Abstract
Bakgrunn
Angiogenese er å anse som et kjennetegn i kreftutvikling, og antiangiogen behandling er i dag brukt i ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) pasienter. MicroRNAs (Mirs) er små ikke-koding, endogene, single strandet RNA som regulerer genuttrykk. I denne studien ønsket vi å identifisere vesentlig endret Mirs knyttet til angiogenese i NSCLC.
Metoder
Fra en stor kohort av 335 NSCLC pasienter, parafin-embedded prøver fra 10 pasienter med en kort sykdomsspesifikke overlevelse (DSS), 10 med en lang DSS og 10 normale kontroller ble analysert. De Mirs ble kvantifisert ved microarray hybridisering og utvalgte Mirs ble validert ved sanntid qPCR. Virkningene av forskjellige veier, inkludert angiogenese, ble evaluert av Gene Set Enrichment Analysis (GSEA) avledet fra Protein analyse gjennom evolusjonære Sivil (PANTHER). En av de mest interessante kandidat markører, MIR-155, ble validert av
in situ
hybridisering (ISH) i total kohorten (n = 335) og korrelasjon analyser med flere kjente angiogene markører ble gjort.
Resultater
128 Mirs var betydelig opp- eller nedregulert; normal versus lang DSS (n = 68) og /eller normal versus kort DSS (n = 63) og /eller lang versus kort DSS (n = 37). Den veien Analysen indikerer angiogenese-relaterte Mirs å være involvert i NSCLC. Det var sterke signifikante korrelasjoner mellom array hybridisering og qPCR validering av data. De vesentlig endrede angiogenese-relaterte Mirs av høy interesse var MIR-21, MIR-106a, MIR-126, MIR-155, MIR-182, MIR-210 og MIR-424. MIR-155 korrelerte signifikant med fibroblast vekstfaktor 2 (FGF2) i total kohort (r = 0,17, P = 0,002), men mest fremtredende i undergruppen med nodal metastase (r = 0,34, P 0,001).
Konklusjoner
Flere angiogenese-relaterte Mirs er vesentlig endret i NSCLC. Videre studier for å forstå deres biologiske funksjoner og utforske sin kliniske relevansen er garantert
Citation. Dønnem T, Fenton CG, Lonvik K, Berg T, Eklo K, Andersen S, et al. (2012) mikroRNA signaturer i svulstvev Relatert til Angiogenese i ikke-småcellet lungekreft. PLoS ONE 7 (1): e29671. doi: 10,1371 /journal.pone.0029671
Editor: William C. S. Cho, Queen Elizabeth Hospital, Hong Kong
mottatt: 30 juni 2011; Godkjent: 02.12.2011; Publisert: 25 januar 2012
Copyright: © 2012 Dønnem et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Studien ble utelukkende finansiert av Nord-Norge RHF (Helse Nord RHF), som er ansvarlig for de offentlige sykehusene i Nord-Norge. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
lungekreft er den fremste årsaken til kreftrelatert dødelighet hos både menn og kvinner, og ca 80% er ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) [1]. Til tross for nye forbedringer i tidlig diagnose og behandling modaliteter, er den samlede fem års overlevelse på beskjedne 15%. TNM (Tumor, noder, metastase) trinnet har vært ansett den viktigste prognostiske variabel så tidlig stadium sykdom er en forutsetning for fullstendig kirurgisk reseksjon nødvendig for potensiell kur. Behandlingstiltak og bivirkninger fra nye behandlingstilbud har vært nært knyttet til ulike histologiske enheter av NSCLC [2] – [4]. Men målrettet terapi rettet mot spesifikke cellulære endringer krever en presis sub-klassifisering av NSCLC som i stor grad utover dagens iscenesettelse og rutinemessige diagnostiske histopatologiske teknikker [5].
microRNAs (Mirs) er små ikke-koding, endogene, enkelt strandet RNA som regulerer genuttrykk [6] – [9]. Ved å regulere genekspresjon på et posttranskripsjonelt nivå, Mirs ha en stor innvirkning på en rekke forskjellige veier, inkludert ulike veier relatert til kreftutvikling. Flere studier har utforsket dereguleringen av ulike Mirs i NSCLC og deres potensielle onkogene og tumor suppressor funksjoner samt deres prognostisk effekt [10] -. [20]
Noen Mirs ser ut til å være involvert i angiogenese [21] – [24]. Angiogenese er en prosess med dannelsen av nye blodkar fra pre-eksisterende, og spiller en nøkkelrolle i tumor utvikling [25]. Angiogene inhibitorer benyttes i NSCLC behandling. Den monoklonalt antistoff bevacizumab i kombinasjon med kjemoterapi er FDA godkjent som et behandlingsalternativ med metastatisk ikke-plateepitel NSCLC pasienter, og mange tyrosinkinasehemmere rettet mot angiogene trasé er lovende [3], [26].
Det første bevis viser Mirs i regulering av angiogenese kom fra dicer knockout mus. Dicer er et kritisk enzym i mir syntese. De dicer-underskudd mus døde tidlig under utviklingen på grunn av fortynning av vaskulære vegger og alvorlig uorden av nettverket av blodårer [27]. Dessuten, en annen murine studie viste at et delsett av Mirs forandres under den angiogene bryter ble motstå regulert som respons på anti-angiogene behandling [23].
I en stor uselektert NSCLC kohort vi har tidligere studert virkningen av prognostisk flere viktige angiogene vekstfaktorer og reseptorer, samt prognostisk rolle MIR-155 og MIR-126 ved
in situ hybridisering
[28] – [38]. Heri, evaluert vi Mir uttrykk profiler i NSCLC ved hjelp av vev fra utvalgte pasienter fra dette kullet. Vi forsøkte å identifisere interessante angiogenese-relaterte MIR kandidater for ytterligere potensial store og dyptgående studier.
Resultater
Pasienter
Demografiske, kliniske og histopatologiske variabler i pasientgrupper (lang DSS, kort DSS og kontroller) er vist i tabell 1. median DSS var henholdsvis 8,0 (range 6.5-9.9) måneder og 160,5 (range 60,5 til 184,3) måneder i lav og høy DSS gruppe,. Det var fire adenokarsinomer og seks plateepitelkarsinom i hver gruppe.
Micro RNA uttrykk analyse
Av 281 Mirs, Figur 1 viser antall og fordeling av 128 forskjellig uttrykt Mirs betydelige på tvers av ulike sammenligninger i studien (P 0,1 justert for falsk funnrate, FDR). De respektive -up og nedregulert (-1,1) Mirs er presentert i tabell S1. MIR-182 var den eneste Mir endret på alle tre kombinasjoner; normal versus kort DSS, normal versus lange DSS og kort versus lang DSS. En Prinsipal komponent analyse (PCA) (figur 2A) på hele utvalget sett uttrykk verdier avdekket at hovedprinsippet del av variasjonen skiller normale prøver fra NSCLC prøvene. For å markere forskjellen mellom gruppene av NSCLC tumorprøver en bro Partial Least Squares (PLS) Modellen ble brukt til å trekke ut et underrom der gruppeforskjeller er mer opplagt enn i PCA (figur 2B). Tabell 2 viser de ti Mirs med høyest ganger endring delt i grupper lang levetid etter versus normal kontroll og kort overlevelse sammenlignet med normal kontroll. Tabell 3 viser Mirs med høyest ganger endring i korte versus lange overlevelsesgrupper
Venn-diagram viser antall alle forskjellig uttrykt mirnas tvers av ulike sammenligninger. Tissue fra NSCLC pasienter med kort overlevelse versus vev fra NSCLC pasienter med lang overlevelse, vev fra normal lunge versus vev fra NSCLC pasienter med lang overlevelse og vev fra normal lunge versus vev fra NSCLC pasienter med kort overlevelse. Ut av 281 Mirs evaluert, antall differensial uttrykt Mirs med FDR justert P. 0,1 (totalt n = 128) av hver sammenligning er indikert
(A) To-dimensjonal PCA av Mirs, avledet fra 20 pasienter med NSCLC og prøver fra normalt lungevev 10 vev, som viser separasjon av de to prøvegrupper. (B) Plottet viser komponentene 1 og 2 i PLS modellen som brukes overlevelse som en scoring kriterier. Analysen skiller klart vevsprøven grupper for kortere og lengre overlevelse NSCLC pasienter. Alle prøvene er fargekodet etter gruppe: Black: Normal pasientprøver; grønne: Prøver fra pasienter med kort overlevelse; red.: Prøver fra pasienter med lang overlevelse
Pathway analyse
Tabell 4 viser resultatene fra den GSEA. Genet sett koblet til 31 angiogenese-relaterte Mirs avslørte den høyeste genet satt nominelle berikelse score (NES = -1,17, nominell p-verdi 0,28, FDR 0). Figur 3 viser varmekartet som representerer 31miRs som er koblet til den angiogene genet settet.
Forskjellen i MIR uttrykk mellom tumorprøver fra pasienter med NSCLC lang (L) og korte (S) overlevelse er vist. MIR uttrykk verdier er vist i et spekter hvor nedregulert er blå og oppregulert er rød.
PCR validering
Scatter tomter sammenligne microarray hybridisering og qPCR data fra 28 utvalgte Mirs er vist i figur 4. inkludert Mirs, og data fra alle tre kombinasjoner (både hybridisering og qPCR) er oppført i tabell S2. Det var sterk og signifikant korrelasjon mellom hybridisering og qPCR data: Short versus normal r = 0,81, P 0,001; lang versus normal r = 0,85, P 0,001; kort versus lang r = 0,85, P . 0.001
Sammenligning mellom microarray hybridisering (dLMR, forskjell i gjennomsnitts uttrykk nivåer mellom utvalgsgrupper, log2 skala) og qPCR (ddCP, forskjellen i gjennomsnittlig uttrykk nivåer mellom utvalgsgrupper, log2 skala) data, korrelasjonskoeffisient = r (Pearson): (A) lav sammenlignet med normal r = 0,81, P 0,001; (B) høy versus normal r = 0,85, P 0,001; (C) høy versus lav r = 0,85, P 0,001. I rød; MIR-150.
korrelasjonsanalyse mellom angiogene markører og MIR-155
Vi har tidligere publisert på den prognostiske betydningen av MIR-155 i våre store (335 pasienter) NSCLC befolkningen [ ,,,0],37]. I denne studien utforsket vi sammenhengen mellom MIR-155 og flere kjente angiogene markører. De samme cut-off verdier som tidligere utgitt ble brukt for FGF2 og MIR-155 [33], [37]. Figur S1 viser
i situ
hybridisering (ISH) analyse av NSCLC representerer sterke og svake intensiteter for tumorcelle Mir-155 uttrykk så vel som negative og positive kontroller. Tabell 5 viser korrelasjonen mellom angiogene markører [vaskulær endotelial vekstfaktor – A (VEGF-A), blodplate-avledet faktor – B (PDGF-B), HIF-1α og fibroblast-vekstfaktor 2 (FGF2)] og MIR-155. MIR-155 korrelerte signifikant med FGF2 i total kohort (r = 0,17, P = 0,002), men mest fremtredende i undergruppen med nodal metastase (r = 0,34, P 0,001). De krysstabeller i Tabell 6 og Tabell 7 viser sammenhengen og distribusjon av høy og lav uttrykk for FGF2 og MIR-155.
Diskusjoner
Så vidt vi vet dette er den første NSCLC Mir uttrykk profilering studie som viser et gen sett koblet til angiogenese-relaterte Mirs med høyest effekt i pathway analyse. I samsvar med tidligere publiserte studier ser vi store forskjeller i Mir profiler mellom normal og svulstvev og mellom prøver fra pasienter med dårlig kontra en gunstig DSS. Flere av disse vesentlige endrede Mirs er assosiert med angiogenese og er interessante kandidat markører for videre evaluering. Ved å validere en av disse markørene, MIR-155, i en kohort av 335 NSCLC pasienter, finner vi denne Mir for første gang å bli signifikant assosiert med den velkjente angiogen markør FGF2.
De største svakhetene ved studien i jakten på nye kandidatmarkører er relativt heterogene studiepopulasjonen og den lave antall pasienter inkludert i analysen. Mange av de resultatene som presenteres her, er derfor bare border signifikant (eller noen bare viser en trend) og videre validering i en større NSCLC sett, som på MIR-155, er en forutsetning for fastere konklusjoner. Dette er særlig tilfelle når man sammenligner signifikante forskjeller mellom tumorvev (dyp kontra kort overlevelse) som det i alminnelighet er større forskjeller mellom tumorvev og normale kontroller. Brette endringene er i gjennomsnitt høyere og p-verdiene sterkere i tabell 2 (i tumorvev sammenlignet med normale kontroller) sammenlignet med tabell 3 (lang versus kort overlevelse). Fra et klinisk synspunkt, i hvert fall når det kommer til Mirs som potensielle prognostiske eller prediktive markører, Mirs med endret uttrykk mellom kort versus lang overlevelse gruppen er av spesiell interesse. Vi har derfor undersøkt litteraturen på fire angiogenese relatert Mirs fra tabell 3 (MIR-106a, MIR-155, MIR-182 og MIR-424) og validert MIR-155 i et stort sett med NSCLC pasienter. I tillegg ønsket vi å markere den potensielle effekten av MIR-21, MIR-126 og MIR-210 fra tabell 2 som det er overbevisende rapporter som indikerer disse Mirs å ha potensial effekt i angiogenese. Dessuten har vi tidligere vist MIR-126 for å ha prognostisk effekt i vår NSCLC kohort [38].
Å styrke våre resultater er sterke og signifikante sammenhenger mellom de microarray hybridisering data og de samme Mirs validert av qPCR. Videre, de endrede MIR uttrykk i tumor sammenlignet med normalt vev er i stor grad i samsvar med tidligere publiserte NSCLC MIR studier [15] – [17], [20], og som diskutert i det etterfølgende er det stadig ny litteratur tilsatt, støtter vårt kandidat Mirs å være involvert i angiogenese.
Få studier har undersøkt effekten av trasé relatert til Mir genet mål i NSCLC. Tolkningen av slike analyser er ikke rett frem som resultatene er svært avhengig av hvilke mål gener som er knyttet til Mirs og hvilke Mirs er koblet til de forskjellige veier. I tillegg Mirs er ofte multifunksjonelle og samme Mir kan målrette ulike gener i forskjellige baner, og et gen kan bli målrettet av flere Mirs. Selv om det ikke er statistisk signifikant, det GSEA varierte angiogenese som det viktigste reaksjonsveien i våre NSCLC prøver. Det er flere nye rapporter som kobler spesifikke Mirs til angiogenese støtte våre funn [23], [24], [39] – [42]. Dessuten Raponi et al. har vist at den angiogenese-relaterte fibroblast vekstfaktor (FGF) pathway hadde en betydelig berikelse gen i plateepitel NSCLC [17].
I en omfattende studie murine, Olson et al. identifisert konkrete MIR uttrykk signaturer i forbindelse med trinnene i tumorigenesis og ulike kjennetegnene til kreft, inkludert angiogenese [23]. Angiogenese-hemmende signatur Mirs ble evaluert av qPCR teknikk og definert som de Mirs betydelig endret i normal versus sunitinib-behandling primære svulster ved 1,3 ganger endring [23]. Sunitinib er en tyrosinkinaseinhibitor rettet mot vaskulær endotelial vekstfaktor reseptor (VEGFR), blodplateavledet vekstfaktor (PDGFR) og c-kit. I henhold til våre qPCR valideringsresultater, PCR data generelt viser ofte en økt ganger endring sammenlignet med hybridisering data. Mange av angiogenese-relaterte Mirs observert av Olson og kolleger er også vesentlig endret i vårt materiale [23]. Blant de mest interessante angiogenese-relaterte Mirs betydelig endret i begge studier finner vi MIR-126, MIR-155, og MIR-21 og MIR-424.
MIR-126 har nylig blitt vurdert som en viktig aktør i angiogenese [43] og Wang et al. viste i en murin modell som den forbedrer proangiogenic virkningene av VEGF og FGF ved å undertrykke ekspresjon av spred-1, en intracellulær inhibitor av angiogen signalering [44]. MIR-126 er også plassert innenfor den epidermale vekstfaktor-lignende domene 7 (EGFL7) genet. EGFL7 kan ha en viktig rolle i angiogenese ved å fremme VEGF signale og vaskulær integritet [45]. Videre har vi tidligere rapportert at Mir-126 uttrykk er signifikant assosiert med VEGF-A i NSCLC [38]. Videre observerte vi at den prognostiske virkningen av MIR-126 er knyttet til histologiske subtyper og lymfeknutestatus. I tillegg uttrykket og roller i MIR-126 kan være forskjellig i forskjellige maligniteter [23].
MIR-155 er en av de Mirs mest konsekvent involvert i neoplastisk sykdom [46], men så vidt vi vet, ikke vært knyttet til angiogenese før studien av Olson og medarbeidere [23]. Det har blitt rapportert å være oppregulert i flere humane NSCLC-undersøkelser [15], [17], [20], og nedregulert i en murin modell ved bruk av den angiogene inhibitor sunitinib [23]. I vår rekke data, MIR-155 hadde en tendens til å bli vesentlig endret mellom korte og lange overlevelsesgrupper (tabell 3) og var betydelig over uttrykt i tumor mot normalt vev i qPCR valideringssettet. Vi har rapportert den prognostiske betydningen av MIR-155 for å bli assosiert med histologiske subtyper og lymfeknutestatus, men ikke knytte disse resultatene til angiogene markører [37]. Basert på disse nye dataene vi nå undersøkt om MIR-155 korrelert til kjente angiogene /hypoksiske parametre som VEGF-A, PDGF-B, HIF-1α og FGF2. Interessant, vi har observert, for første gang, MIR-155 for å være signifikant assosiert med FGF2 med den høyeste effekt i N + NSCLC undergruppe. Selv FGF2 har flere funksjoner, er det en viktig aktør i angiogenese. Faktisk, MIR-155 har også en tendens til å korrelere med VEGF-A i N + undergruppe. MIR-155 var en av de første Mirs å bli assosiert med NSCLC utvikling og videre studier vil være viktig for å utforske sitt potensial angiogen funksjon.
I denne studien, MIR-21 er betydelig oppregulert i tumor i forhold til normalt vev (tabell 2), som støtter tidligere NSCLC rapporter [15], [17], [20], og den observerte nedreguleringen etter at anti-angiogen behandling [23]. MIR-21 er også blitt funnet å være sterkt uttrykt i endotelceller [24]. I en fersk undersøkelse utført av Liu et al., Ble MIR-21 overexpressed ved trans pre-MIR-21 inn i menneskelige prostata kreft celler og tumor angiogenese ble analysert ved hjelp av kylling chorioallantoic membran [47]. De fant at overekspresjon av MIR-21 i DU145 cellene økt ekspresjon av HIF-1α og VEGF, og indusert tumor angiogenese. De konkluderer med at MIR-21 induserer tumor angiogenese ved å målrette PTEN, som fører til aktivering av AKT og ERK1 /to signalveier, og derved øke HIF-1α og VEGF ekspresjon. De samme trasé er beskrevet som viktig i NSCLC utvikling samt [48], og videre studier for å løse dette forholdet til Mir-21 i lungekreft ville være av interesse.
Olson Studien indikerer MIR-424 for å være involvert i angiogenese som dette Mir ble nedregulert etter sunitinib behandling [23]. I tillegg Ghosh et al. har studert dette MIR og beskrevet som hypoksi-indusert Mir-424 uttrykk i humane endotelceller regulerer HIF-α-isoformer og fremmer angiogenese [49]. De foreslår videre MIR-424 til å spille en viktig fysiologisk rolle i post-iskemisk angiogenese. I motsetning til dette, Nakshima et al. rapporterte nedregulering av MIR-424 for å bidra til unormal angiogenese via MEK1 og cyklin E1 i senil hemangioma, demonstrere potensialet vev og scene spesifikk virkningen av den samme mir [50]. I vår studie ble MIR-424 ikke endres når man sammenligner tumor med normalt vev, men var signifikant oppregulert i vev fra pasienter med dårlig prognose i forhold til vev fra pasienter med en gunstig prognose (tabell 3). Det er så vidt vi vet ingen publisert studie som har undersøkt den prognostiske betydningen av MIR-424 i kreft. Men som det er en betydelig MIR-424 oppregulering i den fattige prognosegruppe ville det være av interesse å ytterligere evaluere denne markøren i stor skala NSCLC studien.
En annen betydelig opp-regulert markør i vårt materiale er MIR-210 (tabell 2), som tidligere har vært knyttet til angiogenese [41], [51], [52]. MIR-210 oppregulering er antatt å være et viktig element av endotel celle respons på hypoksi og derfor potensielt viktig i tumorangiogenese. Dette MIR har nylig gjennomgått av Devlin et al. [51], som konkluderte med at MIR-210 er et robust mål av hypoksi-induserbar faktor og at overekspresjon er påvist i en rekke hjerte- og karsykdommer og solide tumorer. I NSCLC cellelinjer, er MIR-210 rapportert å megle mitokondrie forandringer assosiert med modulering av HIF-1 aktivitet [52]. Men mye av den funksjonelle og prognostisk effekt av MIR-210 i NSCLC er fremdeles uløst.
MIR-182 er inkludert i angiogenese sti i GSEA, delvis fordi fibroblast vekstfaktor reseptor substrat 2 (FRS2) er en av dens målgener. FRS2 er en viktig regulator av fibroblast vekstfaktor bane som vi og andre har vist seg å være viktig i NSCLC progresjon, eventuelt ved å stimulere angiogenese [33], [53]. Interessant, MIR-182 var den eneste mir betydelig endret i alle tre kombinasjoner som vist i Venn-diagram (figur 1). Det er opp-regulering i tumor (både dårlig og gunstig prognosegruppe, tabell 2) sammenlignet med normalt vev, er i overensstemmelse med den tidligere studie av Raponi et al. [17]. Videre er MIR-182 signifikant oppregulert i kort DSS DSS versus lange pasienter (Tabell 3). Imidlertid Barchack et al. observerte høyere MIR-182 uttrykk i primære svulster enn i de metastatisk lungesvulster, noe som indikerer at MIR-182 uttrykk kan nå en topp i tidlig stadium NSCLC.
Vi ser den samme trenden for MIR-106a, som har vært vist seg å være oppregulert i løpet av hypoksi i brystkreft og tykktarmskreft cellelinjer [40]. Som tidligere rapportert, MIR-106a var oppregulert i NSCLC [16], [17], [20]. Vi ser også sitt uttrykk til å være betydelig forsterket i tumorer versus normale kontroller (tabell 2). Som for MIR-182, ble MIR-106a ytterligere øket i vev fra pasienter med en kort overlevelse i stedet for lang overlevelse (tabell 3).
Som ventet mange Mirs kjent for å være forbundet med angiogenese ble ikke signifikant endret i vår studie. Cluster MIR-17-92 (MIR-17-5p, MIR-17-3p, MIR-18a, MIR-19a, MIR-19b, MIR-20a og miR92-1), la-7, la-7F, speil 27b, MIR-15b, MIR-16, MIR-92a, MIR-99a, MIR-130a, MIR-214, MIR-221, MIR-222 og MIR-296 samt noen av Mirs som presenteres i kart varmen ( figur 3), ble ikke signifikant endret eller de oppviste bare små brette endringer [24], [39], [41], [42]. Denne mangelen på vesentlige endringer kan skyldes falske negative resultater som det er få pasienter i hver gruppe. Videre, som mange Mirs synes å være vev og trinn spesifikk, kan noen av disse Mirs alternativt utøver en innvirkning begrenset til undergrupper av resekterte NSCLC eller kan være viktig i andre kreftformer.
Angiogene-inhibitorer i kombinasjon med kjemoterapi er etablert som NSCLC behandling, men ytterligere kunnskap om biologi, Effektor mekanismer og prognostiske og prediktive markører er garantert. Mirs er stabile og potensielt målbar i begge vev og serum. Flere Mirs er knyttet til angiogenese, og denne studien understøtter antagelsen om at en del av angiogenese-relaterte Mirs er potensielt viktige i NSCLC progresjon. Vi foreslår MIR-21, MIR-106a, MIR-126, MIR-155, MIR-182, MIR-210 og MIR-424 for å være blant de mest interessante kandidatene. Siden Mirs ofte er scenen og vev bestemt, er store studier garantert å videre utforske sin prognostisk og prediktiv effekt. Foruten den samme Mir har ofte flere mål gener og ulike funksjoner. Derfor funksjonelle studier er svært nødvendig for å få bedre innsikt i sine biologiske funksjoner.
Materialer og metoder
Etikk uttalelse
Studiet er godkjent av Den nasjonale data Inspection Board, The regional komité for forskningsetikk og Biobank Board Innsamling av Tissue. Informasjon og senere skriftlig samtykke fra pasienter eller pårørende ble vurdert, men siden dette var en retrospektiv studie med mer enn halvparten av pasientene døde, noen mer enn ti år siden, Regional komité for forskningsetikk spesielt fravikes behovet for samtykke.
pasienter og vevsprøver
fra en tidligere godt beskrevet stor NSCLC kohort [30], tjue formalinfiksert og parafininnstøpte (FFPE) tumor vevsprøver ble oppnådd fra pasienter diagnostisert med stadium I -IIIA ved Universitetssykehuset Nord-Norge (UNN) og Nordlands Central Hospital (NLCH). Disse var ti pasienter med en kort sykdomsspesifikk overlevelse (DSS) (NSCLC_01 – NSCLC_10), og ti pasienter med lang DSS (NSCLC_11 – NSCLC_20). I tillegg ble prøver fra normale lungevev steder i ti NSCLC pasienter (NSCLC_01, NSCLC_02, NSCLC_06, NSCLC_11, NSCLC_12, NSCLC_13, NSCLC_15, NSCLC_16, NSCLC_18 og NSCLC_19) inkludert i studien (NORM_01 – NORM_10). Fire prøvekjerner, hver 0,6 mm i diameter, fra levedyktige tumor områder fra hver tumor og normale prøven ble tatt og samlet forut for RNA isolering, for å oppnå en representativ prøve av hver pasient. Lange og korte DSS grupper ble stratifisert for å få lik fordeling av kjønn og histologi. De vevsprøver ble lagret ved Institutt for patologi ved UNN og NLCH, iscenesatt ifølge The International Union Against Cancer (UICC) TNM klassifisering, og histologisk subtyped ifølge Verdens helseorganisasjon retningslinjer [54], [55]. Alle pasientmateriale ble gjennomgått av to uavhengige og kvalifiserte patologer (SAS og KAS). Ingen av pasientene fikk kjemo- eller radioterapi før operasjonen. Komplett pasientdata ble hentet fra medisinske journaler, inkludert demografiske, klinisk, behandling og resultatdata.
RNA isolering
RNA ble isolert fra de innsamlede kjerneprøver ved hjelp av Recover All ™ Totalt Nucleic Acid isolasjon Kit for FFPE- vev (Ambion, Austin, TX), i henhold til produsentens instruksjoner, med noen mindre justeringer. Xylen behandling ble øket fra 3 min til 8 min, og protease behandling ble øket fra 3 timer til omtrent 20 timer. RNA kvalitet og kvantitet ble vurdert ved hjelp av Nanodrop 1000 spektrofotometer (Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE) og videre verifisert av en Agilent 2100 Bioanalyzer profil.
Microarray prosedyrer
Total RNA (700 ng ) fra prøven og referansen ble merket med Hy3 ™ og Hy5 ™ fluorescerende markør ved hjelp av miRCURY
Tm LNA Array kraft merkingskit (Exiqon, Vedbæk, Danmark) ved å følge den fremgangsmåte som er beskrevet av produsenten. Den Hy3 ™ -merket prøver og en Hy5 ™ -merket henvisning RNA prøve (som inneholder en lik delmengde av alle RNA arter som inngår i denne studien) ble blandet parvis og hybridisert til miCURY
Tm LNA Array versjon 5
th generasjon (Exiqon, Danmark), som inneholder oppfangingsprober rettet mot alle menneskelige mirnas registrert i miRBASE versjon 14.0 på Sanger Institute. Den hybridisering ble utført i henhold til miRCURY ™ LNA rekke manuelle bruke en Tecan HS4800 hybridisering stasjon (Tecan, Østerrike). Etter hybridisering microarray Glassene ble skannet og lagret i et ozonfritt miljø (ozon nivå under 2,0 ppb) for å forhindre mulig bleking av de fluorescerende fargestoffer. De miCURY ™ LNA Array microarray lysbilder ble skannet med Agilent G2565BA Microarray Scanner System (Agilent Technologies Inc., USA) og bildeanalyse ble utført ved hjelp av Imagene 8.0-programvaren (BioDiscovery Inc., USA). De kvantifiserte signaler ble bakgrunn korrigert med offset verdi 10 og normalisert ved hjelp av den globale Lowess (lokalt Weighted scatterplot Smoothing) regresjonsalgoritmen [56].
Database innlevering av microarray data
microarray data ble utarbeidet i henhold til minimum informasjon om en microarray eksperiment (MIAME) anbefalinger [57] og deponert i GEO database (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/). GEO sjonsnummer for plattformen er GSE27705 og studiet kan sees på:. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE27705
Kvantifisering av modne miRNAs av sanntids qPCR
En eller flere av følgende kriterier ble brukt ved valg av Mirs for PCR validering; signifikant P-verdi, høy ganger endring og /eller angiogenese-relaterte Mirs. Fem prøver fra hver gruppe med tilstrekkelig tumor MIR som blir igjen etter den rekke analyse ble brukt i PCR-validering. Ut av de 41 testede Mirs ble 28 Mirs påvist i 7 eller flere prøver og analysert. Stabiliteten til mirnas påvist i alle prøver ble testet ved hjelp av Exicon Normfinder programvare. MIR-423-5p var en av de anbefalte referanse mirnas sammen med MIR-150, MIR-423-5p og MIR-300. MIR-300 ble ekskludert på grunn av svært lave nivåer oppdaget. Ytterligere Normfinder funnet stor variasjon i speil 150, men MIR-423-5p ble funnet å være den mest stabile miRNA i datasettet og følgelig brukes som referanse. Alle sanntid qPCR eksperimenter ble utført av Exiqon, Vedbæk, Danmark. 10 ng RNA ble revers transkribert i 10 mL reaksjoner ved bruk av miRCURY LNA ™ Universal RT MIR PCR, polyadenylering og cDNA syntese kit (Exiqon); hver prøve ble behandlet i tre paralleller. cDNA ble fortynnet 100 x og 4 ul ble anvendt i 10 ul PCR reaksjoner i henhold til protokollen for miRCURY LNA ™ Universal RT PCR mir; hver MIR ble analysert en gang ved qPCR i tre eksemplarer cDNA. Amplifikasjonen ble utført i en LightCycler® 480 Real-Time PCR System (Roche) i 384 brønns plater. LinRegPCR (versjon 11.5) programvare ble anvendt for å bestemme qPCR utvidelseseffektiviteten. Den gjennomsnittlige forsterkning effektivitet ble brukt til å korrigere Raw Cp verdier.
Pathway analyse
Konsekvensene av de ulike banene ble evaluert av Gene Set Enrichment Analysis (GSEA) avledet fra Protein analyse gjennom evolusjonære Sivil (PANTER). PANTHER klassifiseringssystemet er en unik ressurs som klassifiserer gener ved deres funksjoner, ved hjelp av publiserte vitenskapelige eksperimentelle bevis og evolusjonære relasjonene til å forutsi funksjon selv i fravær av direkte eksperimentelle bevis. Genet settet ble hentet fra databasen MirDB (https://www.mirdb.org) (https://rnajournal.cshlp.org/content/14/6/1012.full) som har samlet genet lister fra trasé kuratert i PANTHER database.
En fullstendig liste er tilgjengelig på https://mirdb.org/cgi-bin/pathway.cgi. miRNA anmerkningen er basert på miRBase versjon 13 (https://www.mirbase.org/). GSEA analyse ble utført ved hjelp av R statistisk språk (www.r-project.org) og GSEA pakke for R tilgjengelig på https://www.broadinstitute.org/gsea/downloads.jsp.
Data
