Abstract
Bakgrunn
identifisering av nye prognostiske markører for prostata kreft er svært berettiget, siden det er vanskelig å identifisere pasienter som trenger kurativ behandling. Data fra både eksperimentelle modeller og kliniske prøver har identifisert viktige funksjoner av PDGFRp på pericytes og fibroblaster i svulsten stroma.
metodikk /hovedfunnene
I denne studien den prognostiske betydningen av PDGFRp i prostatakreft stroma, og i matchet ikke-ondartet vev, ble evaluert med immunhistokjemi. PDGFRp ekspresjon ble analysert i normale og tumor stroma fra mer enn 300 prostata kreftpasienter. Høy PDGFRp uttrykk i tumor stroma var forbundet med stor svulst størrelse, avansert stadium, høy Gleason score og høy fartøy tetthet. Perivaskulær PDGFRp farging i svulster ble også korrelert med høy Gleason score. Korrelasjoner ble også observert mellom PDGFRp status i tumor stroma og ikke-ondartet stroma. Tilsvarende høy PDGFRp uttrykk i tilstøtende ikke-ondartet vev stroma korrelert med stor svulst størrelse, avansert stadium, høy Gleason score og spredning i ikke-ondartet epitel. Interessant, var høye nivåer av PDGFRp i stroma av svulsten og ikke-ondartet vev forbundet med kortere kreft spesifikk overlevelse hos pasienter med prostatakreft.
Konklusjon /Betydning
Undersøkelsen avdekket en rekke roman assosiasjoner mellom stromal PDGFRp uttrykk i prostatakreft og flere viktige kliniske egenskaper, herunder overlevelse
Citation:. Hägglöf C, Hammarsten P, Josefsson A, Stattin P, Paulsson J, Bergh A, et al. (2010) stromal PDGFRp Expression i prostatakreft og ikke-maligne prostatavevet Spår prostatakreft overlevelse. PLoS ONE fem (5): e10747. doi: 10,1371 /journal.pone.0010747
Redaktør: Per Westermark, Uppsala Universitet, Sverige
mottatt: 03.03.2010; Godkjent: 30 april 2010; Publisert: May 20, 2010
Copyright: © 2010 Hägglöf et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble finansiert av frie midler fra en Linna tilskudd til STARGET nettverket fra Vetenskapsrådet og tilskudd fra svenske Kreftforeningen og Konung Gustaf Vs Jubileumsfond. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
tumor oppførsel er, generelt, i stor grad av egenskapene til tumor stroma. I tilfelle av prostatakreft dette er godt illustrert ved en serie av nylige studier som har identifisert stromale egenskaper og markører med prognostisk og svar-predikativ betydning.
Tumorer med den mest uttalt endring i stroma morfologi, karakterisert ved en store tap av glatte muskelceller og økninger i fibroblaster, myofibroblasts og kollagenfibre (reaktiv stroma grad 3), ha et dårlig resultat sammenlignet med de med stroma morfologisk mer lik den som er i normal prostatavev, dvs. reaktive stromaceller grad 1 og 2 [1]. Nyere studier har også vist at prostata cancer er kjennetegnet ved tap av androgen-reseptorer (AR) i stroma [2]. En lav frekvens av stromal AR ble koblet til øket Gleason score, metastase, dårlig respons på kastrering terapi og en ugunstig resultat. Videre stromale egenskaper, slik som angiogenese, akkumulering av makrofager, lymfocytter og mastceller, så vel som endringer i den ekstracellulære matriks har vært knyttet til variasjoner i prostata tumor oppførsel [3], [4], [5], [6], [7]. Spesielt, har det også blitt observert at kreftfeltvirkninger og /eller adaptive endringer kan endres stroma og kjertel epitelet i den omgivende ikke-ondartet vev i en prognostisk signifikant måte [2], [8], [9], [10] .
PDGF α- og β-tyrosin-kinase-reseptorer utøver viktige kontrollfunksjoner i mesenchymale celler, slik som pericytes, fibroblaster og vaskulære glattmuskelceller under utvikling [11], [12]. Eksperimentelle studier har identifisert forskjellige funksjonelle effekter av stromal PDGF-reseptor-signalering i forskjellige tumormodeller. Det har blitt demonstrert at parakrin aktivering av PDGF-reseptorer på fibroblaster virker som en potent signal for tumor stroma rekruttering [13], [14], [15]. Andre studier har vist terapeutiske fordelene med å målrette stromale PDGF-reseptorer som involverer enten direkte anti-tumorale effekt, så vel som fordelaktige effekter på tumormedikamentopptak [16], [17], [18], [19], [20]. Klinisk betydning av funnene fra eksperimentelle modeller er indikert ved en rekke studier som viser stromal PDGF-reseptor uttrykk i ulike menneskelige solide svulster [13]. Senest disse studiene har blitt supplert med analyser avslører at høy stromal PDGF-reseptor uttrykk er en markør for et ugunstig utfall hos brystkreftpasienter [21].
De biologiske effektene av PDGF reseptorer i tumor fibroblaster og pericytes sammen med bruk av legemidler med PDGF-reseptor-hemmende aktivitet, for eksempel imatinib, sorafenib og sunitinib, motiverer dermed en systemisk karakterisering av uttrykket mønster av PDGF reseptorer i humane solide svulster. For dette formål, beskrives denne studien ekspresjon av PDGFRp i ca 300 tilfeller av prostatakreft og i matchet omkringliggende ikke-ondartet prostatavevet, og også rapporter om sammenhengen mellom PDGFRp uttrykk og molekylære, histopatologiske og kliniske karakteristika.
resultater
Variabel PDGFRp uttrykk i normal og svulst prostatavevet
for å vurdere betydningen av PDGFRp i prostatakreft, en TMA inneholder matchet ikke-ondartede og svulstvev fra 377 pasienter med prostatakreft med opp til 25 års oppfølging ble analysert ved PDGFRp immunhistokjemi.
i overensstemmelse med tidligere studier, ble PDGFRp uttrykk hovedsakelig funnet i fibromuscular stroma og i perivaskulær celler (figur 1 og Tabell 1). I den ikke-ondartet prostata 27% og 18% ble scoret som å ha positiv PDGFRp uttrykk i fibromuscular stroma og perivaskulær celler, henholdsvis. Perivaskulær og stroma flekker ble ikke korrelert. I tumorområder var 34% positive i den fibroblast-lignende stroma og 17% i de perivaskulære celler. Farging i tumor stroma og rundt tumor blodkar ble korrelerte (Rs = 0,59). Signifikant sammenheng ble også observert mellom PDGFRp status i maligne og ikke-maligne stroma (tabell 1).
Avsnitt farget for PDGFRp fra ikke-ondartet (A, B og C) og tumor (D, E og F) vev fra pasienter med prostatakreft. Cases A og D viser negativ farging, B og E viser moderat stromal farging mens C og F presentere et sterkt stromal farging. Scale bar = 200 mikrometer.
I noen tilfeller PDGFRp uttrykk også variert i prostata vev av samme pasient (Figur S1).
stromal PDGFRp uttrykk oppstår hovedsakelig i αSMA-positive celler
for ytterligere å karakterisere stromal PDGFRp uttrykk, en dobbel farging ble utført med antistoffer mot αSMA og PDGFRp.
Disse analysene bekreftet at flertallet av PDGFRp uttrykk i ikke-ondartet fibromusclar og fibroblast-lignende tumor stroma skjedde i αSMA-positive celler (figur 2). Videre analyser viste også nærvær av αSMA-positive celler i stroma av tumor- og ikke-maligne vev som ikke viste noen stromal PDGFRp uttrykk.
dobbelts stainings av prostatavev med PDGFRp (grønn) og αSMA (rød) i ikke-ondartet vev (A og B) og tumorvev (C og D). Scale bar = 100 mikrometer.
Disse funnene dermed bekrefte eksistensen av undergrupper av stromale αSMA-positive celler, som varierer med hensyn til PDGFRp uttrykk.
stromal og perivaskulær PDGFRp flekker i prostatakreft er korrelert med prognostiske markører
Analyser ble utført for å undersøke mulige sammenhenger mellom PDGFRp uttrykk i svulster og kliniske parametre eller histologiske kjennetegn ved svulster.
tilstedeværelse av PDGFRp flekker i fibroblast- som tumor stroma var signifikant positivt korrelert med store tumorstørrelse, avansert stadium, høy Gleason poengsum og høy tetthet fartøy (tabell 1). Hos pasienter med Gleason scorer 4-6 eller Gleason score 7 svulst, bare ca 20% av svulstene viste stroma PDGFRp flekker, men det var betydelig mer vanlig i tilfeller med Gleason score 8-10 tumorer (figur 3 A).
PDGFRp flekker i tumor stroma var mer vanlig i tilfeller med Gleason score 8-10 svulster sammenlignet med pasienter med en Gleason score 4-6 eller Gleason score 7 (A). Tilstedeværelse av PDGFRp farging var mer vanlig i normal prostata vev stroma når en Gleason score 8-10 tumor var til stede i prostata forhold til om svulsten hadde Gleason scorer 4-6 (B).
perivaskulær PDGFRp uttrykk i tumorområdet ble også positivt korrelert med avansert stadium, svulst fartøy tetthet og høy Gleason score (data ikke vist).
Sammen disse funnene demonstrerer tidligere FN-anerkjent assosiasjoner mellom stromal og perivaskulær PDGFRp uttrykk i prostatakreft og egenskaper knyttet til en mer aggressiv kreft fenotype.
stromal PDGFRp flekker i tilstøtende ikke-ondartet vev er korrelert med prognostiske markører
PDGFRp uttrykk i tilstøtende ikke-ondartet vev ble også analysert med hensyn til forbindelser med tumoregenskaper (Tabell 1).
høy PDGFRp i ikke-ondartede, ble fibromuscular stroma korrelert med store tumorstørrelse, avansert stadium, epitelcelleproliferasjon og høy Gleason score (tabell 1). Det var betydelig mer vanlig å finne PDGFRp uttrykk i det normale prostatavev stroma når en Gleason ballen 8-10 svulst var tilstede andre steder i organet i forhold til om svulsten var Gleason ballen 4-6 (figur 3 B).
perivaskulær PDGFRp uttrykk i den omgivende ikke-ondartet vev ble også positivt korrelert med epitelcelleproliferasjon (data ikke vist).
Disse analyser således foreslår nye forbindelser mellom prostata-kreft egenskaper og fenotypen av stroma av ikke-ondartet prostatavevet ved siden av prostatakreft.
stromal PDGFRp uttrykk i tumorer og i den ikke-ondartet prostatavevet rundt svulster spår kreft spesifikk overlevelse
resultatene fra analysene av PDGFRp uttrykk var endelig kombinert med overlevelsesdata for å undersøke mulig prognostisk betydning.
cut-offs for svulst stromal PDGFRp og ikke-maligne stromal PDGFRp i analysene ble satt til den tredje kvartil, tilsvarende 1,0 og 0,5 for svulst og ikke -malignant stromal PDGFRp flekker, dvs høy PDGFRp immunoreaktivitets var ≥1.0 for svulst og ≥0.5 for ikke-ondartet stroma.
Kaplan-Meier analyse viste at vaktsomme venter pasienter med høyest kvartil av PDGFRp uttrykk i tumor stroma hadde en vesentlig kortere kreft spesifikk overlevelse sammenlignet med resten (15-års sannsynlighet for overlevelse (P-EFS) var 67 ± 5% og 34 ± 9% i de to gruppene) (figur 4 A).
Pasienter delt i to grupper avhengig av stromal ekspresjon av PDGFRp i tumor (A) og tumorer (B) ikke-ondartet prostatavevet rundt. Solid linje, høy PDGFRp i tumor stroma (≥1.0); stiplet linje, lav PDGFRp i tumor stroma ( 1,0; A). Solid linje, høy PDGFRp i ikke-ondartet stroma (≥0.5); stiplet linje, lav PDGFRp i ikke-ondartet stroma ( 0,5; B).
Interessant nok høy ekspresjon av PDGFRp i stroma av tilstøtende normalt prostatavev ble også forbundet med et betydelig redusert overlevelse i pasienter administrert av vaktsom venter (15 år P-EFS ble 68 ± 5% og 41 ± 9% i de to gruppene) (figur 4 B).
Høy svulst og ikke-ondartet stroma PDGFRp farging ble assosiert med en økt relativ risiko for prostatakreft spesifikk død i en univariat Cox regresjonsanalyse (tabell 2). I multivariat Cox regresjonsanalyse inkludert den kjente prognostiske markør GS og lokal tumorstadium, høy stromal PDGFRp i tumor og ikke-ondartet vev var ikke en uavhengig prognostisk markør (data ikke vist).
Diskusjoner
den nåværende analyser avdekket et sett av nye assosiasjoner mellom svulsten stroma PDGFRp status og histopatologiske egenskaper, herunder positive korrelasjoner med Gleason score, tumorstadium og tumorstørrelse (tabell 1). Disse funnene er minner om den nylig beskrevet situasjonen i brystkreft hvor stromal PDGFRp uttrykk var positivt korrelert med høy grad [21]. Disse funnene reise spørsmålet om den underliggende mekanismen (e). Per nå er det ikke mulig å konkludere med om foreninger er forårsaket av en epitelial-indusert stromal fenotype eller ved et stroma-indusert epitelial fenotype.
Analysene i denne studien også viste signifikante sammenhenger mellom kliniske kjennetegn, herunder overlevelse, og stromal PDGFRp uttrykk i den ikke-ondartet vev tilstede (tabell 1). Denne observasjonen av prognostisk signifikante egenskapene til den ikke-ondartet vev legger til en serie av lignende observasjoner som til sammen har ført til forslag betegnelsen «tumor som indikerer ikke-ondartet vev» (NYANSE), som innebærer at analyser av ikke-ondartet prostatavevet mulig gi prognostisk informasjon [2], [10]. Andre nyere studier har presentert lignende funn følgende analyser av f.eks pakt, pEGFR og AR [2], [10], [22]. Fra et praktisk perspektiv er dette viktig siden mange diagnostiske biopsier bare prøve ikke-ondartet vev.
Den underliggende biologi av variasjonene i stromal PDGFRp uttrykk burde være bedre avklart. Fra den foreliggende analyserer det er uklart om forandringer i den ikke-ondartet vev er sekundær til nærværet av nær-ved ondartet vev som foreslått i dyremodeller [8], eller hvis det snarere gjenspeiler en tumor-permissive miljø som årsaks bidrar til dannelsen av flere ondartede svulster.
analysene inkludert dobbel farging med αSMA og PDGFRp antistoffer avslørte at PDGFRp uttrykk skjedde i αSMA-positive celler (figur 2). Det ble imidlertid også bemerket at disse celler i tumorer skåret til å ha en PDGFRp-positiv stroma, forekom sammen med αSMA -positivt /PDGFRp-negative celler. Disse funnene således klart eksemplifisere den molekylære heterogenitet blant celler av ikke-maligne fibromusclar stroma og av fibroblast-lignende tumor stroma. Lignende funn er gjort i eksperimentelle tumorer [23]. Som også foreslått av andre [24], skal funnene stimulere til en bedre klassifisering av disse undergruppene, og fortsatte analyser av funksjonell betydning.
De assosiasjoner mellom høy stromal PDGFRp uttrykk og kortere overlevelse indikerer at denne reseptoren er årsaks bundet til det kliniske forløpet av sykdommen, og således også antyder målretting av PDGF-reseptorer for terapeutiske formål. Noen mindre studier har blitt rapportert der imatinib har blitt brukt i prostata cancer, uten noen åpenbare effekter [25], [26]. Resultatene fra denne studien viser store variasjoner i stromal PDGFRp uttrykk, tyder på at fremtidige studier som evaluerer denne tilnærmingen vil kreve strengere rutiner for pasientseleksjon. I denne sammenheng kan det også legges merke til at epitel-PDGFRp ekspresjon ble bare sjelden detektert i denne studien (data ikke vist). Videre ble det ikke observert noen sammenheng mellom dette uttrykket og kliniske eller histopatologiske egenskaper.
En rekke temaer for fremtidige studier er foreslått av dagens funn. Eksperimentelle studier med co-kulturer av epitelceller og stromale celler skal bidra til å avklare om stroma-epitelial foreninger har sin dominerende mekanistisk grunnlag i stromal eller epithelial rommet. Et annet interessant tema for fremtidige studier vil være å undersøke i hvilken grad stromal og epitelceller fenotyper er knyttet til individuelle prostata kreft risikogener. Til slutt blir fortsatte analyser er nødvendig for å forstå hvis de tumorassosierte variasjoner i den ikke-ondartet vev er en årsak eller en konsekvens av tumordannelse. Forsiktig vev analyser i prospektive studier kan være nødvendig for å avklare dette spørsmålet.
Materialer og metoder
Pasienter og vev microarray
Vevsprøver ble samlet fra pasienter som gjennomgikk transurethral reseksjon av prostata (TURP) ved sykehuset i Västerås, Sverige, mellom 1975 og 1991. Histologisk analyse viste tilstedeværelse av prostatakreft. Median alder ved TURP var 74 år (spredning 51-95 år). Opplysninger om fravær eller tilstedeværelse av benign prostata hyperplasi var ikke tilgjengelig. Vevsprøver ble formalinfiksert og parafin-embedded fulgt av regrading henhold til Gleason systemet. Prøvene ble brukt til å konstruere en vev micro array (TMA) med en Beecher Instrument (Sun Prairie, WI, USA). Den TMA: s inneholdt 5-8 prøver av svulstvev som representerer både primære og sekundære Gleason grad og 4 prøver av ikke-ondartet vev fra hver pasient. Pasientene hadde ikke fått noen anti-kreft terapi før TURP. Radio nuklide bein skanning ble utført kort tid etter diagnose for deteksjon av metastaser. Det var 377 pasienter inkludert i studien, hvorav 293 pasienter ble fulgt med vaktsom venter etter TURP. Ved symptomer fra metastaser pasienter fikk palliativ behandling med androgen ablasjon og i noen tilfeller strålebehandling eller østrogenbehandling, i henhold til terapitradisjoner i Sverige i løpet av den tiden. Dessuten ble 84 pasienter som ble behandlet med palliativ behandling umiddelbart etter diagnose analysert. Median total overlevelse for pasientgruppen følges med vaktsom venter var 5,6 år. Ninety-to av de TURP prøvene ble gradert som Gleason score (GS) 4-5, 107 pasienter som GS 6, 63 pasienter hadde GS 7, og 115 pasienter GS 8-10. 3 pasienter (4,1%) med GS 6, 4 pasienter (8,2%) med GS 7, og 33 pasienter (33,7%) med GS 8-10 hadde skjelettmetastaser ved diagnose. I august 2003 36 pasienter (9,5%) var fortsatt i live, 131 pasienter (34,7%) døde av prostatakreft og 210 pasienter (55,7%) hadde dødd av andre årsaker. Materialet ble samlet i henhold til svensk lov i en tid da informert samtykke ikke var nødvendig. Den forskningsetiske komité ved Umeå universitet sykehus (Regional Etisk Review Board i Umeå) godkjent av studien og fravikes behovet for samtykke.
I dette materialet har vi allerede analysert faktorer av potensialet prognostisk betydning som Gleason score, tumorvolum, tumorstadium, tumorcelle-proliferasjon og vaskulær tetthet, og de oppnådde data ble nå knyttet til den nåværende PDGFRp funnene [2], [27].
PDGFRp immunhistokjemi
PDGFRp immunhistokjemi ble utført som beskrevet i Nupponen
et al
2008 [28]. Anti- PDGFRp (kanin monoklonalt, # 3169, Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA) ble anvendt ved en konsentrasjon på 2 ug /ml. Den fargeintensitet ble scoret separat i stroma og rundt fartøy som negative (0), svak (1), moderat (2) eller sterk (3). Den PDGFRp farging poengsum er medianverdier på fem til åtte scoret prøver av tumorvev eller fire scoret prøver av ikke-ondartet vev. For korrelasjonsanalyse prøvene ble bedømt som positive for PDGFRp hvis farging ble påvist i minst én av de TMA-kjerner.
Immunofluorescence
immunofluorescerende stainings av TMA ble utført som ovenfor (i immunhistokjemi -delen) fram til inkubasjon med anti PDGFRp antistoff. Snittene ble deretter vasket i PBS med 0,1% Tween-20 (PBT) 3 x 5 min. Dette ble etterfulgt av en 1 timers inkubasjon med den andre primære antistoff, mus monoklonalt αSMA (M0851, klon 1A4, Dako Cytomation, Glostrup, Danmark) fortynnet 1:100 i 20% geiteserum i PBT. Etter vasking i PBT i 3 x 5 minutter, ble objektglass inkubert med biotinylert geit-anti-mus-antistoff (E0432, Dako Cytomations 1:500) i 45 minutter ved RT. Dette ble etterfulgt av ytterligere 3 x 5 min vask i PBT. Platene ble deretter inkubert med Alexa-mel 488 geite-anti-kanin-sekundært antistoff (A11008, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) fortynnet 1:100 i PBT i 45 minutter ved RT. Etter vask; lysbildene ble inkubert i 45 min med Cy3-streptavidin-konjugat (Sigma-Aldrich) fortynnet 1:500 i PBT i 45 minutter ved RT. Etter vask lysbildene ble tørket og montert med Vectashield montering medium med DAPI (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA).
statistikker
bivariate sammenhenger ble beregnet med Pearsons korrelasjon test. Sammenhenger mellom kategoriske variabler og kontinuerlige variabler ble analysert ved hjelp av Spearman rang korrelasjon test. Data ble samlet inn ved prostatakreft diagnose.
Pasienter inkludert i overlevelse analyser med Kaplan-Meier og Cox regresjon ble fulgt med vaktsom venter. Varigheten av overlevelse (EFS) er definert som tiden fra TURP frem til dato for prostatakreft død, død av annen årsak, eller frem til dato for siste oppfølging. Hendelse i overlevelsesanalyse ble definert som prostatakreft død, og dermed viser cancer-spesifikk overlevelse. Forskjeller i utfallet ble testet med log-rank test. Den prognostisk betydning PDGFRp immunoreaktivitet ble evaluert med Cox regresjonsanalyse alene og i kombinasjon med GS og lokal tumorstadiet. Sannsynligheten for overlevelse (P-EFS) er presentert ± standard feil (SE). Nivået av statistisk signifikans ble definert som
P
0,05 (tosidig). Statistisk analyse ble utført ved hjelp av SPSS 17.0.0 programvare for OS X (SPSS Inc., Chicago, IL, USA).
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
PDGFRp uttrykk varierer fra tid til annen i løpet av prostatavevet av den samme pasient. Heterogene PDGFRp fargemønstre ble observert i mange tumorer. A og B viser forskjellige deler av det samme prostatakreft. Scale bar = 200 mikrometer
doi:. 10,1371 /journal.pone.0010747.s001
(7,24 MB EPS)
Takk
Medlemmer av laboratorium på bl.a. er anerkjent for produktive og støttende kommentarer gjennom hele prosjektet.
