Abstract
Proangiogenic enzym tymidinfosforylase (TP) er et lovende mål for kreftbehandling, men dens virkning i ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) ikke er fullt ut forstått. For å belyse dens rolle i NSCLC tumorvekst, ble NCI-H292 lunge mucoepidermoid carcinoma celler og endotelceller konstruert for å overuttrykke TP ved viral vektor transduksjon. NSCLC-celler med endret ekspresjon av transkripsjonsfaktor Nrf2 eller dets målgenet heme oksygenase-1 (HO-1) ble brukt for å studere reguleringen av TP og resultatene fra prekliniske modeller var relatert til genuttrykk data fra kliniske prøver NSCLC. Overekspresjon av Nrf2 eller HO-1 resulterte i oppregulering av TP i NCI-H292-celler, en virkning etterlignes ved behandling med en antioksydant N-acetylcystein og delvis reversert ved HO-1 knockdown. Overekspresjon av TP svekket celleproliferasjon og migrasjon
in vitro
, men samtidig forbedret angiogenic potensialet i kreftceller supplert med tymidin. Sistnevnte ble også observert for SK-MES-1 plateepitelkarsinom og NCI-H460 stor celle carcinoma celler. TP-overuttrykkende NCI-H292-tumorer
in vivo
oppviste bedre oksygenering og økt ekspresjon av IL-8, IL-1β og IL-6. TP overekspresjon i endotelceller augmented deres angiogene egenskaper, som var forbundet med forbedret generering av HO-1, og VEGF. Korrelasjon av TP med ekspresjon av HO-1 og inflammatoriske cytokiner ble bekreftet i kliniske prøver av NSCLC. . Fullstendig, økt ekspresjon av IL-1β og IL-6 sammen med proangiogenic effekter av TP-uttrykkende NSCLC på endotelet kan bidra til tumorvekst, noe som tyder TP som et mål for antiangiogenesis i NSCLC
relasjon: Tertil M , Skrzypek K, Florczyk U, Weglarczyk K, Var H Collet G, et al. (2014) Regulering og Novel Handling tymidinfosforylase i ikke-småcellet lungekreft: Crosstalk med Nrf2 og HO-1. PLoS ONE 9 (5): e97070. doi: 10,1371 /journal.pone.0097070
Redaktør: Soumitro Pal, Barnesykehuset i Boston Harvard Medical School, USA
mottatt: 28 oktober 2013, Godkjent: 14 april 2014; Publisert: 12. mai 2014
Copyright: © 2014 Tertil et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Støttet av tilskuddene No 311 /N-COST /2008/0, 347 /N-INCA /2008/0 og N N301 314837 fra National Science Centre (NCN). Alicja Jozkowicz var en internasjonal Forsker fra Wellcome Trust. M. Tertil og K. Skrzypek ble støttet av Conseil Regional du Centre, stipend for co-opplæringen doktorgradsavhandling. Fakultet for biokjemi, biofysikk og bioteknologi av Jagiellonian University er en mottaker av de strukturelle midler fra EU og den polske departementet for vitenskap og høyere utdanning (gir No: POIG.02.01.00-12-064 /08, 02.02. 00-00-014 /08, 01.01.02-00-109 /09 og 01.01.02-00-069 /09). Forskning utført i omfanget av MiR-Tango International Associated Laboratory (LIA). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
lungesvulster rangerer som den øverste årsaken til kreft-relaterte dødsfall på verdensbasis, med ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) er den mest utbredte. NSCLC pasienter er ofte diagnostisert med avansert sykdom, når systemisk kjemoterapi er den viktigste behandlingsalternativ. Siden tumorvekst og metastasering er avhengig av angiogenese, har mekanismer som styrer dannelsen av nye blodkar vært målrettet for intervensjon i lungekreft [1]. Men tillegg av anti-VEGF agenter til konvensjonell kjemoterapi resulterte bare i liten forbedring av median overlevelse [1], [2] med pasienter som opplever tumorresidiv grunn av fremveksten av resistens til antiangiogene midler, noe som understreker et presserende behov for nye mål for kombi behandlinger.
tymidinfosforylase (TP, EC2.4.2.4) er en pyrimidin berging syntese sti enzym, som også er kjent for sine proangiogenic egenskaper. TP katalyserer reversibel phosphorolysis av tymidin inn i thymin og 2-deoksy-D-ribose-1-fosfat (DRP), som er videre defosforyleres til 2-deoksy-D-ribose (dR). Enzymet og dets sukkerprodukter stimulere endotelceller migrasjon og tube dannelse
in vitro Hotell og forbedre angiogenese i ulike modeller
in vivo product: [3]. TP blir ofte overuttrykt i humane tumorer, inkludert NSCLC [3], [4] og har blitt vist å korrelere med høyere tetthet microvessel, mer avansert stadium tumor, metastase og dårlig prognose [3]. Proangiogenic virkning av TP i tumorer, bortsett fra den direkte virkningen av produktene på endotelceller, kan også innebære at stimuleringen av ekspresjonen av andre angiogene faktorer som for eksempel VEGF, interleukin-8 (IL-8) eller heme oksygenase-1 (HO- 1) [5], [6]. Derfor er rettet mot TP med små-molekyl hemmere for tiden etterforskes som en roman antiangiogen strategi [7]. Ikke desto mindre, for utvikling av effektive kombinatoriske kjemoterapeutika, kan beholdt enzymatisk aktivitet av TP være nødvendig da det katalyserer et viktig skritt i aktivering av fluoropyrimidin baserte midler slik som kapecitabin, som har blitt foreslått som alternative behandling for avansert NSCLC [8]. Denne doble funksjon av TP i tumorvekst og behandling innebærer at inhibering protumoral virkningene av enzymet kan kreve rettet mot nedstrømsmediatorer. Belyse mekanismene for regulering og kreftfremmende handlinger TP er derfor av avgjørende betydning.
Nrf2 (nuclear factor (erytropoide-avledet 2) -lignende 2) er en transkripsjonsfaktor som regulerer cellulære antioksidant svar [9]. Det er ofte konstitutivt aktiv i tumorer, inkludert lungekreft, og kan bli ytterligere indusert ved anticancerbehandlinger. Det driver ekspresjon av cytoprotektive gener som fører til utvikling av resistens overfor cytotoksiske midler [10]. Ett av målene Nrf2 er HO-1, som omdanner heme til CO, toverdig jern og biliverdin, og som er blitt vist å mediere Nrf2 drevet motstand av NSCLC-celler for kjemoterapi [11], [12]. Interessant nok, begge proteiner spiller roller i fremming av angiogenese: virkningen av HO-1 oppstrøms og nedstrøms angiogenic VEGF og SDF1α er vel etablert [13], og involvering av Nrf2 i reguleringen av angiogen IL-8 har blitt demonstrert [14] – [16].
Her undersøker vi den biologiske rollen TP fokus på angiogenese og samspillet med Nrf2 og HO-1 i ikke-småcellet lungekreft og endotelceller. Våre resultater viser effekten av TP overekspresjon i NSCLC celler
in vitro Hotell og
in vivo Hotell og markere betydningen av proangiogenic virkningen av enzymet.
Materialer og metoder
plasmider og virale vektorer
Plasmid pBK-RSV-TP huse human TP cDNA ble vennlig levert av Dr. S. Liekens (Rega Institute for Medical Research, KU Leuven, Belgia). Plasmid pEF (blå) -Nrf2 inneholder human Nrf2 cDNA ble vennlig Gitt av Dr. J.A. Johnson (Division of Pharmaceutical Sciences, University of Wisconsin-Madison, USA) [17]. Bygging av retrovirale vektorer (RVs) RV-TP og RV-Nrf2 ble utført som beskrevet i supplerende metoder (File S1). Retroviral plasmid pMSCV-Luc inneholdende luciferase ekspresjonskassett for produksjon av RV-Luc ble oppnådd fra Addgene. Alle RVs inkludert en kontroll RV-tom vektor (LNCX2) ble produsert som beskrevet i [18].
adenovirus vektorer (AdVs) husing TP cDNA (AdTP) ble utviklet som beskrevet i supplerende metoder (File S1) og kontroll vektorer med GFP (AdGFP) som rapportert tidligere [16]
celle~~POS=TRUNC linjer~~POS=HEADCOMP og kultur vilkår
Menneskelig NSCLC cellelinjer:. NCI-H292 (mucoepidermoid karsinom, kjøpt fra ATCC), A549 ( adenokarsinom, hentet fra professor Jakub Golab, Warszawa Medical University, Warszawa, Polen) og NCI-H460 (stor celle karsinom, kjøpt fra ATCC) ble dyrket i RPMI 1640 (PAA) og SK-MES-1 (plateepitelkarsinom, kjøpt fra ATCC) ble dyrket i MEM (Gibco), hver supplert med 10% føtalt bovint serum (PAA) og penicillin (100 E /ml) /streptomycin (10 ug /ml) (Sigma) (penn /strep). Menneske mikrovaskulære endotelceller (HMEC-en, hentet fra Dr Francis Candal, Center for Disease Control and Prevention, Atlanta, USA) ble dyrket i MCDB 131 supplert med 10% FBS, L-glutamin 2 mm, penn /strep, EGF 10 ng /mL og hydrokortison 1 mg /ml. Primære humane navlestrengvene endotelialceller (HUVEC) ble isolert som tidligere beskrevet [19] og dyrket i M199 (PAA) supplert med 20% FBS, pen /strep og endotelial celleveksttilskudd ECGS 30 mg /L (Millipore).
Alle celler ble holdt i standard kulturbetingelser: 37 ° C, 5% CO
2, 95% fuktighet. For undersøkelse av effekten av hypoksi celler ble plassert i 24 eller 48 timer i et kammer (Biospherix USA) under kontrollerte gassatmosfære 1% O
2, 5% CO
2 og 94% N
2 plassert ved 37 ° C i en cellekulturinkubator.
for opprettelse av cellelinjer NCI-H292-Luc-TP (NCI-TP), og NCI-H292-Luc-Nrf2 (NCI-Nrf2) stabilt overuttrykke luciferase og respektive transgener og kontroll NCI-H292-Luc-EV (NCI-EV) modifisert med tom vektor, ble cellene transdusert med retrovirale vektorer. Først ble en infeksjon med RV-transgen eller RV-tom vektor (RV-EV) utføres og stabilt transformerte celler ble valgt av geneticin (1 mg /ml), som ble etterfulgt av transduksjon med RV-Luc og seleksjon av hygromycin (0,3 mg /ml). NCI-H292-Luc-HO-1 (NCI-HO1) cellelinje ble utviklet og validert tidligere i vårt laboratorium [20]. For vedlikehold av transgene expression-celler ble rutinemessig holdt i standard medium i tillegg supplert med geneticin (0,5 mg /ml) og hygromycin (0,1 mg /ml). For forsøkene ble celler sådd ut i medium uten antibiotika.
Transient TP overekspresjon og stimulering av celler med NAC eller TP substrat
tymidin (THD) og N-acetylcystein (NAC) ble innkjøpt fra Sigma Aldrich . For transient TP overekspresjon i ECS ble HMEC-1 og HUVEC-celler transdusert med adenovirale vektorer AdTP eller kontroll AdGFP ved MOI = 10 i 24 timer og deretter stimulert med Thd i ytterligere 24 timer i komplett medium. For transient TP overekspresjon i NSCLC-celler, ble SK-MES-1 og NCI-H460 transdusert ved MOI = 20 og MOI = 40, henholdsvis, og stimulert med 1 mM Thd i medium supplert med 2% FBS 48 timer post-transduksjon.
real-time RT PCR
mRNA nivåer av gener ble bestemt ved kvantitativ RT PCR. RNA ble isolert med enten Qiazol (Qiagen) eller ved hjelp av RNeasy Plus Micro Kit (Qiagen) i henhold til produsentens instruksjoner. 1 mikrogram av RNA ble revers-transkribert til cDNA ved hjelp av oligo-dT primere med RevertAid Premium First Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas). Real-time PCR ble utført med 30 ng av prøven med QuantiTect SYBR Grønn (Qiagen, analyse av
in vitro
eksperimenter) eller SYBR Premiks Ex Taq II (Takara, analyse av
in vivo
eksperimenter ) i henhold til produsentens instruksjoner om LightCycler 480 II-systemet (Roche). Genekspresjon ble beregnet i henhold til ΔCt eller ΔΔCt metoder med EF2 som en referanse gen, med feilfelt beregnet som standardavvik av midler, delt √ (N-1), hvor N var antallet uavhengige eksperimenter. Feil forplantning ble ikke tatt hensyn til, hva er noen begrensning i vår studie.
Western blot analyser og ELISA
Western blot for HO-1 ble utført som i [19]. For påvisning av humane TP mus mAb P-GF.44C (Calbiochem) ble brukt. Produksjon av humant VEGF og IL-8 i kulturmedier og humant IL-8, IL-1β og IL-6 i tumor lysater ble kvantifisert ved bruk av DuoSet ELISA-sett (R .
d
er den minste dimensjon)
Måling av tumor oksygene
oksygenering av svulstvev ble målt ved OxyLite sensorsystem basert på ruthenium fluorescensslukking av O
2 (Oxford Optronix).
Analyse av klinisk materiale
Etikk uttalelse.
menneske~~POS=TRUNC studier ble godkjent av lokale etiske komiteen av Collegium Medicum av Jagiellonian University i Krakow, Polen. Pasienter har uttrykt skriftlig samtykke til deltakelse i studien.
Biopsi av primære svulster og kreftmetastaser til lymfeknuter (hvis den finnes) ble samlet under en operasjon fra 24 pasienter som lider av NSCLC adenokarsinom. Pasientene ble behandlet ved Klinikk for Thoracic Surgery, Jagiellonian University Medical College, 31-202 Kraków, Polen.
Statistisk analyse
Med mindre annet er angitt, viser resultatene gjennomsnitt ± SEM av minst tre uavhengige eksperimenter utført i duplikater. Uparede Student t-tester ble brukt for å vurdere om de hjelp av to gruppene var signifikant forskjellig. For sammenligning av flere grupper ble benyttet enveis ANOVA analyse med Tukey post-test. Forskjeller med en verdi på p. 0,05 ble betraktet som statistisk signifikant
Resultater
TP er forskjellig uttrykt i NSCLC celler med varierende grad av Nrf2 og heme oxygenase-en
undersøkt TP uttrykk i NSCLC cellelinjer A549 og NCI-H292 som stammer fra ulike histologiske typer svulster – adenokarsinom og mucoepidermoid karsinom, henholdsvis. Western blot analyse viste at A549 adenokarsinom viser høy basal ekspresjon av TP, mens enzymet nivået er meget lavt i NCI-H292 (Fig. 1A). Da de to cellelinjer er kjent for å være forskjellig i aktiviteten av transkripsjonsfaktoren Nrf2 og dens målgenet HO-1, idet begge deler uttrykt på høyere nivå i A549 enn i NCI-H292 ([22], Fig. 1A, B), undersøkte vi vidt Nrf2 /HO-en akse kan være involvert i reguleringen av TP. Faktisk, når Nrf2 og HO-1 ble uavhengig er stabilt overuttrykt i NCI-H292-celler (fig. S1A, [20]), som har lav basal Nrf2 og HO-1, ble induksjon av TP observert i både NCI-Nrf2 og NCI -HO1 celler (figur 1C . D, henholdsvis). Dette uttrykket mønsteret ble også bekreftet
in vivo
i subkutan HO-1-overekspresjon xenografttumorer avledet fra NCI-HO1 celler i hårløse mus (Fig. 1E).
A. Basal TP, Nrf2 og HO-1 proteinnivåer i A549 og NCI-H292 NSCLC cellelinjer som indikerer en mulig sammenheng mellom TP uttrykk med Nrf2 /HO-en akse. B. Basal Nrf2 transkripsjonen aktivitet i NSCLC-cellelinjer, målt ved reportergen-analyse ved bruk av plasmid som bærer luciferase-genet under kontroll av antioksydant responselement (ER) (n = 3, * p 0,05 NCI-H292
vs
A549 ). C-D. Økt TP mRNA og protein uttrykk i NCI-H292 cellelinjer stabilt overekspresjon Nrf2 eller HO-1 (n = 4, * p 0,05 kontroll tom vektor (EV)
vs
transgen overekspresjon) E. TP mRNA (til venstre ) og protein uttrykk (høyre, densitometrisk analyse av WB i nedre panel)
in vivo
i kontroll og HO-1-overekspresjon NCI-H292 xenografter (etablert som beskrevet i [20]) bekrefter
i vitro
data (n = 5, * p 0,05 NCI-HO1
vs
NCI-EV)
Nrf2-bindingssteder innenfor TP arrangøren har ikke blitt identifisert. (analyse ikke vist) tyder på at reguleringen er indirekte. Siden HO-1 er et kjent mål for Nrf2 og var signifikant oppregulert i NCI-Nrf2-celler (fig. S1B), vi neste mål for å bestemme hvorvidt virkningen av Nrf2 var HO-1-avhengig. NCI-Nrf2-celler ble transfektert med siRNA mot HO-1 (fig. S2), noe som førte til en delvis nedregulering av TP-ekspresjon i både Nrf2-overuttrykkende celler og kontroll-celler transdusert med tom vektor (NCI-EV) (Fig. 2A) , noe som tyder på at HO-1 spiller en rolle i reguleringen av TP i NSCLC, men sitt engasjement i effekten av Nrf2 er mindre. Videre behandling av NCI-EV-celler med en antioksydant N-acetylcystein resulterte i en doseavhengig oppregulering av TP (Fig. 2B), etterligne regulering av enzymet ved Nrf2 /HO-1 overekspresjon. Siden stimulering av kontrollceller med HO-1 produkter ikke klarte å gjengi oppregulering av TP funnet i HO-1 overekspresjon-celler (fig. S3), effekten av Nrf2 /HO-1 kunne tilbakeføres til demping av oksidativt stress, som vi har allerede vist at NCI-HO1 celler har lavere nivå av reaktive oksygenforbindelser [20].
A. HO-1 og TP mRNA og protein ekspresjon i NCI-H292-celler med HO-1 knockdown. NCI-Nrf2 og NCI-EV kontrollceller ble transfektert med 50 nM siRNA mot HO-1 (siHO1) eller kontroll egge sekvens (siSCR) i 72 timer som fører til nedregulering av ekspresjon TP følgende HO-en stanse. (N = 4, * p 0,05 NCI-Nrf2
vs
NCI-EV, # p 0,05 siHO1
vs
siSCR). B. Effekt av antioksidanter N-acetylcystein (NAC) på TP ekspresjon. NCI-EV-celler ble stimulert med indikerte konsentrasjoner av NAC i 24 timer resulterte i en doseavhengig oppregulering av TP. (N = 3, * p 0,05 kontroll
vs
stimulering).
TP overekspresjon demper spredning og migrasjon av NCI-H292-celler, men øker angiogenic potensialet i NSCLC cellelinjer
in vitro
Deretter rettet vi å undersøke de direkte effektene av TP selv om spredning og migrasjon av NCI-H292-celler. En stabil cellelinje overekspresjon både luciferase og TP (NCI-TP) ble etablert av retrovirale transduksjon og validert for TP uttrykk (Fig. 3A). Uventet, spredning av NCI-TP-celler ble hemmet (Fig.3B). Scratch-analysen viste at migrasjonspotensialet av NCI-TP-celler ble også svekket (figur 3C, File S2 . S3). Nedregulering av mRNA nivåer av matrix metalloproteinaser (MMP) MMP-1 og MMP-2 ble også observert (Fig. S4) som potensielt kan negativt påvirke tumorigent potensialet i NCI-H292-celler
in vivo
.
A. Validering av modellen – oppregulering av TP-mRNA og proteinnivåene i NCI-H292-cellelinjen som stabilt overekspresjon TP, etablert som beskrevet i Materialer og metoder (n = 3). B. Relative basale spredning forekomst av NCI-EV og TP-overekspresjon celler målt ved inkorporering av bromdeoksyuridin (BrdU) (n = 4). C. Basal migrasjon priser av NCI-EV og NCI-TP celler bestemmes av grunnen analysen (n = 4) (skala bar – 200 mikrometer) * p 0,05 NCI-TP vs NCI-EV
siden den store rolle TP i tumorvekst er antatt å være assosiert heller med sine proangiogenic egenskaper [23], vi neste fokusert på å belyse rollen til TP i modulering av angiogenese i vår NCSLC modell. Under standardbetingelser ingen effekt av TP overekspresjon /TP produkter på angiogene potensial på tumorceller kan bli observert (fig. S5). Likevel, den viktigste årsaken til angiogen bryter
in vivo
er oksygenmangel. Derfor, for å bedre etterligner miljøet av en voksende tumor, som er lagt inn vi cellene i henhold til hypoksi og forsynt dem med tymidin, som kan frigjøres fra den nekrotiske kjerne av tumor. Mens de inhiberende virkninger av TP-overekspresjon på proliferasjon og migrering i NSCLC-celler var upåvirket ved enten hypoksi og /eller tymidin (fig. S6), avslørte endrede betingelser forbedret angiogene potensialet av NCI-TP-celler, som gjenspeiles av Matrigel rør formasjonstest med kondisjonert media (fig. 4A). Den ble forbundet med oppregulering av IL-8-protein produksjon av tumorceller (Fig. 4B) og induksjon av HO-1 (fig. 4C) som kan være en indikasjon på økt oksidativt stress i TP-overekspresjon celler, noe som er konsistent med funnene fra andre tumortyper [5]. Viktigere, TP-overuttrykkende celler oppviste forbedret angiogen potensiale i nærvær av thymidin også under normoksisk betingelser (Fig. S7).
A. Økt angiogenic potensialet i TP overekspresjon celler i hypoksi i nærvær av tymidin. NCI-H292-celler ble stimulert med 1 mM Thd i 48 timer under 1% oksygen og kondisjonert medium ble påført på HMEC-1-celler sådd på Matrigel. Antallet branchpoints dannet av HMEC-en behandles med kondisjonert medium fra enten tom-vektor omformet NCI-H292-celler (NCI-EV) eller TP-omformet (NCI-TP) er beregnet (skala bar – 200 mikrometer) (n = 3). B. Fremstilling av angiogene faktorer i TP-overuttrykkende NCI-H292-celler under hypoxi i nærvær av 1 mM Thd i 24 kvantifisert ved hjelp av ELISA påvise oppregulering av IL-8 i NCI-TP-cellelinje (n = 4). C. Økt HO-1 mRNA (venstre) og protein (høyre) ekspresjon i TP-overuttrykkende celler i nærvær av 1 mM Thd i hypoksi etter 24 h (n = 3). * P 0,05 NCI-TP vs NCI-EV. D-I. Forbedret angiogenic potensialet i lunge plateepitelkarsinom SK-MES-1 og store cellekreft celler NCI-H460 følgende transient TP overekspresjon. SK-MES-1 (D-F, n = 3), og NCI-H460 (G-I, n = 4) celler ble transdusert med AdTP eller kontroll AdGFP i 48 timer, stimulert med 1 mM Thd i ytterligere 48 timer under ett % oksygen (D-E 0,05 AdTP vs AdGFP
Vi neste undersøkt om TP modulerer angiogenic potensialet av tumorceller som stammer fra andre NSCLC histologiske typer, nemlig plateepitelkarsinom SK-MES-en cellelinje og NCI-H460 stor cell carcinoma. Kondisjonert medium oppsamlet fra hypoksiske celler forbigående overuttrykker TP følgende adenoviral vektor transduksjon og stimulering med Thd forårsaket forbedret forgrening av endoteliale celler i forhold til å få tak AdGFP-transduserte celler for begge celletyper (fig. 4D, G), som ble ledsaget av økt produksjon av IL-8 ved SK-MES-1-celler (fig. 4E). Induksjon av HO-1 av TP ble observert etter normoksisk betingelser (Fig. 4F, I).
TP modulerer uttrykk av inflammatoriske cytokiner
in vivo
For å finne ut hvordan komplekse effekter av TP overekspresjon på spredning, migrasjon og angiogenic potensialet i NCI-H292-celler observert
in vitro
vil påvirke svulstutvikling
in vivo
, ble svulstceller implantert subkutant i nakne mus og tumorvekst ble overvåket i 5 uker. TP overekspresjon tendens til å akselerere veksten av NSCLC-xenotransplantater (figur 5A.) (S 0,1 NCI-TP
vs
NCI-EV på 4 og 5 uker). Videre NCI-TP svulster viste en ubetydelig tendens (p = 0,2) mot økt invasjon av tumor drenering lymfeknuter (Fig. S8). Som celleproliferasjon og migrasjon er svekket av TP overekspresjon (Fig. 3B-C), det antas at forskjellene i angiogene egenskaper. Faktisk måling av tumor-oksygenering utføres på slutten av forsøket viste at NCI-TP tumorer var betydelig bedre oksygenrikt enn tumorer avledet fra kontrollcellene, noe som sammenfaller med økt produksjon av hIL-8 i de tidligere tumorer (fig. 5B, C) . Viktigere i vår tidligere forskning ved bruk av NCI-H292 xenografter har vi vist at forbedret svulstoksygene bekrefter forbedret svulst vaskularisering i denne modellen [20]. Ikke desto mindre, selv om TP overekspresjon ble bekreftet å være holdt tilbake i xenotransplantater (fig. 5D, E), finnes det ikke noen forskjeller i nivåene av enten HO-1 eller andre angiogene faktorer kan bli detektert sammenlignet med kontrolltumorer (fig. 5D Fig. S9A -D). For bedre å forstå mekanismen bak effekten av TP overekspresjon på NSCLC
in vivo
, bestemt vi uttrykket av inflammatoriske cytokiner i svulstene. Human-interleukin-1 p og interleukin-6 nivåer ble signifikant økt i NCI-TP tumorer (figur 5F . G). Også uttrykket av TNFa tendens til å være høyere i TP-overekspresjon svulster, men det nådde ikke statistisk signifikans (Fig. S9E).
A. Måling av tumorvolumet av caliper. NCI-EV og NCI-TP-celler ble xenopodet inn i nakne mus som beskrevet i Materialer og Metoder. B. Måling av tumoroksygenering ved 5 ukers tumorvekst (n = 7 til NCI-EV, n = 9 for NCI-TP). C-G. mRNA (til venstre) og protein (høyre) ekspresjon av human IL-8 (C), HO-1 (D), TP (D, E) og inflammatoriske cytokiner (F-G) i xenograft tumorer indikerer oppregulering av sekresjon av IL- 8, IL-1β og IL-6 i NCI-TP-xenotransplantater (n = 5, * p 0,05 NCI-TP vs NCI-EV). H-J. mRNA uttrykk for TP (H) og inflammatoriske cytokiner (I-J) i biopsier fra humane primære og sekundære lunge adenokarsinomer.
Interplay av TP, HO-1 og inflammatoriske cytokiner i kliniske NSCLC prøver
Vi utførte foreløpig validering av våre funn ved hjelp av klinisk materiale av primære tumorer og tumor-infiltrert lymfeknuter samlet inn under en operasjon fra pasienter som lider av lunge adenokarsinom. Mens det ikke var noen forskjell i noen av TP, IL-1β eller IL-6 ekspresjon mellom de primære og sekundære tumorprøver (fig.5 HJ), er det bemerkelsesverdig at basal ekspresjon av TP var høy i forhold til konstitutivt genet EF2 i tumorvev (gjennomsnittlig TP /EF2 = 2,202), som er sammenlignbare med TP /EF2 nivåene oppnådd i våre TP-overekspresjon xenografter (gjennomsnittlig TP /EF2 = 1,027, se fig. 5E). De relative genet /EF2 forholdstall er også lik for interleukiner, som viser at vår xenograft modell tett parallell klinisk situasjon. Vi fant en signifikant korrelasjon mellom HO-1 og TP uttrykk (Spearman Rank Correlation, R = 0,556;
p
= 0,028). Hva mer er, en signifikant korrelasjon av TP med IL-1β (R = 0,514,
p
= 0,001) og IL-6 (R = 0,519,
p
= 0,002) ble observert dermed bekrefter våre data fra dyremodell viser en potensiell ny effekt av TP oppregulering i carcinoma av lungen.
TP overekspresjon forbedrer angiogenic potensialet i endotelceller
interleukin-1β ble demonstrert for å indusere uttrykk av TP i primærmakrovaskulær humane endotelceller HUVEC [24]. Vi gjengitt denne effekten i en human mikrovaskulær endotelceller linje HMEC-1 (fig. 6A), noe som tyder på at reguleringen var felles for forskjellige endothelial celletyper. Denne observasjonen reist et spørsmål om TP-avhengig oppregulering av inflammatoriske cytokiner i kreftceller kan muligens bidra til modulering av tumor angiogenese gjennom modulering av TP i endotelet. Derfor neste vi undersøkte effekten av TP overekspresjon i egenkapitalbevis. Innføring av TP i HUVEC forbedrede evner av endoteliale celler til å danne tubulære lignende strukturer i Matrigel og angiogen spirende i kollagen-gel (fig. 6B, C). Dette ble fulgt av induksjon av proangiogenic HO-1 (fig. 6D, E), som ble ytterligere forsterkes i HUVEC-celler i nærvær av overskudd av TP substrat (fig. 6E). I HMEC-1-modellen, ble det observert en samtidig økning av VEGF-produksjon følgende TP overekspresjon (figur 6F.), Mens ingen effekt kunne observeres for HUVEC (figur 6G.), Som ikke kan frigi VEGF [25] – [27]. Disse resultatene antyder en roman proangiogenic handling av TP innen egenkapitalbevis, eventuelt gjennom induksjon av andre angiogene proteiner. Mekanismen kan imidlertid være strengt endotelial celletypespesifikk.
A. Effekt av IL-1β på TP-ekspresjon i HMEC-1-celler. Stimulering med 0,3 ng /ml humant rekombinant IL-1β i 24 timer førte til oppregulering av TP i endotelceller (ECS). (N = 3, * p 0,05 kontroll
vs
IL-1β). B-C. ECS ble transdusert med adenovirale vektorer AdTP eller kontroll AdGFP ved MOI = 10 til 48 timer når Matrigel assay på HUVEC i nærvær av VEGF (50 ng /ml) (B) og sfæroide assay på HUVEC (VEGF 50 ng /ml) (C ) ble utført, noe som indikerer økt angiogenic potensialet i TP-overekspresjon celler (n = 3, * p 0,05 AdTP
vs
AdGFP, # p 0,05 kontroll
vs
VEGF) (skala bar – 100 pm) D-G. 24 timer etter transduksjon med AdV endotelceller ble stimulert med 1 mM Thd for neste 24 timer. Analyse av HO-1-ekspresjon ved kvantitativ PCR og western blot i HMEC-1 (D) og i HUVEC (E) viser induksjon av HO-1 i TP-overekspresjon ECS, assosiert med øket VEGF-ekspresjon i HMEC-1 (F) mens er det ingen effekt i HUVEC (G). (N = 4, * p 0,05 AdTP
vs
AdGFP, $ p 0,05 kontroll
vs
Thd).
Diskusjoner
den fremtredende funn i denne studien er demonstrasjonen at TP kan oppregulert i NCI-H292-celler ved aktivering av Nrf2 /HO-en sti eventuelt gjennom forbedring av oksidativt stress.
