en grenseverdi på 200 ng /ml) ble anvendt til å forutsi HCC trinnet, en følsomhet på 33,33% (10 av 30) ble oppnådd for kvinner, og 24,51% (25 av 102 ) ble oppnådd for menn (tabell 2). Vi har observert at følsomheten av 3 anti-glykan nummer (15, 18 og 36) var bedre enn den for AFP til 63,33% (19 av 30) /42.16% (43 av 102), 56,67% (17 av 30) /35,29% (36 av 102), og 43,33% (13 av 30) /45.1% (46 av 102), henholdsvis i kvinner /menn. (Tabell 2). For å teste om følsomheten for klassifisering kan økes ved å inkludere kliniske data, ble AFP-verdiene inkludert i analysen. Som det fremgår av tabell 2, inkludering av AFP verdier og 3 anti-sukker markører økt følsomhet i riktig klassifisering av HCC statene til 80% (24 av 30) og 74,5% (76 av 102), henholdsvis i kvinnelige og mannlige.
Den diagnostiske verdien av tre anti-sukker Antistoffer for HCC
for å vurdere om serum anti-sukkernivåer kan brukes som en diagnostisk markør for HCC, mottaker operasjonelle egenskaper (ROC) kurve analyser ble utført. Det ble avslørt at serum 3 anti-sukker markører pluss AFP nivåer var en potensiell markør for kresne HBV-positiv HCC pasienter fra friske kontroller med en AUC (områdene under ROC kurve) fra 0,6843 (95% KI: 0,5882 til 0,7805) ( figur 6A). I cut-off verdi på 0,4974, sensitivitet og spesifisitet for denne markøren var 46,21% og 84,85%. AUC for serum tre anti-sukker markører pluss AFP nivåer for kresne HBV-positiv HCC av kronisk HBV var 0,6923 (95% KI: 0,6215 til 0,7631) (figur 6B). I cut-off verdi på 0,5268, sensitivitet og spesifisitet for denne markøren var 57,58% og 82,43%. Dette resultatet tyder på at disse 3 anti-sukker markører pluss AFP kan være aktuelt for diagnostisering av HBV-relaterte HCC.
Disse 3 anti-sukker antistoffer ga en AUC (områdene under ROC-kurven) på 0,6843 ( 95% KI: 0,5882 til 0,7805) med 46,21% sensitivitet og 84,85% spesifisitet for kresne HCC pasienter fra friske kontroller (A), og en AUC på 0,6923 (95% KI: 0,6215 til 0,7631) med 57,58% sensitivitet og 82,43% spesifisitet for diskriminerende HCC fra HBV-CLD pasienter (B).
Diskusjoner
Tumor markører i serum hos pasienter med HCC kan brukes som diagnostiske verktøy, prognostiske faktorer og behandling parametere [ ,,,0],24]. Ved hjelp av vår glykan microarray, undersøkte vi serum for å søke etter antistoffer som kan skille mellom pasienter med HCC og friske individer. Denne studien har vist at potensialet for en glykan microarray for å identifisere cacas biomarkør kandidater i serum fra pasienter med HCC. I vår nåværende studie, forskjeller i serumantistoffnivåer mellom pasienter med HCC og friske individer var betydelig, med antistoffnivåer for 7 av 58 glykaner forskjellig rikelig (p 0,01). Disse glykaner var SLacNAc 6SO
3, DSGG, fucosyl GM1, Gb3, GB2, B19, og Man7. Endringer i glykosylering i kreft, så vel som andre sykdommer, har tiltrukket seg stor interesse og har vist seg lovende både som en kilde til sykdomsmarkører og som mål for immunterapi av tumorer [15]. Endringer i glykosyltransferase-ekspresjonsnivåer som vanligvis fører til en økning i størrelsen og forgrening av N-bundne glykaner, noe som skaper ytterligere seter for terminale sialinsyrerester [25]. En tilsvarende økning i sialyltransferase uttrykk til slutt fører til en generell økning i sialysering [26]. Overekspresjon av glycosyltransferases som er involvert i å knytte terminale rester til glykaner fører til overekspresjon av visse terminal glykan-epitoper som SLacNAc 6SO
3, DSGG, og fucosyl GM1 på tumorer [27] -. [29]
Vi fant at anti-DSGG nivåer skilles mellom pasienter med HCC og CLD. DSGG er en disialyl glykosphingolipid med en globo-serie kjerne struktur [27]. I en tidligere studie ble DSGG identifisert som et adhesjonsmolekyl uttrykt på nyrecellekreft, og dens forhold til metastatisk kreft ble demonstrert [27]. Våre data er den første til å foreslå at DSGG er sterkt uttrykt i HCC
Interessant nok har en kjønnsforskjell blitt beskrevet for HCC i nesten alle studiepopulasjoner, med en mannlig. Kvinne forhold til forekomsten av HCC gjennomsnitt mellom 02:01 og 04:01 [30]. En mekanisme som kan forklare kjønnsforskjeller observert i forekomsten av HCC er den økte aktiviteten av østrogener i kvinnelige pasienter, som kan gi beskyttelse mot hepatocarcinogenesis [22]. I tillegg er det trolig andre cellulære regulatoriske molekyler involvert i kjønnsforskjeller i forekomsten av HCC. I vår nåværende studie, observerte vi en kjønnsforskjeller i nivåene av litt forskjellige anti-karbohydrat antistoffer. Nivåer av anti-fucosyl GM1 forskjellig hos pasienter med HCC og kronisk HBV eller friske individer. Fucosyl GM1 representerer en form for gangliosider [28]. I en tidligere studie, ble fucosyl GM1 sterkt assosiert med små-celle kreft i lunge, og dette tumorassosiert antigen ble påvist med høy sensitivitet og spesifisitet ved anvendelse av en metode immunfluorescens [28]. Rollen til dette glykan i kreft er uklar. Den glykosylering av hormonreseptorer har blitt foreslått som en forklaring på kjønnsforskjeller i koronar hjertesykdom og prostata kreft [31], [32]. Selv om hvordan generell disse observasjonene er å populasjoner med en mer heterogen sykdom etiologi gjenstår å bli undersøkt, og resultatene som presenteres her på potensielle sukker biomarkører virke ganske oppmuntrende. Nylig har store analytiske metoder har blitt utviklet for humant serum glycoproteome, som også er et kraftig verktøy for oppdagelsen av diagnostiske og terapeutiske mål. Ved hjelp av lektin-baserte glycoproteomic analyse, glykoprotein (GP) 73 ble funnet å være en ny tumormarkør for HCC [33]. Serum GP73 nivåene ble betydelig økt hos pasienter med HCC, selv i HCC pasienter med serum AFP nivåer mindre enn 20 ng /ml [24]. Fucosylation av GP73 er rapportert å være økt hos pasienter med HCC [33]. En tidligere studie antydet at fucosylation spiller en viktig rolle i interaksjonen mellom interleukin-8 og dets reseptor, for derved å indusere migrering av kreftceller i HCC [34]. Vår nåværende Resultatene tyder på at fucosyl GM1 er en kandidat lever cacas biomarkører.
HCC er assosiert med HBV-infeksjon hos omtrent 50% av tilfellene [35]. I denne studien ble det observert at fem typer av anti-glykan-antistoffer ble øket hos pasienter med HCC og HBV-infeksjon. Derfor ekstrapolere vi at økningen i antistoffer og HBV-infeksjon er relatert. Woodchucks blir brukt som et foretrukket dyremodell av kronisk HBV-infeksjon [36]. Denne modellen rekapitulerer sykdomsutviklingen av HBV-infeksjon til HCC og har dokumentert likheter i protein glykosylering med menneskelig HCC [36]. Som HCC vanligvis tar år å utvikle seg som et resultat av kronisk HBV-infeksjon, kan etterforskningen av tidlige hendelser i woodchuck modell av HBV-infeksjon gir nyttig informasjon om potensielle biomarkører for prognosen for HCC. De biologiske påvirkninger kjøre disse endringene krever nærmere undersøkelse.
AFP er den eneste serologisk markør i dag brukes til klinisk påvisning av HCC. Selv AFP forbedrer deteksjonen av HCC, har et betydelig antall pasienter med HCC ikke har forhøyede nivåer AFP, og således, er flere biomarkører for å øke sensitiviteten for påvisning HCC [37], [38]. I tidligere forskning har AFP vist begrenset sensitivitet (41-65%) i diagnostisering av HCC [39]. Derfor er det et presserende behov for å oppdage flere biomarkører for screening og diagnostikk av HCC. Vår studie sammenlignet pasienter med HCC og CLD pluss sunt, og disse 3 sukker gitt bedre følsomhet enn AFP. Videre er følsomheten av 3 anti-karbohydrat-antistoffer pluss AFP tilgjengelig bedre diagnose følsomhet.
I tillegg var det ingen korrelasjon mellom nivåene av disse 3 anti-glykan antistoffer og tumorstadium (data ikke vist). Derfor foreslår vi at de 3 anti-karbohydrat antistoffer kan være som biomarkører for igangsetting av tumordannelse, men ikke tumorprogresjon. Videre undersøkelse ved hjelp av en større pasientgruppe og en valideringsprosess som inkluderer prospektivt samlet pasientprøver for å bekrefte våre observasjoner. Disse nye cacas biomarkører, i kombinasjon med andre eksisterende serologiske biomarkører kan være verdifull i diagnostisering av HCC. Basert på våre resultater, foreslår vi at å kombinere sukkermicroarray analyse med AFP målingene gir et mye bedre verktøy for HCC diagnose enn bruk av AFP alene.
Biomarkører har lenge vært søkt etter deres diagnostiske, prognostiske og terapeutiske bruker. Det er imidlertid ingen pålitelige biomarkører for de fleste solide tumorer, inkludert HCC. Metodene som er beskrevet i vår nåværende studien er nyttig for å identifisere mulige biomarkører for sykdom. Utviklingen av en sukkermicroarray har gjort det mulig med høy følsomhet og høy gjennomstrømming analyse av karbohydrat-protein interaksjoner og har bidratt til betydelige fremskritt i glycomics. Denne fremgangsmåten tilveiebringer både et kraftig verktøy for grunnforskning og en lovende metode for medisinsk diagnose og påvisning av patogener og kreft [20]. Denne metoden krever meget små mengder av materiale og er mer effektiv og følsom enn den tradisjonelle ELISA-metoden; således gir det en annen plattform for å overvåke immunresponsen til karbohydrat epitoper på forskjellige stadier i løpet av differensiering, metastase, og behandling [21]. Vår nåværende forskning identifisert fem cacas biomarkører for HCC diagnose som må vurderes nærmere i det videre arbeidet. Identifisering av cacas vil være nyttig i utviklingen av nye cancer-terapier, for eksempel dannelse av vaksiner eller antistoffer målrettet mot cacas [14], [19], [40] – [42]. Vi tror at sukkermicroarray er en levedyktig metode for klinisk diagnose av HCC. Denne metoden bør forbedre prognose og kan tilby innsikt i utviklingen av nye terapeutiske tilnærminger for andre kreftformer. Nye glykan antigener kan vise seg å være nyttige mål for eksisterende karbohydratsammensetninger og de som er i utvikling.
Som konklusjon, har vi vist at glykan mikromatriseanalyse anvendes for å identifisere nye kandidat glykan biomarkører for HCC kan være nyttige i screening av serum biomarkører for HCC. De biomarkør kandidater vi identifisert ved hjelp av sukkermicroarray analyse viste god prediktiv følsomhet i studiepopulasjonen, og generelt, de var overlegne i forhold til AFP. Tilsetning av de ovenfor angitte resultater til de konvensjonelle leverfunksjonstester kan faktisk forbedre den diagnostiske nøyaktigheten av leversykdommer. Glycan microarray analyse gir et kraftig verktøy for høy følsomhet og høy gjennomstrømming påvisning av antistoffer mot cacas, og de identifiserte serum biomarkører kan være nyttig for tidlig deteksjon av HCC i høyrisikogrupper.
Materialer og Metoder
Etikk erklæringen
studien protokollen ble godkjent av Institutional Review Board of Human Emner forskningsetiske komité for Cheng Kung universitetssykehus i Taiwan (No. eR-99-176). I tillegg ble skriftlig informert samtykke oppnådd fra deltakerne for bruk av deres blod i denne studien.
Serumprøver
serumprøver fra friske individer (n = 33), kronisk HBV (n = 133 ), ble kronisk HCV (n = 134) og pasienter med HCC (n = 293) samlet ved National Cheng Kung universitetssykehus i Tainan, Taiwan. Prøvene ble kryptert for å beskytte pasientens konfidensialitet og ble brukt under en protokoll godkjent av Institutional Review Board of Human Emner forskningsetiske komité for Cheng Kung universitetssykehus i Tainan, Taiwan. Pasientene ble diagnostisert ved hjelp av en kombinasjon av data (kliniske, laboratorium og røntgenfunn og /eller biopsi). Alle prøvene ble lagret ved -20 ° C inntil bruk.
Generelle metoder
NEXTERION lysbilde H ble kjøpt fra Schott Nord-Amerika. Belegget på SCHOTT NEXTERION Slide H består av en tverrbundet, multi-komponent polymerlag aktivert med N-hydroksysuksinimid (NHS) estere til å gi kovalent immobilisering av amingrupper. Den generelle fremgangsmåten for syntese av glykaner ble gjennomført som rapportert [20], [21], [43]
Glycan Microarray Fabrication
Mikromatriser ble skrevet ut. (BioDot; kartesiske Technologies) med en robot tapp (SMP3; TeleChem International) med en avsetning av ≈ 0,7 nL av forskjellige konsentrasjoner av aminholdige glykaner i trykking buffer (300 mM fosfatbuffer [pH 8,5] inneholdende 0,005% Tween-20) fra en 96-brønners mikrotiterplate på NHS-belagt glassplater. Glassene ble oppdaget med 50 pM løsninger av hver glykan, med to rader fra bunn til topp og fem vertikale paralleller i hver undergruppe. Hver side er designet for 14 nett. Trykte objektglass ble tillatt å reagere i en atmosfære av 80% fuktighet i 1 time, etterfulgt av uttørking over natten. Glassene ble lagret ved romtemperatur i en eksikator inntil bruk. Før bindingsanalysen, ble platene blokkert med etanolamin (50 mM etanolamin i 50 mM boratbuffer [pH 9,2]), og deretter vasket to ganger med vann og fosfatbuffer saltvann (PBS) (pH 7,4).
Microarray analyse av serumprøver
Serumprøver prøver~~POS=HEADCOMP fra pasienter med HCC og friske individer ble fortynnet 1:20 med en buffer bestående av 0,05% Tween 20 og 3% BSA i PBS (pH 7,4), anvendt til gitrene i glykan mikromatriser, og deretter inkubert i et fuktet kammer med risting i 1 time. Objektglassene ble deretter vasket tre ganger med 0,05% Tween 20 i PBS (pH 7,4), PBS (pH 7,4), og H
2O. Deretter ble Cy3-konjugert geit anti-humant IgG-antistoff (Jackson Immunoresearch) tilsatt til skinnene, som beskrevet ovenfor, og objektglassene ble inkubert under en coverlid i et fuktet kammer med risting i 1 time. Objektglassene ble vasket tre ganger med 0,05% Tween 20 i PBS (pH 7,4), PBS (pH 7,4), og H
2o, og deretter tørket. Skinnene ble skannet ved 532 nm (for Cy3-konjugert sekundært antistoff) med en microarray fluorescens chip-leser (arrayWoRx microarray-leser).
Data Analysis
Programvaren GenePix Pro (Axon Instruments) ble anvendes for fluorescensen analyse av de ekstraherte data. Den lokale Bakgrunnen ble subtrahert fra signalet ved hvert antistoff sted. Den «medianer av ratios» fra replikere flekker ble i gjennomsnitt i samme array. For å oppnå de relative intensitetene av bindings glykaner i humane sera, setter vi bindingen intensitet for GB5 til 100% og normalisert de relative intensitetene av hver binding glykan analog for hver serumprøve. Forholdet mellom anti-glykan: anti-GB5 i sera ble beregnet ved å dividere den midlere relative bindings intensitet for glykan replikater av den midlere relative bindings intensitet for GB5 replikeres, og resultatene ble uttrykt som prosentandeler. Sensitiviteten ble beregnet som forholdet mellom antall HCC prøver som ble klassifisert som fullstendig HCC (sanne positive) til det totale antall HCC prøver. Til slutt ble statistisk analyse av IgG-nivåer hos pasienter med HCC og friske individer utføres ved hjelp av en uparet Student
t
-test. Mottaker som opererer karakteristiske (ROC) kurver ble konstruert og arealet under kurven (AUC) ble beregnet for å evaluere spesifisiteten og sensitiviteten til å forutsi tilfeller og kontroller. Dataanalyse ble gjort ved hjelp av Prism 5 (GraphPad Software, Inc.) og Sigmaplot 9.0 programvare (Sigmaplot).
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
Syntese av glykaner. Kjemien komponere metoden ble brukt til å syntetisere 58 karbohydratantigener
doi:. 10,1371 /journal.pone.0039466.s001 plakater (TIF)
