Abstract
Selv om noen studier beskrevet egenskapene til tykktarmskreft stamceller (cscs) og rollen til endoteliale progenitorceller (EPCs) i neovascularization, er det fortsatt kontroversielt hvorvidt en interaksjon eksisterer eller ikke mellom cscs og EPCs. I dette studiet er, HCT116 og HT29 sfære modeller, som er kjent for å være cellene berikende cscs, ble etablert for å undersøke rollene til dette samspillet i utvikling og metastasering av tykktarmskreft. Sammenlignet med sine foreldre kolleger, sfæroide celler viste høyere kapasitet på invasjon, høyere tumorigent og metastatisk potensial. Deretter in vitro og in vivo forhold mellom cscs og EPCs ble studert ved hjelp av kapillarrør dannelsesbestemmelsen og xenograft-modeller. Våre resultater viste at sfæroide celler kunne fremme proliferasjon, migrering og rør dannelse av EPCs gjennom sekresjon av vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF). I mellomtiden EPCs kunne øke tumorigent kapasitet på sfæroide cellene gjennom angiogenese. Videre ble høyere microvessel tetthet oppdaget i området berikende kreftstamceller i menneskets tykktarm kreft vev. Våre funn tyder på at sfæroide celler besitter egenskapene til kreftstamceller, og samvirke av cscs og EPCs kan spille en viktig rolle i utviklingen av tykktarmskreft
Citation. Wei B, Han XY, Qi CL, Zhang S, Zheng ZH, Huang Y, et al. (2012) samvirke av spheroid-avledet stilk-lignende celler og endotelceller stamceller Fremmer utvikling av tykktarmskreft. PLoS ONE 7 (6): e39069. doi: 10,1371 /journal.pone.0039069
Redaktør: Giovanni Camussi, Universitetet i Torino, Italia
mottatt: 25 desember 2011; Godkjent: 18 mai 2012; Publisert: 26 juni 2012
Copyright: © 2012 Wei et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra Science Foundation National of China (No. 30872462 til Hong-Bo Wei, og nr 81000960 til Bo Wei). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
tykktarms~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP er den tredje største årsaken til kreft dødsfall på verdensbasis, og den 5-års relativ overlevelse er bare 53,8 til 65,2% til tross for diagnostiske og terapeutiske fremskritt [1], [2]. Tumorresidiv og metastasering er to viktige overlevelses-påvirkende faktorer av tykk- og endetarmskreft.
Nylig, antyder økende bevis for at startfasen og metastaser er avhengig av en liten sub-populasjon av kreftceller betegnes kreft stamceller (cscs) peiling uendelig selvfornyelse potensial og evnen til å differensiere i forskjellige befolkningsgrupper bestående av en svulst [3]. Ifølge denne modellen, ble kreftstamceller funnet å opprettholde kreftutvikling, metastaser, og tilbakefall av tykktarmskreft.
Eksistensen av kreft stamceller ble først påvist i forbindelse med akutt myelogen leukemi [4]. Dette prinsipp ble ytterligere utvidet til noen faste tumorer, inkludert tykktarmskreft, brystkreft, hjernesvulster, og lungekreft [5], [6], [7], [8], [9], [10]. Cellesortering av en sub-populasjon på grunnlag av celleoverflatemarkører og bekreftelse av deres tumor-xenograft initiere aktivitet i transplantasjons analyser anvendes vanligvis fremgangsmåter for isolering og identifisering av cscs fra tumorvev eller cellelinjer [11]. Selv CD133, CD44, EpCAM ble brukt mye som celleoverflatemarkører for tykktarmskreft stamceller, var det fortsatt tviler på følgende celleoverflatemarkører [12], [13]. Side befolkningen (SP) celler isolert ble en gang brukt til å berike kreftstamceller. Men flere studier viste bevis mot en sammenheng mellom SP celler og kreftstamceller [14], [15], [16], [17]. Nylig har økende forskere rapporterte at de ikke-klebende, tredimensjonale (3D) kreftkuler under serumfrie betingelser kan effektivt berike kreftstamceller [18], [19], [20]
in vitro
. Derfor er denne metode ble anvendt for å berike tykktarmskreft stamceller i den foreliggende undersøkelse.
endoteliale forløperceller (PP-), en liten subpopulasjon av den mononukleære cellefraksjon i perifert blod, stammer hovedsakelig fra benmarg-avledede celler med evnen til å differensiere til modne endotelceller [21], [22]. EPCs forlate benmargen og rekruttere til områder som krever vaskulær reparasjon følgende graderinger av vekstfaktorer og cytokiner som blir sluppet ut i sirkulasjonen ved skadet vev eller svulster, og deretter bidra til blodkardannelsen [23], [24]. Nyere bevis viser at sirkulerende EPCs spiller en viktig rolle i tumor neovaskularisering, tumorvekst og metastasering [25], [26], [27], [28], [29].
Selv om bidraget av EPCs til tumor neovascularization har blitt vist i flere typer kreft, har samspillet mellom EPCs og tykktarm kreft stamceller ikke blitt rapportert. Målet med denne studien var å fastslå bionomics av tykktarm kreft stamceller og rollen til samvirke av cscs og EPCs i vekst og metastasering av tykktarmskreft.
Materialer og metoder
Etikk Statement
Alle eksperimenter som involverer menneskelige deltakere (inkludert samling av menneskelige navlestreng blod og tykktarmskreft prøver) har blitt godkjent av det medisinske forskningsetiske komité for Sun Yat-sen-universitetet, og gjennomført i henhold til de prinsipper som er nedfelt i erklæringen Helsinki. Alle deltakerne i studien signert informert samtykke skjemaer og alle dyreforsøk ble utført i henhold til relevante nasjonale og internasjonale retningslinjer. Og dette prosjektet ble godkjent av Medical Research dyreetikk Committee of Sun Yat-sen-universitetet.
Cell Culture
HCT116 (ATCC, CCL-247) og HT29 (ATCC, HTB-38) koloncancercellelinjer ble holdt i DMEM /F12 supplert med 10% FBS, 200 U /ml penicillin, 200 ug /ml streptomycin. Tumorsphere media (også kalt serumfritt medium, SFM) besto av DMEM /F12 media supplert med 1 x B27 (Invitrogen), EGF (20 ng /ml, Peprotech), bFGF (10 ng /ml, Peprotech), rutine insulin (5 ug /ml, Invitrogen), 200 U /ml penicillin og 200 ug /ml streptomycin. For 3D suspensjonskultur, ble HCT116 og HT29-celler dyrket i to-dimensjonal monolag spaltet med trypsin, resuspendert og deretter sådd ut ved en tetthet på 2 x 10
6 celler i SFM i 100 mm ultralave feste retter (Corning) i 37 ° C i en fuktet 5% CO2? 95% luft atmosfære.
Påvisning av CD133 Expression ved flowcytometri
celler avledet fra monolags kulturer og opphengskuler på dag 7 etter primærkultur ble oppdaget for uttrykket av CD133. Cellene ble vasket to ganger i kald PBS, og deretter cellesuspensjon ble inkubert ved 4 ° C med 1:10 FITC-konjugert musemonoklonalt antihumant CD133 Ab (Miltenyi Biotec) i 45 minutter i mørket. Etter inkubasjon ble cellene vasket to ganger i kald PBS med 1% BSA og resuspendert i 400 ul kald PBS med 1% BSA i strømningscytometri-analyse i løpet av en time.
Selv fornye og Multi-differensiering Assay
sfæroide celler ble dissosiert til enkeltceller og sådd ut i 6-brønns plater på 100 celler per brønn i 2 ml SFM. For å evaluere selv fornye kapasitet på sfæroide celler, ble celle immunfluorescens farging av Lgr5 og CK20 utført etter 7 dagers dyrkning. Celledifferensiering ble indusert ved dyrking i DMEM /F12 supplert med 10% FBS i vanlige kolber. Fire uker senere ble den samme cellen immunfluorescens farging utført, og uttrykk for CD133 ble bestemt av FCM som beskrevet før.
Cell Proliferation og Colony Forming analyse
encellede suspensjoner av spheroid og adherente celler ble preparert og tilsådd på 1 x 10
4 celler per brønn i 96-brønners plater, og dyrket i enten SFM eller seruminneholdende medium i 24 timer. Celleformering ble utført på dag 1, 2, 3, 4, 5, 6 og 7 ved hjelp av celletelling leder-8 (Dojindo, Japan). Platen kolonidannelse analyse ble utført for å bestemme den kolonidannelse effektiviteten av cellen i de fire gruppene. Enkeltcellesuspensjoner ble sådd ut i 1 x 10
2-celler per brønn i 6-brønners plater, og dyrket i seruminneholdende medium ved 37 ° C i 5% CO2 i 2 uker. Deretter ble platene farget med Giemsa-Wright flekken. Antallet kolonier i hver brønn ble telt og fotografert. Eksperimentene ble utført uavhengig er minst tre ganger.
homogenitet og heterogenitet Klebe Assay
adhesjon evnen til cellene til ECM ble testet ved bruk av fibronektin (FN)-belagte 96-brønners plater (Corning) . Enkeltcellesuspensjoner av sfæroide og adherente celler ble sådd ut (10
5 /brønn) og inkubert ved 37 ° C i 2 timer, deretter vasket med PBS for å fjerne ikke-klebende celler. Delt OD på 570 nm bølgelengde var fast bestemt på å gjenspeile de FN-heftende celler ved hjelp av celletelling Kit-8 (Dojindo, Japan). Adhesjonen av celler evne til homogene-celler ble testet ved anvendelse av monolagscellene-asfalterte 96-brønners plater. Sfæroide og adherente celler ble sådd ut på 10
5 per brønn, og inkubert ved 37 ° C i 60 min, 90 min og 120 min. Da de ikke-klebende celler ble talt opp og homotypisk lim aktivitet ble beregnet ved hjelp av formelen:. Homotypisk vedheft (%) = (total celle nummer – ikke-klebende celler) /total celler x 100%
Migrasjon og invasjon assays
migrering og invasjon analyser ble utført i 24-brønners plate Transwell kamre med 8 um porestørrelse polykarbonat-filterinnsatser (Corning). Totalt 5 × 10
4 eller 10
5 dissosiert spheroid eller heftende celler ble sådd på ubestrøket eller Matrigel-belagte innstikk i 100 ul serumfritt medium innsatser for migrasjon eller invasjon analyser hhv. De nedre kamre ble fylt med 0,5 ml 10% FBS-supplert DMEM /F12-medium. Etter 24 timer og /eller 48 timer ble cellene på oversiden av filteret fjernet og cellene på den nedre overflate av innsatsen ble fiksert og farget med krystallfiolett. Antallet fargede celler ble tellet under et lysmikroskop. Analyser ble utført i triplikater.
Western Blot analyse
Det totale celleekstrakter ble separert ved 10% SDS-polyakrylamid-gel-elektroforese og overført til polyvinylidenfluorid membran (Millipore) for ICAM-1, CXCR4 og VEGF deteksjon. Membranene ble vasket i Tris-bufret saltvann med Tween (TBST, bestående av 10 mM Tris-HCl, pH 8, 150 mM NaCl og 0,05% Tween 20), blokkert i 1 time ved romtemperatur med 5% fettfri melk i TBST og deretter probet 1 time ved romtemperatur med anti-ICAM-1 (Santa Cruz Bioteknologi), anti-CXCR4 (Abcam), anti-VEGF (BD Pharmingen) og anti-GAPDH (Peprotech). Etter inkubasjon med pepperrot peroksyd-konjugert sekundært antistoff, ble immunoreaktive proteiner påvist ved ECL-deteksjonssystem (Millipore). Proteinkonsentrasjoner ble bestemt ved hjelp av BCA protein assay kit (ThermoScientific biovitenskap).
Isolasjon og vurdering av EPCs
mononukleære celler ble isolert ved densitetsgradientsentrifugering fra menneskelig navlestrengsblod og dyrket i fibronectin belagte kolbe bruker M199 supplert med 20% FBS og 1% ekstrakter av mus hjernevev. EPCs ble renset basere på annen etterlevelse rate, og ikke-heftende celler i løpet av 24 timer ble overført til en annen fibronektin-belagt kolbe. Etter 14 dagers dyrking, ble EPCs inkubert med PE-CD133, FITC-CD34, PE-VEGFR2 eller isotype-matchet IgG-kontroller og identifisert ved flowcytometri som beskrevet før.
celleproliferasjon og migrasjon av EPCs
enkelcellesuspensjon av EPCs ble sådd ut ved 2 x 10
4 celler per brønn i 96-brønners plater, og dyrket i M199 inneholdende 0, 20%, og 40% supernatant fra celleklump eller adherente celler. Celleformering ble utført på dag 1, 2, 3, 4, 5, 6 og 7 ved hjelp av celletelling leder-8 (Dojindo, Japan). Migrasjon analyser ble utført for å evaluere rekruttering av EPCs av spheroid eller heftende celler. Enkeltcellesuspensjon av EPCs ble inokulert med 5 x 10
4 celler per brønn på innstikk i 100 ul serumfritt medium. De nedre kamre ble fylt med 0,5 ml DMEM /F12 inneholdende 40% supernatant av sfæroide eller adherente celler. Etter 24 timer ble overført celler regnet som beskriver før. Analysene ble utført i tre paralleller.
In vitro
kapillarrør Formation
Supernatantene av HT29, ble HT29 Sphere, HCT116 og HCT116 Sphere lagt til 24-brønners plater (Corning Inc ) belagt med vekstfaktor redusert Matrigel (BD Biosciences). For å illustrere hvis rør dannelsen kapasitet EPCs kan påvirkes ved å blokkere VEGF, bevacizumab (Avastin, et VEGF monoclone antistoff, Genentech Inc) ble tilsatt til supernatanten til sfæroide-celler ved en konsentrasjon på 0,25 mg /ml som en annen to grupper [30], [31]. Deretter totalt 5 x 10
4 EPCs ble podet og inkubert ved 37 ° C, 5% CO2 i 3 til 30 timer. Etter 24 timer ble kapillarrør tellet i tilfeldige områder fra hver brønn. Analysene ble utført i tre paralleller.
ELISA
For å demonstrere en parakrint effekten av kreftstamceller og bekrefte resultatet av VEGF deteksjon fra Westerm Blot analysen undersøkte vi VEGF-sekresjon av kreft stamceller ved hjelp en kvantitativ metode. VEGF-konsentrasjonen i supernatanten av sfæroide /adherente celler ble bestemt ved hjelp av ELISA (R 0,05 eller ble 0,01 ansett som signifikant eller stor betydning statistisk
Resultater
Generation og karakterisering av Colonospheres
Både HCT116 og HT29 tykktarmskreftceller. vokste i store runde, ufestede flytende sfæroide kolonier (betegnet colonospheres) når de ble dyrket i serumfritt medium supplert med 1 x B27, 20 ng /ml EGF, 10 ng /ml bFGF (figur 1). Hyppigheten av kuledannende celler ble bestemt ved å utføre en ekstrem begrensende fortynning analyse (ELDA) for paren og colonospheres-avledet HCT-116-celler. Frekvensen for dannelse av sfærer ble funnet å være 5,5 ganger høyere for celler avledet fra colonospheres enn de fra foreldrecellelinjer.
Både HCT116 og HT29 kan danne store runde med løs flytende colonsphere på 50-100 um når de dyrkes i SFM. Når sfæroide cellene ble dyrket i 10% FBS inneholder medium, de flytende sfæroide celler festet til plast, gradvis flyttet fra colonspheres og forvandlet til heftende celler.
De sfæroide celler viste høyere nivåer av CD133 og Lgr5 (kjent som kolon CSC markører), men lavere nivåer av differensiert epitel celle markør CK20 enn de tilsvarende foreldre celler. Andelen av de CD133 positive celler ble funnet å være mindre enn 1% i foreldrecellelinjer, men mer enn 80% observert i sfæroide celler (figur 2). Når colonospheres ble utsatt for immunofluorescens farging for Lgr5, ble åpen Lgr5 farging observert på overflaten av de sfæroide celler som indikerer tilstedeværelsen av cscs i colonosphere (figur 2). Når de sfæroide celler ble dyrket i 10% FBS inneholdende medium, er de festet til plasten, gradvis overført fra tykktarm kuler og skiftet til adherente celler morfologisk. Flowcytometri og immunfluorescens undersøkelse viste nedregulert CD133 og Lgr5 uttrykk med oppregulert CK20 etter 4 ukers dyrking (figur 2). Resultatene tyder på at cscs ble effektivt beriket i sfæroide celler, og de har kapasitet til å fornye seg selv og multi-differensiering.
CD133 (kjent som kreftstamcelle markør) uttrykk stiger fra ≤1.2% opp til 60 % -80% når de dyrkes i SFM, men reduseres til 5% -10% når colonsphere endret tilbake til adherente celler. Den samme endringen av Lgr5 (kjent som krypten stamcelle markør) uttrykket kan bli funnet mens CK20 uttrykk, markør for differensiert epitelceller, viste negativ endring.
spheroid Cells Vis større kapasitet til spredning og Clone Dannelse
Vi videre fastslått om sfæroide cellene har kapasitet for høyere celleproliferasjon ved hjelp av CCK-8 analysen. De proliferations av sfæroide cellene var høyere enn for foreldre motstykke etter en periode med tilpasning til serum inneholdende medium (figur 3A og 3B). Og kapasiteten av kolonidannelse i sfæroide celler grupper var høyere enn for foreldre motstykke (figur 3C og 3D).
(A-B) spredning av HCT116 og HT29 sfæroide cellene var høyere enn for foreldre kolleger etter en periode med tilpasning til serum som inneholder medium. (C-D) Kapasiteten på kolonidannelse i sfæroide celler grupper var høyere enn for foreldre motstykke.
spheroid Cells Vis Nedre Heft men Høyere
in vitro
Migratory /invasiv kapasitet
for å undersøke ondartet profilen til sfæroide celler, gjennomførte vi in vitro analyser for å vurdere vedheft og vandrende /invasiv kapasitet på sfæroide celler i sammenligning med sine tilhenger kolleger. Resultatene av celleadhesjon assay demonstrert at sfæroide celler har lavere kapasitet for både adhesjon til FN (en av hovedkomponentene ECM) og adhesjon til sine naboer homogene, sammenlignet med deres parentale celler (figur 4A og 4B). Deretter CXCR4 og ICAM-1-ekspresjon i HCT116 /HT29 sfæroide-celler ble undersøkt og sammenlignet med deres parentale celler. ICAM-1-nivå var beskjedent nedregulert, mens CXCR4 ekspresjon var oppregulert i HCT116 /HT29 sfæroide celler når sammenlignet med HCT116 /HT29-monolagsceller henholdsvis (figur 4C).
(A-C) sfæroid cellene har lavere kapasitet på begge adhesjon til FN (A) og til deres homogene naboer (B), som sammenlignet med deres parentale celler. ICAM-1-ekspresjon i celler som var speroid beskjedent nedregulert, mens CXCR4 ekspresjon var oppregulert i forhold til HCT116 /HT29-monolagsceller henholdsvis (C). (D og E) HCT116 /HT29 sfæroide celler viste en 3,8 ganger (p 0,01) og 4 ganger (p 0,001) vekst i kjemotaktisk potensialet ved 24 timer (D). Flere sfæroide celler ble åpenbart observert å invadere Matrigel i forhold til foreldre kolleger (p 0,001 og p 0,05, henholdsvis E).
Ved hjelp av Transwell migrasjon kamre, fant vi at sfæroide celler vise en betydelig økning i celle motilitet. Sammenlignet med HCT116 /HT29-adherente celler, HCT116 /HT29 sfæroide celler viste en 3,8 ganger (p 0,01) og 4 ganger (p 0,001) vekst i kjemotaktisk potensialet ved 24 timer, henholdsvis (figur 4D). Disse cellene viste også høyere kapasitet til å invadere Matrigel-belagte innstikk i Transwell migrasjon kamre. Flere HCT116 /HT29 sfæroide celler ble åpenbart observert å invadere Matrigel sammenlignet med tilsvarende heftende celler (p 0,001 og p 0,05, henholdsvis) (figur 4E). Disse resultatene indikerer at sfæroide celler er utstyrt med lavere adhesjon, men høyere trekkfugl /invasiv kapasitet, en funksjonell fenotype forbundet med tumor aggressivitet.
spheroid Cells Fremmer spredning, migrasjon og Tube Dannelse av EPCs Gjennom Up regulerende VEGF Expression
Purified EPCs ble oppnådd fra humant navlestrengsblod. Strømningscytometri-analyse viste at EPCs i senere trinn vises en viss ekspresjon av CD34 og CD133, men ekspresjon i høyt nivå av VEGFR2 (figur 5A-5C). Celleproliferasjon og migrering av EPCs som induseres av supernatanter av sfæroide cellene var høyere enn deres motparter (figur 5D og 5E). Røret-analysen viste at flere rør dannet i spheroid celler gruppe enn heftende celler gruppe. I tillegg, når 0,25 mg /ml bevacizumab (Avastin, et VEGF monoklonalt antistoff) ble tilsatt i supernatanten av sfæroide celler, ble røret dannelsen kapasiteten EPCs trykkes (figur 6A). Deretter VEGF-sekret i supernatanter av sfæroide /adherente celler ble påvist ved hjelp av ELISA. Resultatene viste at konsentrasjonen av VEGF i supernatanten av adherente celler var lavere enn sfæroide celler (Figur 6B). Ekspresjonen av sfæroide /adherente celler ble evaluert ved hjelp av Western blot (Figur 6C). Resultatene viste at VEGF kan spille en viktig rolle i effekten av sfæroide celler på EPCs, som foreslo at sfæroide celler kan fremme angiogenese av EPCs gjennom opp- regulere VEGF uttrykk.
(AC) EPCs følge Fn belagt kolbe etter 72 timer og EPCs kloner kan sees etter en uke (A), og nåværende brosteinen-lignende tegn etter to uker (B). EPCs i senere trinn vise en viss ekspresjon av CD34 og CD133, men ekspresjon i høyt nivå av VEGFR2 (C). (D, E) Celleproliferering (D) og migrasjon (E) av EPCs behandlet av supernatanter av sfæroide cellene var høyere enn sin motpart.
(A) Tube dannelsen av EPCs behandlet av supernatanter av spheroid cellene var høyere enn sine kolleger. Og tube dannelsen av EPCs ble undertrykt når vi blokkere funksjonen til VEGF med bevacizumab. (B) Den VEGF-konsentrasjonen i supernatanter av sfæroide cellene var høyere enn de av adherente celler. (C) Høyere VEGF uttrykk ble observert i sfæroide celler sammenlignet med sine kolleger.
spheroid Cells ha høyere Svulst og metastatisk potensial
in vivo Hotell og EPCs kan øke disse egenskapene
De sfæroide celler viste signifikant høyere tumorigencity enn heftende celler (Figur 7A, 7B og 7E). Når 2 x 10
6-celler ble inokulert i nakne mus, alle musene utviklet tumorer. Transplanterte svulster ble bekreftet som tykktarm kreft med hematoksylin-eosin farging. Og volumene av subkutan tumor i sfæroide celler grupper var signifikant høyere enn den for adherente celler grupper. Videre er volumene av subkutan tumor i sfæroide celler pluss 1/10 EPCs gruppene var høyere enn for rene sfæroide celler grupper (figur 7C, 7D og 7F). Men ingen signifikant forskjell ble funnet mellom rene sfæroide celler og sfæroide celler pluss 1/100 EPCs (data ikke vist). Deretter blodkar tetthet i tumorvev ble evaluert ved hjelp av CD31 immunfluorescens farging. Flere blodårer ble funnet i celleklump-celler sammenlignet med gruppen adherent celler gruppe, og enda mer angiogenese i tumorvev ble observert i den kombinerte gruppen av HCT116 sfære pluss 1/10 EPCs (figur 7G-7J). Og MVD ble telt i henhold til den ikke-spesifikt polyklonalt CD31 antistoff. For å bestemme den EPCs bidraget, utførte vi IF farging under anvendelse av human-spesifikke monoklonale CD31 antistoff. Resultatet viste flere blodårer i den kombinerte gruppen av HCT116 sfære pluss EPCs enn rene sfæroide celler (figur 7K-L).
(A-F) den sfæroide celler viste signifikant høyere enn tumorigenecity adherente celler (A, B, E). Og volumene av subkutane tumorer i sfæroide celler pluss EPCs grupper var større enn de av sfæroide celler grupper (C, D, F). (G-J) microvessel tetthet (MVD) av tumoren utviklet av HCT116 sfæroide celler (H) var høyere enn den til HCT116 (G). Den høyeste MVD blant disse gruppene ble funnet i tumorvev utviklet fra HCT116 sfære pluss 1/10 EPCs (I, J). Og flere blodkar utviklet fra humane EPCs i HCT116 sfære pluss EPCs gruppe (L) ble funnet enn i ren sfæroide celler gruppe (K). (M) De HCT116 sfæroide celler utviklet mer levermetastaser enn HCT116.
Som levermetastaser var bekymret, fire mus (4/5) utviklet levermetastaser i spheroid celler gruppe, men bare ett muse (1/5) gjorde i vedheftende gruppe. Metastatiske svulster ble også bekreftet som tykktarm kreft med hematoksylin-eosin-farging (figur ikke vist). Resultatet av levermetastaser telling viste lignende resultater (fig 7M). De samlede betingelser for musene i sfæroide celler gruppen er dårligere enn de som er i vedheftende celler gruppe, og noen av dem er utviklet ascites og alvorlig avmagring. Og det var ingen signifikant forskjell mellom sfæroide celler pluss EPCs (med forholdet mellom 10:01 og 100:1) grupper og sfæroide celler grupper (data ikke vist).
Clinical Evidence for kreftstamceller Fremme Angiogenese i Human tykktarm kreft
For å støtte våre eksperimentelle funn, undersøkte vi om tykktarmskreft stamceller fremme angiogenese innen human tykktarm kreft, og normal slimhinne fra samme pasient som kontroll. Den immunfluorescens farging av CD133 /Lgr5 (markør tykktarmskreft stamcelle) og blodkar EC markør CD31 ble utført. Som vi alle vet, det er flere microvessels i kreftvev enn normalt vev. I tillegg til dette, har vi funnet at høyere microvessel tetthet i området berikende kreftstamceller i ferske eksemplaret av menneskelige tykktarmskreft (Figur 8).
(A) Flere microvessels i kreftvev enn normalt vev ble observert ved immunfluorescens farging av CD133 og CD31 av normal slimhinne og tykktarmskreft. Og høyere MVD ble funnet i området berikende CD133
+ kreftstamceller i tykktarm kreft vev. (B) Høyere MVD (CD31
+) ble funnet i området berikende Lgr5
+ kreftstamceller i tykktarm kreft vev.
Diskusjoner
På 70-tallet av forrige århundre, Fidler IJ et al. [32] foreslåtte konseptet for tumor heterogenitet, som antar var det forskjellige fenotyper i tumorvevet. Kreft stamcelle teorien ble formet basert på dette konseptet. Cancer stamcelle er generelt definert som en liten sub-populasjon av tumorceller som bærer selvfornyelse og flerretnings differensiering potensiell [11]. Opp til nå, har eksistensen av kreft stamceller blitt bekreftet i flere faste tumorer, inkludert kreft i tykktarmen. Ifølge denne hypotesen, er liten subpopulasjon av kreft stamceller var som bærer hele karakteristisk for maligne tilstander inkludert uendelig proliferasjon, invasjon og metastase, tilbakefall og resistens overfor terapi.
I dag, mye brukt metode for å isolere eller anrike kolon kreft stamceller er celle sortering basert på celleoverflatemarkører som CD133, Musasai-en, CD44, EpCAM, Lgr5, etc. Ricci-Vitiani L et al. rapporterte CD133
+ celler som står for ca 2,5% av tumorceller er virusets tumorgene styrke cellene i tykktarm kreft [33]. Subkutan injeksjon av tykktarmskreft CD133
+ celler lett reprodusert den opprinnelige svulsten i immunsvikt mus, mens CD133
– cellene ikke utvikler svulster. Men det var fortsatt mange ulike meninger om disse kreftstamcellemarkører. For eksempel Shmelkov SV foreslo at CD133 uttrykk ikke er begrenset til stamceller, og begge CD133
+ og CD133
– metastatiske tykktarm kreft celler initiere svulster [12]. Noen forskere rapporterte de fargestoff effluxing side befolknings celler som uttrykker ABCG2, en ATP-bindende kassett halv transporter, kan isoleres som kreftstamceller [34], [35], [36]. Men flere studier viste bevis mot en sammenheng mellom SP befolkningen og kreftstamceller. SP-celler isolert fra MKN28 magekreftceller ikke produsere tumor i en xenograft modell [37]. Videre, SP og ikke-SP celler av tykktarmskreft cellelinjer demonstrere tilsvar multipotential differensiering kapasitet og lignende tumorigenicity i xenograft modell [38].
I denne studien har vi fått svulst kuler fra HCT116 og HT29 tykktarmskreftcelle linjer ved å dyrke disse cellene i serumfritt medium [39], [40]. Og følgende analyse indikerte at CD133 og Lgr5 uttrykk for disse sfæroide cellene var høyere enn deres foreldre motstykke, mens CK20 uttrykk var lavere som representerer den differensierte endotelceller. De motstridende fenotyper ble oppdaget da sfæroide cellene ble overtalt til å differensiere i FBS inneholder medium.
