Abstract
Bakgrunn
Kronisk betennelse forbundet med ulcerøs kolitt predisponerer individer til økt tykktarmskreft risiko. Målet med disse studiene var å identifisere microRNAs som er avvikende regulert ved betennelse og kan delta i transformasjon av colonic epitelceller i den inflammatoriske innstillingen.
Metodikk /hovedfunnene
Vi har bruker kvantitativ PCR arrays for å sammenligne mikroRNA (miRNA) uttrykk i tumorer og kontrollere colonic epitelceller isolert fra distale kolon av kronisk betente mus og APC
Min /+ mus. Rank ordrestatistikk ble brukt til å identifisere differensielt regulerte mirnas i svulster som oppsto på grunn av kronisk betennelse og /eller germline APC mutasjon. Åtte høyt prioriterte mirnas ble identifisert: MIR-215, MIR-137, MIR-708, MIR-31, og MIR-135b ble uttrykt forskjellig i APC svulster og MIR-215, MIR-133a, MIR-467d, MIR-218, MIR-708, MIR-31, og MIR-135b i kolitt-assosiert svulster. Fire av disse (MIR-215, MIR-708, MIR-31, og MIR-135b) var felles for begge svulster typer, og feilregulering av disse miRNAs ble bekreftet i en uavhengig prøvesett. Målet prediksjon og sti analyse tyder på at disse microRNAs, i aggregatet, regulere signalveier i forbindelse med MAPK, PI3K, WNT, og TGF-β, som alle er kjent for å være involvert i transformasjonen.
Konklusjoner /Betydningen
Vi konkluderer med at disse fire mirnas er dysregulerte på et svært tidlig stadium i transformasjon av colonic epitelceller. Denne reaksjon er ikke avhengig av mekanismen for initiering av transformasjonen (betennelse i forhold til kimlinje-mutasjon), noe som tyder på at mirnas som vi har identifisert er sannsynlig å regulere signalbaner som er sentrale for tidlige hendelser i transformasjon av colonic epitelceller.
Citation: Necela BM, Carr JM, Asmann YW, Thompson EA (2011) Differential Expression of microRNAs i svulster fra kronisk betent eller genetisk (APC
Min /+) modeller for tykktarmskreft. PLoS ONE 6 (4): e18501. doi: 10,1371 /journal.pone.0018501
Redaktør: Eliana Saul Furquim Werneck Abdelhay, Instituto Nacional de kreft, Brasil
mottatt: 31 januar 2011; Godkjent: 01.03.2011; Publisert: 12. april 2011
Copyright: © 2011 Necela et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble finansiert delvis av en CCFA Career Development Award til BMN. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
microRNAs (mirnas) er en klasse av små ikke-kodende RNA fra 19 til 22 nukleotider involvert i en rekke viktige cellulære prosesser som utvikling, differensiering, proliferasjon, cellesyklusprogresjon, apoptose, betennelse, og stressresponser [ ,,,0],1] – [8]. MicroRNAs er generelt antas å virke ved å binde 3’UTR av mål-mRNA og enten inhibere oversettelse eller i noen tilfeller som induserer mRNA degradering [3], [9]. Bioinformatiske studier tyder på at mirnas kan regulere en tredjedel av transkriptomet [10], [11]. Gitt deres tilbøyelighet til å regulere en rekke prosesser og målgener, er det ingen overraskelse at avvikende ekspresjon av mirnas har blitt knyttet til en rekke patologiske tilstander, slik som astma, diabetes, nyre, neurodegenerative, og kardiovaskulær sykdom. Spesielt har differensial miRNA uttrykk vært innblandet i mange kreftformer, inkludert bryst, skjoldbruskkjertelen, lunge, bukspyttkjertel, og tykktarmskreft.
Til dags dato, over et dusin studier har rapportert en sammenslutning av avvikende miRNA uttrykk i tykktarmskreft [ ,,,0],12] – [31]. Uttrykk av miRNAs i kolon svulster kan påvirkes av en rekke clinicopathologic variabler som svulsten klasse og plassering, mutasjonsstatus (p53, APC, MSI) [32] – [36], og celleinnhold (
dvs.
betennelsesceller ) samt pre-analytisk og analytiske variabler ekstraksjonsmetode, fiksering, og valg av analyseplattform (sekvens, qPCR, eller mikroarray). Som et resultat av disse variablene, er det ingen enighet om hvilken mirnas blir uttrykt forskjellig i colontumorer. Likevel har noen microRNAs konsekvent dukket opp som blir dysregulerte i tykktarmskreft. Blant disse, er MIR-31 konsistent oppregulert [12] – [17], [20], [22], [23], [25] og mikroRNA klynger MIR-143 /-145 [18], [21] – [ ,,,0],23], [37] – [40] og MIR-194 /-215 [18], [21] – [23], [37], [38], [41] nedregulert i tykktarmskreft. MikroRNA -31 har vært knyttet til cellemigrering og invasjon i tykktarmskreftceller [42], [43]. MicroRNAs -192 og -215 hemme celleproliferasjon og induserer cellesyklus arrest i en p53-avhengig måte [37], [44], [45]. Likeledes MIR-143 og MIR-145 hemmer cellevekst, med denne handlingen, delvis tilskrives gjennom hemming av målgener som DNMT3A, IRS-1, Ja1, STAT1, og FLI1 [21], [46] – [ ,,,0],50].
en klinisk variabel som ikke er blitt tilstrekkelig behandlet er inflammatorisk status av kolon tumor. En direkte kobling mellom betennelse og kreft har blitt godt etablert, med NFkB fremstår som en nøkkelspiller [51], [52]. Betennelse antas ikke bare å endre og fremme svulsten mikromiljøet, men i seg selv kan føre direkte til tumorigenesis. Pasienter med ulcerøs kolitt, en kronisk, relapsing betennelse i tykktarmen, har økt risiko for å utvikle tykktarmskreft. En fersk meta-analyse viste sannsynligheten for tykktarmskreft ved ulcerøs kolitt på 2% etter 10 år, 8% etter 20 år, og 18% etter 30 år med sykdom [53]. En mulig mekanisme hvormed inflammatoriske veier kan påvirke transformasjon er ved deregulering av miRNAs. Økende bevis tyder på at mirnas er i stand til å regulere inflammatoriske prosesser og er dysregulerte i forskjellige inflammatoriske sykdommer [54]. Nylig, feilregulering av microRNAs har blitt observert hos pasienter med ulcerøs kolitt [55], [56]. Men lite er kjent om den funksjonelle konsekvens av feilregulering av miRNAs under kronisk kolitt i epitelceller, og enda mindre på tumorigenesis. Selv begrenset, disse undersøkelser gir precident at deregulering av en undergruppe av microRNAs ved kronisk kolitt kan være assosiert med neoplastiske og metaplastiske metaplastiske transformasjon. For dette formål kan microRNAs være nyttige biomarkører for å bidra til å forutsi risiko for malignitet hos pasienter med langvarig aktiv sykdom.
De som er beskrevet nedenfor ble gjennomført studier for å begynne å teste hypotesen om at en undergruppe av microRNAs er dysregulerte i tarmepitelet under kolitt og bidra til kreftutvikling. Vi målte mirnas ved kvantitativ PCR med lav densitet TaqMan matriser ved hjelp av RNA ekstrahert fra colonic epitelceller hos mus indusert med akutt dekstransulfat kolitt (AC), kronisk kolitt (CC), kolitt-assosiert colontumorer (CAC), og colontumorer i APC
Min /+ mus. Vi identifiserte differensial uttrykk for miRNAs vanlige og unike for hver sykdom tilstand. Spesielt viser vi at en undergruppe av miRNAs er feilregulert i begge svulster i både provoserende og genetisk opprinnelse. Disse mirnas har potensial til å kontrollere både anti-onkogene og pro-onkogene transkripsjons nettverk og dermed påvirke tumorigent utfallet.
Resultater
Sammenligning av analytiske modeller ved hjelp av akutt kolitt (AC) prøver
Kvantifisering av miRNA ekspresjon i vevsprøver er komplisert ved det faktum at man har ingen åpenbare direkte måte for å identifisere egnede endogene kontroller som kan brukes til å normalisere uttrykk data og korrigerer for forskjeller i mengden av RNA analyseres eller effektiviteten av miRNA utvinning eller cDNA konvertering i prøver fra ulike vev. Dette potensielle problemet er spesielt akutt i studiene slik som de som vil bli beskrevet nedenfor, hvor vi forsøker å sammenligne miRNA overflod i vev avledet fra mus i forskjellige aldre, dietter, inflammatorisk status og tumorbyrde. Det ble derfor gjennomført en pilotforsøk for å sammenligne ulike analyseverktøy og statistiske modeller for å identifisere differensielt regulerte mirnas i colonic epitelceller. For dette formål ble ekstrahert vi mirnas fra epiteliale cellepreparater fra distale kolon kontroll C57BL /6J mus og mus som var blitt utsatt for 3.5% DSS i drikkevannet i fire dager. Histologisk kolon fra kontroll og DSS-behandlede mus ble utvisket, uten tegn til barriere sammenbrudd, krypt tap, eller invasjon av immunceller. Selv om disse vev formelt representerer en pre-betent tilstand, vil prøvene bli utpekt AC (akutt kolitt) i følge diskusjonen, mens kontrollene vil bli identifisert som Con.
Vi brukte AB TAQMAN arrays for å måle overflod av 384 miRNAs i AC og Con prøver, uttrykt som kritiske terskler (CT) for hver miRNA detektor. Tre analytiske tilnærminger ble sammenlignet. Den enkleste av disse var rang ordrestatistikken. Hver miRNA innen en gitt prøve ble kraft rangert på analog avlesning av miRNA overflod (Ct-verdi). Detektorer som ble scoret som «usynlige» ble tildelt Ct-verdier på 40, og alle mirnas med Ct = 40 ble tildelt samme rang innenfor en prøve. En t-test (forutsatt ulik varians) ble deretter utført for å sammenligne rang ordre oppdrag av mirnas i de to ulike utvalgsgrupper, slik som å identifisere mirnas som gjennomsnittet rangordnet uttrykk endret seg betydelig som følge av behandlingen. Den andre analytiske metode som er involvert en enkel median normalisering av prøvene, etterfulgt av en t-test (forutsatt ulik varians) for å sammenligne Ct-verdier mellom Con og AC-prøver. Differensiell uttrykk er uttrykt som ΔCt (forkortet DCT), som representerer (meanCtMed_Norm_AC) – (meanCtMed_Norm_Con). Den tredje metoden som anvendes i Integromics Statminer pakke, som bruker en Limma basert empirisk Bayesian gjennomføring for å beregne en hyperparamter som i sin tur brukes til å modulere varians og øke antall frihetsgrader over prøvene. Den Statminer pakken beregner også variansen blant brukerdefinerte endogene kontroller og identifiserer de med minst varians på tvers av alle prøvene. Den Statminer pakke gjør at flere endogene kontrollene som skal brukes til å normalisere datasettet. I vårt tilfelle de minst variant endogene kontroller var sno135 og MIR-25, og disse ble brukt for å normalisere dataene. Differential uttrykk uttrykkes som ΔΔCt (forkortet DDCt), som representerer (meanΔCtLimma_SM_Tumor) – (meanΔCtLimma_SM_Con) Dermed har vi sammenlignet en relativt enkel modell der ble gjort noen forsøk på å normalisere data (rang ordrestatistikk, forkortet Rnk_Diff), en enkel median normalisering modell (Med_Norm), og en mer komplisert empirisk Bayesiansk modell som brukes flere endogene kontroller for å normalisere data (Limma_SM).
en sammenligning av endringene i stigende rekkefølge av individuelle mirnas (Rank forskjell AC-Con) og den log2 ganger endring fra mediannormaliserte data [Median normalisert DCT (AC-Con)] er vist i figur 1 A, mens en tilsvarende sammenligning av log2 gangers endring etter Limma normalisering til sno135 og MIR-25 [DDCt (AC-Con)] er vist i figur 1B. Elingene er åpenbart nesten identiske, som vist ved Spearman rang korrelasjonskoeffisienter på 0,8324 og 0,8328 til figur 1A og B, respektivt. Denne likheten resultater fra nær identiteten uttrykket data beregnet fra median normalisert og Limma-normaliserte data (figur 1C, Spearman rang korrelasjonskoeffisient = 0,9996). Observasjonen at to svært ulike normaliserings protokoller ga hovedsak identiske resultater indikerer sannsynligvis at det er svært lite variasjon, enten analytisk eller biologisk blant våre eksempler.
Endringer i stigende rekkefølge, definert som gjennomsnittlig rang i AC prøvene minus bety rang i Con prøver, er plottet mot DCT verdier (gjennomsnitt Ct_AC minus betyr Ct_Con) i Panel A eller DDCt (gjennomsnittlig DCt_AC minus bety DCt_Con) i panel B. Limma normalisert DDCt verdier for enkelt mirnas er plottet mot mediannorm DCT verdier i felt C . forskjellig uttrykt mirnas ble filtrert på P 0,01 og rang for endring ≥10 eller log2 ganger endring ≥1.0. Overlapping mellom forskjellig uttrykt mirnas identifisert av rang ordrestatistikk (Rnk_Diff), t-test med median normaliserte data (Med_Norm), eller Statminer implementering av Limma (Limma_SM) er vist i panel D.
Bruk disse tre tilnærmingene vi identifisert 193 mirnas som ble scoret som signifikant forskjellig (P≤0.01) i ett eller flere av analysene (oppført i tabell S1). Vi pålagt flere filtre av rang forskjell ≥ (± 10) og P≤0.01 å identifisere 73 forskjellig uttrykt mirnas av rang ordrestatistikken. Når vi filtrert på log2 fold change≥ (± 1,0) og P≤0.01 vi identifisert 130 mirnas som ble forskjellig uttrykt i median normalisert analyse og 134 mirnas som ble forskjellig uttrykt av Limma analyse. En VENN diagram av overlapping mellom disse mirnas er vist i figur 1D. Noe til vår overraskelse, var det bare 51 mirnas som oppfylt alle betingelser for alle modeller. En tredimensjonal sammenheng å sammenligne rang forskjell, DCT (median normalisering), og DDCt (Limma normalisering) viste en tre-dimensjonal korrelasjonskoeffisient på 1,00 for disse 51 prøver (data ikke vist). Disse mirnas representerer høy sannsynlighet mål som er egnet til å spille noen rolle i de aller tidligste stadier av betennelse. (Disse mirnas er identifisert med fet skrift i tabell S1.) Både median normalisering og Limma ga et signifikant antall utliggere, mens rangordnet statistisk analyse oppviste nesten fullstendig overlapping med i det minste en av de andre modellene (Fig. 1D).
Vår konklusjon fra denne innledende sammenligning av tre ulike normaliserings metoder er at de alle gir svært like resultater, i form av relativ miRNA overflod, i et datasett med lite analytisk og biologisk variasjon innenfor kontroll og eksperimentelle grupper. De ulike statistiske modeller gi signifikant forskjellige p-verdier, noe som sannsynligvis skyldes i stor grad til den lille antall prøver som ble inkludert i denne analysen, så vel som anvendelse av modererte varians (Limma) versus moderert varians (t-test). Samlet rang ordrestatistikk fungerer minst like bra som noen av de normaliserte modeller, har en tendens til å være mer konservativ når det gjelder antall differensielt regulerte miRNAs, og har de ekstra fordelene som det krever ingen kunnskap om aktuelle endogene kontroller og gjør ingen forutsetninger om like mengder RNA eller lik effektivitet av miRNA utvinning eller cDNA konvertering fra prøve til prøve. Vi har derfor valgt å gå videre med våre analyser ved hjelp av rang ordrestatistikken for å identifisere forskjellig uttrykt miRNAs. Men endringer i stigende rekkefølge er ikke informativ i form av absolutt (eller mer presist analog) miRNA overflod, så vi er avhengige Limma å beregne normalisert overflod, uttrykt som DDCt, noe som tilsvarer -log2 ganger endring normalisert til sno135b /MIR-25 .
Identifikasjon av forskjellig uttrykt miRNAs i eksperimentelle modeller av kolitt-assosiert kreft i tykktarmen og familiær adenomatøs polypose coli
Vi brukte AB TaqMan miRNA arrays for å måle overflod av 384 miRNAs i tumorer isolert fra distal kolon av APC
Min /+ mus (APC svulster) og svulster som dannes i distale kolon av kronisk betente mus (CAC svulster). APC
Min /+ mus ble pensjonert oppdrettere, 120d av alder, og opprettholdt det høye fett oppdretter chow. CAC tumorer ble isolert fra mus som var blitt utsatt for 12 runder med lavt nivå, inflammasjon indusert av DSS som beskrevet i Materialer og Metoder. Som kontrollprøver, isolert vi epitelceller fra tilstøtende, uninvolved epitel fra APC
Min /+ (APC kontroll) eller kronisk betente (CC kontroll) mus. Rank ordrestatistikk ble brukt til å identifisere kandidat forskjellig uttrykt mirnas i APC og CAC svulster. (Raw Ct-verdier for disse prøver er gitt i Tabell S2.)
Ct-verdier av alle mirnas i individuelle tumorer og kontrollprøver ble bestemt og kraft rangert som beskrevet ovenfor, og t-test ble anvendt for å identifisere mirnas hvis midlere rang var signifikant forskjellig i kontroller og svulster. Den gjennomsnittlige rangeringen ordre for enkelte mirnas fra APC kontroll og APC svulster er vist i figur 2A. Det var generelt et godt samsvar mellom rangordnet miRNA overflod i APC-kontroll og APC tumorprøver (Spearman Rank Order korrelasjonskoeffisient = 0,973, p = 2.0E
-07), men 10 mirnas (vist som røde symbolene ) falt utenfor 95% prediksjon intervaller (vist som parallelle linjer i fig. 2A).
Mean rang bestillinger av miRNA overflod (basert på Ct-verdiene) ble bestemt for svulster fra den distale kolon eller uninvolved tilstøtende distal colonic epiteliale celler (panel A). SigmaStat ble brukt til å beregne 95% konfidensintervall for disse dataene (parallelle heltrukne linjer) og miRNA detektorer som falt utenfor disse intervallene er fylt med rødt. På samme måte vi sammenlignet rangordnet uttrykk for miRNAs fra svulster som dannes i distale kolon av kronisk betente mus (CAC) og i uninvolved, kronisk betente distale colonic epiteliale cellepreparater (CC kontroller), som vist i panel B. mikroRNA detektorer som falt utenfor de 95% konfidensintervall er fylt med rødt.
Figur 2B sammen rang bestillinger av overflod av miRNAs målt i CCcontrol og CACtumors prøver. Som med APC prøvene, var det et generelt høyt samsvar mellom rang for overflod av miRNAs i disse prøvene (Spearman Rank Order korrelasjonskoeffisient = 0,970, p 2.0E
-07). Men 10 mirnas (røde symboler) falt utenfor 95% prediksjon intervaller (Fig. 2B), noe som indikerer at rekkene av disse mirnas var annerledes i kontroller og svulster, i samsvar med en høy sannsynlighet for at disse mirnas ble uttrykt forskjellig. Det er vår erfaring at svært store endringer i miRNA overflod (som gjenspeiles i dette tilfellet av store rang ordre forskjeller) er til assosiert med atypiske kinetikk forsterkning av svært lav overflod miRNAs. Vi har derfor visuelt inspisert qPCR forsterkningskurver for hver av miRNAs i hver prøve og eliminert de som log-lineær forsterkning kinetikk (1ct /syklus) ikke skaffe. Dette konservering trinnet redusert antall høy sannsynlighet forskjellig uttrykt mirnas i APC svulster til 5 og antallet slike miRNAs i CAC svulster til 7. Som vist i tabell 1, to mirnas ble undertrykt i APC tumorer (MIR-215 og MIR-137 ), sammenlignet med tilstøtende kontroll epitel, mens 3 mirnas ble indusert (MIR-708, MIR-31, MIR-135b). Bare en miRNA ble undertrykt i CAC svulster i forhold til å kontrollere kronisk betent epitel (MIR-215), mens 6 mirnas ble indusert i CAC tumorer (MIR-133a, MIR-467d, MIR-218, MIR-31, MIR-135b). Tre mirnas ble indusert i både APC og CAC prøver (MIR-31, MIR-135b, og MIR-708) og en miRNA ble undertrykt i både APC og CAC prøver (MIR-215). I tillegg ble 1 miRNA unikt trykt i APC tumorer (MIR-137), og 3 mirnas var unikt indusert i CAC tumorer (MIR-133a, MIR-467d, og MIR-218). De 8 forskjellig uttrykt mirnas i tabell 1 ble derfor valgt for validering.
Selv rang ordrestatistikken er et nyttig verktøy for å nominere mirnas som er forskjellig uttrykt, er en mer kvantitativ tilnærming er nødvendig for å fastslå omfanget av responsen i et gitt forhold. For dette formål brukte vi Statminer gjennomføring av Limma å utføre normalisering og sammendrag av TaqMan matrise ekspresjonsdata. Dataene er presentert i figur 3 som log 2 transformasjon av ganger endring for hver av de 8 fokus mirnas, hvor Fold Endre = – [mean (DCtTumor-DCtControl)]. P-verdier ble beregnet for hver sammenligning med Limma empiriske Bayesisk gjennomføring av t-test for å sammenligne normalisert (DCT) verdier for tumorer og kontroller. Som vist i figur 3, er alle kandidat mirnas oppviste store, statistisk signifikante forskjeller i ekspresjon i APC-tumorer (Fig. 3A) og CAC (fig. 3B), i forhold til kontrollprøvene.
mikroRNA overflod i de fire forskjellige prøve kohorter ble normalisert ved hjelp Statminer og sno135 /MIR-25 som endogene kontroller. APC kontrollene ble normalisert til APC tumorer (Panel A) og CC kontroller til CAC tumorer (Panel B). Overflod av hver av de åtte kandidat mirnas er representert som log2 ganger endring (gjennomsnittlig Ct svulst – middel Ct kontroll) og p-verdier ble beregnet ved hjelp av Limma empirisk Bayesiansk gjennomføring av moderert t-test
konvensjonell TaqMan cDNA-konverterings primere og qPCR reagenser for å bekrefte differensial ekspresjon av de fire mirnas som utviste felles regulerende responser i CAC og APC-tumorprøver som anvendes i den innledende multipleks qPCR-analyse. Som vist i figur 4, ble undertrykkelse av MIR-215 bekreftet i begge CAC og APC tumorprøver, mens induksjon av MIR-708, MIR-31, og MIR-135b ble likeledes bekreftet i svulster i begge opprinnelse. Vi utarbeidet et ekstra sett med kontroller og svulster fra både kronisk kolitt og APC mus og målte overflod av MIR-215, MIR-708, MIR-31, og MIR-135b. Figur 5 viser at innen eksperimentelle feil resultatet forutsagt fra den stigende rekkefølge statistiske analyser ble bekreftet i en uavhengig prøve kohort.
RNA prøver analysert i figurene 2 og 3 ble omdannet til cDNA ved hjelp av individuell Taqman hårnål RT-primere, i motsetning til den universelle primer blanding som brukes for TaqMan arrays. Dermed forskjellige cDNA forberedelser ble utarbeidet og analysert for miRNA overflod i APC prøver (panel A) og CAC prøver (Panel B). MikroRNA overflod var normalisert med sno135 og p-verdier beregnet med Statminer Limma protokollen. Data for hver miRNA ble kalibrert til uttrykk (2e-DCT) i den relevante kontrollprøven. Barer representerer gjennomsnitt og standardavvik for hver miRNA, n = 4. * indikerer p-verdi. 0,05
RNA ble fremstilt fra et uavhengig sett med APC tumorer (n = 9) og kontroller ( n = 9) (Panel A) eller CAC tumorer (n = 4) og kontroller (n = 8) (Panel B). MikroRNA overflod ble målt ved Taqman mikroRNA bestemt stilk PCR og normalisert med sno135. Data ble normalisert ved hjelp av Statminer og kalibrert til ekspresjon av de enkelte mirnas i kontrollprøvene. Barer representerer gjennomsnitt og standardavvik. * Indikerer p-verdi. 0,05
Fokus miRNA uttrykket i primære humane tykktarm kreft
Mønsteret uttrykks av de 8 fokus mirnas oppført i tabell 1 innebærer at noen eller alle disse mirnas kan spille en potensiell rolle i etiologien av de tidlige stadium adenomer som dannes i APC
Min /+ mus og /eller mus som har gjennomgått eksperimentell kronisk kolitt. En litteraturundersøkelse viser at noen av disse fokuserer mirnas er tidligere blitt rapportert å være forskjellig uttrykt i primære humane tykktarmkreftformer, slik som vist i tabell 2. microRNAs MIR-31 og MIR-135b har blitt rapportert å bli indusert i tykktarmskreft, lik responsen som vi har observert i tidlig stadium svulster i kronisk betent eller APC
Min /+ mus. Likeledes, observerte vi nedregulering av MIR-215 i svulster i begge typer, og nedregulering av MIR-133a i CAC men ikke APC svulster. Begge disse mirnas er rapportert å bli nedregulert i humane tykktarmkreftformer [18], [21] – [23], [37]. Våre analyser tyder på at disse miRNA artene blir indusert veldig tidlig i transformasjon og trolig påvirke signalveier som er sentrale i prosesser som er uavhengige av mekanismen for innvielse.
Analyse av potensielle miRNA mål og funksjoner i tidlig scene tumorer
Mange forskjellige algoritmer er blitt utviklet for å forutsi miRNA mål, basert på ulike parametre for å vurdere komplementært av miRNA frø sekvenser til sekvenser innenfor det 3′-utranslaterte regioner av mRNA [10], [57] – [59 ]. Selv om disse analysene er langt fra perfekt i forhold til prediktiv evne, de forblir de eneste verktøyene som er tilgjengelige for å forutsi miRNA mål, og resultatet av disse analysene er nyttig for å forutsi hypotetiske sammenhenger mellom mirnas, målrettede trasé og biologiske funksjoner. Siden forskjellige algoritmer ofte gir forskjellige resultater, brukte vi PicTar, mikrokosmos, TargetScan, og DianaT å generere lister over potensielle mål for hver av forskjellig uttrykt miRNAs. Vi inngår i disse listene bare mål som ble bevart i mus og menneske transkripsjoner, og de enkelte spådommer ble slått sammen for å danne en hovedliste over mulige mål for alle fire miRNAs. Denne listen ble deretter sammenholdt med microarray data fra isolerte mus distal colonic epitelceller [60], og mål som ikke ble scoret som «Present» i disse cellene ble eliminert. De kuratert listene ble så brukt for pathway forutsigelse.
Vi fokuserte på de 4 mirnas som ble forskjellig uttrykt i tidlig stadium lesjoner av både genetiske og inflammatorisk opprinnelse (MIR-215, MIR-31, MIR-708, MIR -135b). Ved hjelp av filtrene som er beskrevet ovenfor, identifiserte vi 527 potensielle mål mRNA som ble uttrykt i muse distal colonic epitelceller. Gene ontologi analyse (tabell 3) identifisert Kreft som toppen biologisk funksjon i forbindelse med dette genet sett, med 130 av de 527 målene knyttet til kreft gjennom GO vilkår (p-verdi range 5.86E
-05 til 2.87E
-02). GÅ begreper knyttet til Gene Expression dukket opp som den øverste Molecular and Cellular Funksjon, med 131 mål knyttet til denne kategorien (p-verdi range 5.78E
-11 til 2.87E
-02). Den øverste Tox-funksjonen var TGF-β signale (p = 5.2E
-04, med 9/77 signal komponenter som er identifisert som potensielle mål). De resterende statistisk signifikante Tox funksjoner relatert til kjernereseptorer som har blitt studert grundig innenfor rammen av colonic epitelial cellefysiologi og patologi, inkludert TR /RXR, VDR /RXR, og FXR /RXR.
disse hypotetiske GO funksjoner spår en sterk kobling mellom de fire forskjellig uttrykt mirnas og transformasjon av colonic epitelceller. Denne hypotetiske sammenhengen understrekes av de data som er vist i figur 6, der antatte miRNA mål (vist i grønt) blir lagt over de kunnskapsbaserte (Oppfinnsomhet) molekylære mekanismer av kreft kanoniske pathway (p = 1.14E
-06, 28 spådd mål /372 pathway komponenter). Kritiske membransignale funksjoner relatert til Ras /MAPK, PI3K, og WNT /β-catenin representerer potensielle mekanistiske koblinger mellom disse mirnas og transformasjon, mens kjernefunksjoner knyttet til RB /E2F kontroll fremstå som potensielle formidlere av cellesykluskontroll. Til slutt, som indikert av GO-analyse av Tox funksjon, blir TGF-β /BMP /SMAD signaleslått som en meget betydelig potensial kobling mellom disse fire mirnas og transformasjon av colonic epithelial celler.
Antatte mRNA-mål for 4 fokus mirnas ble utarbeidet etter PicTar, mikrokosmos, TargetScan, og DianaT databaser. Forut mål ble kledde i grått på oppfinnsomhet molekylære mekanismer for kreft kanoniske veien.
Diskusjoner
Vår sentrale mål var å sammenligne miRNA uttrykket i colontumorer som oppstår på grunn av kronisk betennelse og bakterie linje mutasjoner i modellsystemer. Det var tidlig klart at normalisering av dataene ville være et problem, siden vi var sammenligne svært ulike vev tilstander (
f.eks
, kronisk betent mus på standard lab chow versus alderen oppdrettere på høy fett dietter.); og det er ingen veletablert objektive kriterier for å identifisere aktuelle endogene kontroller for normalisering av miRNA uttrykk under slike forhold (For en gjennomgang av dette problemet, se [61]). Vårt første mål var derfor å bruke en uavhengig prøvesett for å sammenligne ulike modeller for normalisering. For å oppnå dette har vi utarbeidet og analysert distal colonic epitelceller fra kontroll og akutt betent vev, ved hjelp av en konvensjonell DSS akutt kolitt modell. Vi undersøkte en tidlig, pre-betent, stat, før påviselig tap av histologisk integritet distal kolonepitelet, tenker å minimere endringer i miRNA uttrykk som kan være forbundet med massiv infiltrasjon av immunceller. Ved hjelp av tre ulike analytiske tilnærminger vi identifisert 51 høyt prioriterte miRNA mål som sannsynligvis vil spille en betydelig rolle i å kontrollere genuttrykk i epitelceller i de aller tidligste stadiene av DSS-indusert betennelser. Selv om disse funnene representerer, så vidt vi vet, den første detaljerte rapporten fra differensial miRNA uttrykket i denne kolitt modellen, har vi ikke ytterligere analysert disse dataene. Snarere vi brukte disse data for å validere vårt valg av rang ordrestatistikken for å identifisere forskjellig uttrykt miRNAs. Denne analytiske tilnærmingen ikke krever identifisering av hensiktsmessige interne kontroller, og er spesielt egnet for analyse av relativt små grupper av prøver, siden ingen forutsetninger kreves omtrent lik RNA lasting eller effektiviteten av utvinning av miRNAs eller cDNA konvertering fra svært forskjellige typer vev [62 ]. Generelt rang ordre forskjeller som vi observerte korrelerer godt med analog miRNA overflod, uttrykt som DCT i median normaliserte data eller DDCt i sno135 /MIR-25 normalisert (Statminer) analyser. Men p-verdiene tilordnet av de ulike statistiske modeller varierte betydelig, skyldes i det minste delvis til liten prøve størrelse og bruk av moderert (Limma empirisk Bayesiansk) versus umoderert (t-test) tilnærminger til å estimere variansen. Gitt at en statistisk modell er sannsynlig å bryte ned med små prøvesett, har vi valgt å bruke de enkleste, mest konservative tilnærming: rang ordrestatistikken. Vi brukte Statminer normalisering (mot sno135 og MIR-25) for å trekke relative miRNA overflod.
Rank ordrestatistikken ble brukt til å identifisere 8 forskjellig uttrykt mirnas i svulster som dannes i distale kolon av APC
Min /+ mus og kronisk betente mus. Det bør bemerkes at disse tumorene er primært adenomer og dermed utgjøre et meget tidlig stadium i transformasjon. Vi bør også understreke at disse 8 mirnas representerer bare de mest fremtredende, og derfor trolig den mest reproduserbare, endringer i miRNA uttrykket i disse prøvene.
