PLoS ONE: En shRNA Basert Genetisk Screen Identifisert Sesn2 som en potensiell Tumor lyddemper i Lung Cancer via Suppression of Akt-mTOR-p70S6K Signa

Abstract

Bakgrunn

Lungekreft fremstår raskt som den ledende dødsårsaken i kinesiske kreftpasienter. Årsaksfaktorer for kinesisk lungekreft utvikling fortsatt i stor grad uklart. Her benyttet vi en shRNA bibliotek basert tap-av-funksjon skjermen i et genom-wide og objektiv måte å avhøre potensielle tumor suppressor kandidater i udødeliggjort human lunge epitel cellelinje BEAS-2B.

Metoder /Resultater

soft agar-analyser ble utført for screening BEAS-2B-celler infisert med retrovirale shRNA bibliotek med den ervervede funksjon av forankrings-uavhengig vekst, stor (mer enn 0,5 mm i diameter) og godt separerte kolonier ble isolert for proliferasjon . PCR ble utført for å amplifisere den integrerte shRNA-fragmentet fra individ genomisk DNA ble ekstrahert fra hver koloni, og hvert PCR-produkt blir sendt for DNA-sekvensering for å vise den integrerte shRNA og dens målgenet. Totalt seks kandidat transformasjon dempere inkludert INPP4B, Sesn2, TIAR, ACRC, Nup210, ble LMTK3 identifisert. Vi validert Sesn2 som kandidat for lungekreft tumor suppressor. Knockdown av Sesn2 av en shRNA targeting 3 «UTR av Sesn2 transkripsjon potent stimulert spredning og malign transformasjon av lunge bronkial epitelceller BEAS-2B via aktivering av Akt-mTOR-p70S6K signalering, mens ektopisk uttrykk for Sens2 gjentrykt malign transformasjon fremkalte av Sesn2 shRNA. Videre knockdown av Sesn2 i BEAS-2B-celler fremmet BEAS-2B celle-xenograft transplanterte tumorvekst i nakne mus. Til slutt, DNA-sekvensering angitte mutasjoner i Sesn2 genet er sjeldne, proteinnivåer Sesn2 av 77 kinesiske lungekreftpasienter varierer sterkt i forhold til sine tilstøtende normalt vev, og det lave ekspresjonsnivået av Sesn2 forbinder med dårlig overlevelse hos disse undersøkte pasienter ved Kaplan Meier analyse.

Konklusjoner

Våre shRNA-basert skjerm har vist Sesn2 er en potensiell tumor suppressor i lunge epitelceller. Uttrykket nivået av Sesn2 kan tjene som en prognostisk markør for kinesiske lungekreftpasienter i klinikken

Citation. Xu H, Sun H, Zhang H, Liu J, Fan F, Li Y, et al. (2015) En shRNA Basert Genetisk Screen Identifisert Sesn2 som en potensiell Tumor lyddemper i Lung Cancer via Suppression of Akt-mTOR-p70S6K signale. PLoS ONE 10 (5): e0124033. doi: 10,1371 /journal.pone.0124033

Academic Redaktør: Max Costa, New York University School of Medicine, USA

mottatt: 22 desember 2014; Godkjent: 03.03.2015; Publisert: 11. mai 2015

Copyright: © 2015 Xu et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres

Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer

Finansiering:. Finansieringen ble gitt av stiftelsen Natural Sciences of China (bevilgning nr 81272582). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer

Innledning

Lungekreft fremstår som den mest vanlige og dødelige kreftformen hos Kina, samt i verden [1,2]. På grunnlag av patologiske funksjoner, kan lungekreft deles inn i to hoved subtyper, ikke-småcellet lungekarsinom (NSCLC) og småcellet lungekreft (SCLC). NSCLC som står for mer enn 80% av alle lungekreft tilfeller kan videre deles inn i adenokarsinom (~ 48%), plateepitelkarsinom (~ 28%) og stor celle karsinom (~ 24%) [1,3]. Til tross for store fremskritt oppnådd i diagnostikk, kirurgisk operasjon, strålebehandling og målrettet terapi, fortsatt har lungekreft en ganske dårlig prognose og sin 5 års overlevelse er fortsatt så lav som 10% -15% de siste 30 årene [3].

De mekanismene som driver utviklingen av kreft lunge er komplekse, genetiske forandringer, røyking og ulike miljøforurensinger er vanlige årsaksfaktorer knyttet til lungekreft forekomst. Tumor dempere med tap-av-funksjon mutasjoner, slettinger og /eller epigenetisk lyddemping spiller ofte en avgjørende rolle i lunge tumorigenesis [4]. For eksempel kan den mutasjonshastigheten av p53-genet i ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) kommer til 60%, og var til og med opp til 80% i småcellet lungekreft (SCLC) [5]. Andre kreftdempere som PTEN med mye lavere mutasjonsraten også involverer i lunge adenokarsinom [6]. I tillegg til å bedre forstå de molekylære forandringer fant sted i løpet lunge celle ondartet transformasjon, oppdagelse av lungecancerrelatert tumorsuppressorgener gir også en mer effektiv og tilpasset terapier for behandling av lungekreft [7]. For dette formål, for å identifisere nye kreftdempere i et genom-wide og objektiv måte er en av de sentrale oppgavene for lungekreft forskning. Men å identifisere de nye tumorsuppressorgener er ganske vanskelig på grunn av deres recessive uttrykk natur. Cancer hel genomisk analyse indikerer at det er mange lav ratio mutasjoner i tumorcellene, og mutasjonene kan variere mellom opprinnelsen til vev [8]. En shRNA bibliotek basert tap-av-funksjon skjermen rettet mot menneskelig transkriptomet å avhøre potensielle tumor suppressor kandidater systematisk immortaliserte humane celler har vist seg å være en kraftig tilnærming for identifikasjon av nye kreftdempere [9,10], ved å bruke denne tilnærmingen, en rekke nye tumor suppressors inkludert Rest, PTPN12, etc. ble oppdaget [11,12].

Sestrins tilhører en liten og evolusjonære konservert familie bestående av tre medlemmer i pattedyr, hvorav Sesn1 og Sesn2 er stresset induserbar og p53 regulert [13,14]. Evnen til Sesn1 og Sesn2 for å hemme cellevekst og proliferasjon ble tilskrevet deres hemming av mTORC1 aktivitet gjennom en AMPK avhengig mekanisme i en rekke humane og musecellelinjer, så vel som i muselever [15].

konsekvensen av Sesn2 i kontroll av cellevekst og overlevelse er fortsatt kontroversielt. Den nøyaktige rollen til Sesn2 på celle overlevelse kan avhenge av arten av stress. Det er blitt vist at ekspresjonen Sesn2 hemmer cellevekst og proliferasjon i respons til genotoksiske spenning (for eksempel DNA-skade) og Sesn2 mangel gjengir murin fibroblast mer utsatt for onkogene transformasjon via lindring av p53 avhengig hemming av mTOR [16]. Videre forhøyet Sesn2 hemmet IR-indusert mTOR-signalisering og sensibiliserte MCF7 celler til IR-bestråling [17], i motsetning til ekspresjonen av Sesn2 beskyttet ischemi, lav glukose og H

2o

2-indusert apoptose i LNCaP-celler [18 ].

Resultater

shRNA skjermen for transformasjon undertrykkere av lunge epitelceller

Anchorage uavhengig vekst er et kjennetegn på mobil malign transformasjon

in vitro

. De transformerte cellene mister kontakten hemning, kan vokse og overleve uten å feste seg til kulturen matrisen. Derfor myk agar analyse for å måle forankringsuavhengig vekst er en nyttig metode for å finne nye transformasjon suppressor gener [19]. Som de fleste lungekreft oppstår fra epitelceller, valgte vi bronkiale epitelceller BEAS-2B til den primære skjermen. BEAS-2B celler avledet fra sunt menneske lungevev ble transformert med SV40-Large T-antigen. Disse cellene er udødeliggjort, men manglende evne til å spre seg effektivt i fravær av ekstracellulære matriks og danne tumorer i nakne mus [20]. Vi infisere BEAS-2B celler med retroviral shRNA bibliotek konstruert i pSM2 retroviral vektor. Den shRNA bibliotek består av 87,283 shRNAs rettet mot 32,216 menneskelige karakterutskrifter [9,10]. Biblioteket ble vist i 72 bassenger med 1000 shRNAs per bassenget ved hjelp av en protokoll som er beskrevet tidligere (fig 1A) [21]. De infiserte BEAS-2B-celler ble selektert med 0,5 ug /ml puromycin i 1 uke, og deretter, vurdert vi de infiserte celler for forankrings-uavhengig proliferasjon (figur 1B). Både den negative kontrollen shFF2 og shRNA bibliotek infisert BEAS-2B-celler ble dyrket i 0,35% toppagar i tre uker. Vi telte koloni tall fra shFF2 kontroll og shRNA bibliotek plater av fiolett krystall farging. Mens shFF2 celler indusert mye mindre og færre antall koloni, biblioteket forvandlet cellene fremkalte mye flere og større kolonier i den øvre myk agar medium. De gjennomsnittlige antall transformert koloni var 86 ± 20 per 10 cm plate for shFF2 celler og 205 ± 35 for shRNA bibliotek celler basert på resultater fra tre uavhengige eksperimenter (fig 1c). Den store (mer enn 0,5 mm i diameter) og godt separerte enkle kolonier ble plukket for ekspansjon i vanlig monolagskultur. Omtrent 100 forankrings selvstendige individuelle kloner ble isolert og dyrket. Det genomiske DNA av en enkelt koloni ble ekstrahert og PCR ble utført for å amplifisere DNA-hårnål av den integrerte shRNAs og fulgt ved å sende til Sanger DNA-sekvensering. Selv om de fleste PCR produktene ikke klarte å produsere informative DNA-sekvense resultater på grunn av enten tekniske problemer eller flere arter av shRNAs eksisterende i en enkelt genom, vi fortsatt var i stand til å identifisere en totalt 6 individuelle gener målrettet av 6 unike shRNAs gjennom sekvensering provirale shRNAs fra disse individuelle kloner (Tabell 1 og S1 Tabell for detaljert informasjon). Blant de seks søker transformasjon dempere, er INPP4B en kjent tumor suppressor involverer i bryst- og prostatakreft [22,23], har rollene til resten kandidat gener i undertrykkelse av celletransformasjon ikke vært klart eller godt preget ennå. Siden Sesn2 genet har vært innblandet i cellulær regulering via p53 signalveien, derfor valgte vi Sesn2 som toppkandidat tumor suppressor og validert sine cellulære funksjoner både

in vitro Hotell og

in vivo

.

(A) et skjematisk diagram av en genetisk skjerm for transformasjon undertrykkere av BEAS-2B-celler. Retrovirus som bærer shRNA-biblioteket ble dannet ved transfeksjon av virale emballasje celler med shRNA plasmider. BEAS-2B-celler ble infisert med FF2 shRNA eller shRNA bibliotek virus og dyrket i myk agar i 10 cm plater i 3 uker, store og enkle kolonier ble isolert for celle ekspansjon, PCR-amplifikasjon og DNA-sekvensering av den integrerte shRNAs. (B) Representative bilder av kolonier dannet på myke agarplater. Transformerte kolonier ble observert av krystallfiolett farging (øvre panel) eller under lysmikroskopi ved 20x forstørrelse (nedre panel). (C) Flere og større forankrings selvstendige kolonier ble dannet i bibliotekinfiserte celler enn i shFF2 infiserte celler, blir data presentert som gjennomsnitt koloni antall ± standardavvik per plate basert på tre uavhengige smitteforsøk, *

p

0,05 ved t-test.

Sesn2 undertrykker ondartet transformasjon av BEAS-2B celler

Sesn2, først identifisert som Hi95, er en hypoksi induserbar protein og viser en funksjon av å inhibere mTOR signalveien [18]. Noen undersøkelser har vist at det kan virke som en tumor suppressor på grunn av sin hemming av celleproliferasjon, men det finnes ingen direkte bevis på at [16]. Fra våre shRNA basert genetisk skjerm og DNA-sekvensering resultater, fant vi tre BEAS-2B transformerte kolonier huser et identisk shRNA targeting 3 «UTR av Sesn2 transkripsjoner (utpekt som shSesn2-1, for shRNA sekvens informasjon se S1 tabell). For å utelukke off-target effekter, vi designet og testet to mer shRNAs (navngitt som shSesn2-2 og shSesn2-3, se S1 tabell) rettet mot ulike regioner av 3 «UTR av Sesn2 transkripsjoner. De cellelinjer som uttrykker Sesn2 som målretter shRNAs ble analysert ved Western blotting og nivået av endogen Sesn2 har blitt redusert med omtrent 80% i shSesn2-2 uttrykkende cellelinje (figur 2A). Vi seeded disse Sesn2-2 støydempere celler i myk agar plater. Etter 3 ukers vekst, oppviste den shSesn2-2 stanse cellekolonidannelse sterk evne med 435 ± 25 kolonier pr 10 cm plate, mens færre og mindre kolonier (106 ± 40 per plate) ble dannet i shFF2 kontrollcelle seeded platene (Fig 2B ). Videre ektopisk uttrykk Sesn2 drevet av pcDNA3.1 vektor i shSesn2-2 stanse celle delvis gjentrykt kolonien formasjon evne utløst av shSesn2-2 (Fig 2B), noe som indikerer de observerte fenotyper var trolig skyldes reduksjon av Sesn2, ikke forårsaket av shRNA off-target effekter. For å teste

in vivo

svulst besøks evne gitt av Sesn2 ble shSesn2-2 og shFF2 celler injisert subkutant i høyre ampits av Balb /c nakne mus. På den 28. dag etter implantering ble det dannede xenograft dissekert fra hver mus, volumet og vekten av hver tumor ble målt og sammenlignet. Som vist i figur 2C, ble en sterk xenograft tumordannelse evne observert i shSesn2-2 uttrykkende celler (for en oversikt over alle tumorer som er dannet av Sesn2 knockdown-cellelinjen i to grupper av nakne mus, se fig S2). De gjennomsnittlige xenograft tumor volum i shSesn2-2 og shFF2 transplanterte mus er 521,45 ± 25.51mm

3og 69,02 ± 31.48mm

3 (Fig 2D), og den gjennomsnittlige tumor vekter var 0,523 ± 0,064 g og 0,156 ± 0,071 g henholdsvis (figur 2E), disse forskjellene er statistisk signifikant (p 0,05 ved Student t-test). Til sammen våre resultater indikerer at knockdown av Sesn2 fremmer malign transformasjon av BEAS-2B celler både

in vitro Hotell og

in vivo

, og Sesn2 kan fungere som en potensiell tumor suppressor i lunge epitelceller .

(A) Slått ned av endogen Sesn2 av to uavhengige shRNAs rettet mot 3 «UTR av Sesn2 transkripsjoner, ble bekreftet av immuno-blotting. (B) Den gjennomsnittlige antall kolonier dannet i shSesn2-2 transformerte celler var 4 ganger høyere enn shFF2 transformerte celler, *

p

0,05. Ektopisk uttrykk for Sesn2 gjentrykt anker uavhengig vekst i shSesn2-2 uttrykker cellene. (C), (D) og (E) knockdown av Sesn2 i BEAS-2B-celler førte til forbedret tumordannelse i nakne mus. De Sesn2 silenced celler ble transplantert inn i armhulene av

Balb /c

nakne mus, xenografter ble dannet en måned senere etter transplantasjonen og fotografert, røde piler angitt dannet svulster under muse huden (øvre panel av C). Bildet av to representative dissekert svulster ble vist i den nedre panel av C. Gjennomsnittlig tumorvolum og vekter fra transplanterte mus med Sesn2 taushet FF2 kontrollceller ble målt og plottet i D og E, er data presentert som gjennomsnitt ± standardavvik per mus gruppe, *

p

. 0,05 av Student t-test

lyddemping Sesn2 av shRNA fremmer både cellevekst og cellemigrasjon

Akselerert cellevekst og cellemigrering er karakteristisk for ondartede transformerte celler. For å utforske effekten av Sesn2 på cellevekst og cellemigrasjon, vi etablert en Sesn2 lyddemping cellelinje ved å infisere retroviral shSesn2-2 inn lunge adenokarsinom A549 celler (figur 3A). Cellecyklus profiler i de resulterende cellelinjer ble bestemt ved flow-cytometri. En høy andel S-fasen ble påvist i shSesn2-2 celler enn det i shFF2 celler (39,22% mot 23,45%, figur 3B) som indikerer stanse av Sesn2 forårsaket akselerert cellesyklusprogresjon. Deretter overvåket vi cellevekst ved MTT-analyse, og fant shSesn2-2 celler spre raskere enn shFF2 celler (p 0,05, figur 3E). Sårheling eksperimenter ble utført i shSesn2-2 og shFF2 celler for å undersøke forholdet mellom ekspresjonen av Sesn2 og cellemigrasjon. Forut for analysen, shSesn2-2 og shFF2 celler ble for-behandlet med mitomycin C for å sikre at lukking av såret skyldtes cellemigrering, men ikke celleproliferasjon. De gjennomsnittlige nedleggelse områdene var 15,30 ± 2,56, 26,03 ± 3,96, 74,93 ± 5,72 på 6t, 12t og 24t følgende scratch skapningen i shSesn2-2 celler og 2,42 ± 1,05, 7,37 ± 1,38, 28,4 ± 4,08 i shFF2 celler henholdsvis (fig 3C og fig 3D). Den raske til lukking av sår i shSesn2-2 celle støttet at mangel på Sesn2 fremmer celle migrasjon av lunge adenokarsinom A549 celler.

(A) konformasjon av Sesn2 knockdown i A549 celler ved immuno-blotting. (B) Et cellesyklus profiler av lunge adenokarsinom A549cell linjer som uttrykker shSesn2-2 og shFF2. Celler ble farget med propidiumjodid og analysert ved strømningscytometri. Jo høyere S fagen andel detekteres i shSesn2-2 celler antydet raskere cellesyklusprogresjon i forhold til shFF2 celler. (C) Representative bilder av sårheling eksperiment utført i shSesn2-2 og shFF2 uttrykkende celler ved de angitte tider. De gjennomsnittlige lukking av sår prosenter i hver cellegruppe er plottet i (D), ble det observert signifikant forskjell helbredelse etter 24 timers av sårheling, *

p

0,05. Forsøk ble utført in triplo. (E) De celle vekst på shSesn2-2 og shFF2 uttrykker celler ble bestemt ved MTT analyser og sammenlignet med de to-veis Anova test (*

p

0,05)

Sesn2 undertrykker Akt-mTOR-p70S60K signale

Implikasjonen at Sesn2 innebærer i å regulere forvandlet staten BEAS-2B epitelceller ber oss om å finne ut hvilke molekylære krets kan bli påvirket av tapet av Sesn2 funksjon. Som Akt-mTOR signalveien spiller en viktig rolle i ulike svulster, og Sestrin familie har vært innblandet i undertrykkelsen av mTORC1 aktivering ved binding til AMPK [24], sjekket vi virkningene på mTOR aktivering ved å stanse all Sesn2 i A549 celler. Vi oppdaget nivåene av fosforylert p70S6K, et nedstrøms mål av mTOR og en indikator for mTOR aktivering, og fosforylert Akt på Ser473, en aktiv arter av Akt, i A549 celler som uttrykker shSesn2-2 eller shFF2. Under normal cellekultur tilstand, de basale nivåene av fosforylert p70S6K, og fosforylert Akt i begge cellelinjene var knapt påvisbar (data ikke vist). Imidlertid, etter tilsetning av 100 nM insulin i serum-sultet to cellelinjer for 20 min, fosforylert p70S6K var detekterbar i begge cellelinjer, men mye mer fosforylert p70S6K ble observert i Sesn2 knockdown celler (figur 4A). Disse dataene indikerer mTOR-p70S6K veien er mer aktivert på Sesn2 lyddemping av shRNAs. Flere tidligere studier har rapportert insulin indusert Akt aktivering hos mus krever intakt mus Sesn2 [25], men vi har fortsatt observert betydelig aktivering av Akt på insulin stimulering i Sesn2 støydempere celler. Vår observasjon kan gjenspeile den kontroversielle rolle Sesn2 som svar på ulike natur stress. Etter avtale med våre funn, over-uttrykk for Sesn2 forårsaket mindre fosforylert Akt-S473, gjengir MCF-7 celler mer følsomme for ioniserende stråling [17]. Samlet våre funn indikerte at Sesn2 kan fungere som en tumor suppressor gen som kan hemme kreft celle spredning levedyktighet gjennom regulering av Akt-mTOR-p70S6K signalveien.

(A) A549-celler som stabilt uttrykker shSesn2-2 eller shFF2 var serum-sultet over natten og re-stimulert med 100 nM insulin i 20 minutter, ble uttrykket nivåer av Akt, p70S6K, og deres fosforylerte arter detektert ved immuno-blotting med angitte antistoffer. (B) intensiteten av proteinbånd på immuno-blottene ble kvantifisert med densitometri skanning. Den relative Ekspresjonsnivået av hvert protein ble normalisert basert på nivået av GAPDH i hvert lysat og plottet i B, ble data er vist som gjennomsnitt ± standardavvik (SD) fra tre uavhengige eksperimenter. *

p

0,05 indikerer en signifikant forskjell i ekspresjonsnivåene av de undersøkte proteiner i de to cellelinjene

lave nivåer av Sesn2 korrelerer med dårlig overlevelse i kinesisk lunge. kreftpasienter

for å etablere en årsakssammenheng mellom avbrudd i Sesn2 funksjon og lunge svulst genesis, samlet vi biopsiprøver fra 77 lungekreft pasienter diagnostisert med svulst sykehuset i Harbin Medical University (de detaljerte clincopathological funksjoner av 77 kinesiske lungekreftpasienter ble oppsummert i S2 tabell). Det genomiske DNA ble ekstrahert fra disse lungekreft vev og deres tilstøtende normalt lungevev. Vi forsterket 3. og 4. eksoner (som er de to DNA-elementer for koding funksjonen domenet til Sesn2) av Sesn2 gener og utsatt PCR produktene til Sanger DNA-sekvensering. Av alle sekvenserte prøver, ble bare to punktmutasjoner Val (GTA) 76 til Ala (GCA), Thr (ACG) 103 til Lys (AAG) i ekson 3 av Sesn2-genet påvist (se tabell 2), og dette to mutasjoner oppstått samtidig. Videre ble bare en lungekreftpasient (1 av 77) funnet huse de to mutasjoner. Den meget lave mutasjonshastighet på Sesn2 genet i human lungekreft antyder den strukturelle endring av Sesn2 genet er ikke en viktig årsak bidratt til malign transformasjon av lunge epitelceller. For å teste om dette Sesn2 mutant forstyrrer funksjonen av endogent villtype Sesn2 introduserte vi en Sesn2 cDNA skjuler den Val76 til Ala og Thr103 til Lys mutasjoner av pcDNA3.1 ekspresjonsvektor inn Beas-2B celler. De transformerte celler med over-uttrykk for Sesn2 mutant klarte å lokke fram opplagt forankringsuavhengig vekst sammenlignet med celler transformert med den tomme vektor (p 0,05) (S2 fig). Denne observasjonen foreslo mutasjoner av Val76 til Ala og Thr103 til Lys i ekson 3 av Sesn2 gen kan ikke være i stand til å produsere en sterk dominant negativ aktivitet minst i BEAS-2B celler.

Neste, vi bestemt protein nivåer av Sesn2 i disse lungekreft vev ved immuno-blotting. Total vev lysater ble dannet ved homogenisering og applisert på SDS-PAGE-oppløsning. Proteininnholdet av Sesn2 ble avslørt av Western blotting med antistoffer mot Sesn2 ble signal intensitet Sesn2 protein kvantifisert ved densitometri skanning (figur 5A). Vi definerer den relative uttrykk for Sesn2 som lav, middels og høy sammenlignet med Sesn2 nivå i sine tilstøtende normale lungevev (detaljene for denne definisjonen ble beskrevet i materiale og metode avsnitt). I sammendraget, av de 77 lungekreftpasienter undersøkt, ble 57 pasienter scoret med lav og middels uttrykk for Sesn2, ble 20 pasienter scoret med høy uttrykk for Sesn2. Vi analyserte uttrykket fordeling av Sesn2 i forhold til deres clinicopathological kategorier som squamous celle karsinom, adenokarsinom og småcellet karsinom så vel som kjønn, alder og den grad av celledifferensiering, fant vi at det ikke er noen signifikant forskjell fra Sesn2 ekspresjon under disse kategorier (se S2 tabell). Dermed er Sesn2 uttrykk nivåer ikke sannsynlig påvirket av disse clinicopathological funksjoner i lungekreftpasienter.

(A) Tissue homogenates fremstilt fra resected lungekreft vev ble utsatt for immunoblot-undersøkt med de angitte antistoffer. Vist er et representativt bilde av en Western blot. Stor bokstav N viser et normalt vev ved siden av en kreftvev, og stor bokstav T med et tall indikerer en kreft vevsprøve fra en enkeltperson lungekreft pasienten. Sesn2 uttrykk nivå ble kvantifisert ved densitometri skanning og normalisert basert på signalet fra lasting kontroll GAPDH, ble detaljerte metoder for å definere protein uttrykk nivå beskrevet i materiale og metode delen. (B) Pasientene ble inndelt i høy ekspresjon og den kombinerte medium lave grupper basert på deres uttrykk nivåer av Sesn2 undersøkt A. Kaplan Meier overlevelsesanalyse viste lav uttrykk for Sesn2 positivt korrelert med en dårlig overlevelse av de undersøkte lungekreftpasienter i løpet av en tre-års oppfølging av deres diagnose, p = 0,015 av en log-rank test indikerer en signifikant forskjell på overlevelse mellom de to pasientgruppene

Vi delte de undersøkte pasientene i den høye uttrykket og den kombinerte medium lave grupper basert på deres uttrykk nivåer av Sesn2. En tre-års overlevelse oppfølging av de 77 lungekreftpasienter ble utført på deres diagnose, Kaplan Meier-analyse indikerte de tre-års overlevelse i det høye og det lave mellom gruppene var 65,00% og 42,11% henholdsvis, log-rank test indikerte en betydelig nedgang i 3-års overlevelse av den lave medium gruppe (p 0,05) sammenlignet med den høye gruppe (Fig 5B). Derfor konkluderer vi lavt uttrykk nivå av Sesn2 forbinder med en dårlig overlevelse hos kinesiske lungekreftpasienter, og uttrykket nivået av Sesn2 kan tjene som en potensiell prognostisk markør for lungekreftpasienter i klinikken.

Diskusjoner

en tap-av-funksjon skjermen ved hjelp shRNA bibliotek er en velprøvd kraftfull tilnærming for identifikasjon av nye og uventede tumor dempere på en objektiv måte. I denne studien, søkte vi denne tilnærmingen for å identifisere gener som undertrykker onkogen transformasjon i human lunge epitelceller. Vi har identifisert flere gener involvert i patogenesen kreft. Selv om genene isolert via denne strategien ikke kan være hyppige mål for mutasjon i tumorer, kan de likevel avsløre nye veier som er relevante for tumorigenesis. For eksempel, det isolert inositol polyfosfat 4-fosfatase type II (INPP4B) genet, en kjent tumor suppressor i bryst, prostata, og i tillegg til andre maligniteter [22,26]. Mutasjonen eller lav ekspresjon av INPP4B har vært nært relatert til dårlig prognose av disse kreftformene [23]. I tillegg identifikasjon av T-celle intracellulær antigen 1-relatert protein (TIAR) støtter tidligere funn om at TIAR er nedregulert i en undergruppe av epiteltumorer og HeLa-celler med redusert TIAR av shRNA produsert større epiteliale transplantater i nakne mus [27 videre ]. Disse kjente kreftrelevante gener identifisert gjennom våre skjermer foreslo andre kandidatgener kan være mer eller mindre knyttet til å dempe forankringsuavhengig spredning, videre eksperimenter har behov for å finne ut i hvilken grad disse genene er involvert i lunge tumorigenesis.

AKT-mTOR veien har spilt en avgjørende rolle i kreftutvikling ved å regulere celleproliferasjon, apoptose og angiogenese [28]. Vi har vist at mangel på Sens2 funksjon øker aktiviteten av AKT-mTOR signalering kan være en viktig mekanisme som ligger til grunn evne Sesn2 å begrense den transformerte tilstand. I overensstemmelse med våre funn at Sesn2 er en cellulær transformasjon suppressor i lunge epitelcellelinje BEAS-2B, har Sestrin familie vært implisert i cellulær proliferasjon og celleoverlevelse via undertrykke pattedyr målet for rapamycin kompleks 1 (mTORC1) ved aktivering av AMP- avhengig proteinkinase (AMPK) i et p53-avhengig måte [15,16,29]. Videre Sestrins mediere den DNA skade følsomme bane sammensatt av ataxia telangiectasia mutated (ATM) og p53, selv om den underliggende mekanisme er uklar så langt [16]. Interessant, rollen Sesn2 i å regulere celleoverlevelse fortsatt kontroversielt. For eksempel: Ved DNA-skader indusert onkogene transformasjon, forhøyet Sesn2 i MCF-7 celler fremmer IR indusert celledød ved apoptose [17]. Men under den energiske stress som ATP mangel forårsaket av to-deoxyglucose (2-DG) eksponering, beskyttet Sesn2 2-DG indusert celledød i både LNCaP celler og mus embryonale fibroblaster [18].

De fleste påfallende den Sesn2 knockout mus ga ingen tumordannelse, og med ingen åpenbare kortsluttet levetid som er i kontrast til sine roller i tumor suppresjon og antiaging demonstrert tidligere [25]. Hvorfor det er slik en fenotypisk uoverensstemmelse oppsto mellom

in vitro

cellulær transformasjon og

in vivo

musemodell? Gitt det faktum at det er tre Sentrin medlemmer i pattedyr med høy homologi (f.eks homologi mellom Sesn1B og Sesn2 er 71%), mest sannsynlig, Sesn2 kan være spille en overflødig rolle i mus og dens mangel kan bli kompensert av sin nære homolog som Sesn1B eller Sesn3. Imidlertid, på et cellulært nivå, utførelse av en slik kompensering kanskje avhengig av den genetiske bakgrunnen under en gitt cellelinje, som kan fullstendig forskjellig fra situasjonen på en hel organisme slik som visse stammer av mus.

I motsetning til tidligere funn som insulin-indusert aktivering av Akt krever tilstedeværelse av Sesn2 demonstrert ved hjelp av Sesn2 knock out mus modell [25], våre data foreslo insulinbehandling var fortsatt i stand til å stimulere økt phoshorylation av Akt-S473 i A549 celler med Sesn2 slått ned av shRNAs. Gitt det faktum at AKT kaskaden kan reguleres ved mange membranproteiner inkludert reseptor-tyrosin-kinaser, integriner, G-protein-koblede reseptorer [30], er det sannsynlig at aktiveringen av Akt i humane celler er delvis uavhengig av den intakte Sesn2. Til støtte for våre funn, over-uttrykk for Sesn2 forårsaket mindre fosforylering på Akt-pS473 i MCF-7 celler [17], og knockdown av AMPKα, en funksjonell partner av Sestrins for hemming av mTORC1, påvirket ikke økningen av Akt fosforylering stimulert av FoxO1activation [29].

genetiske endringer ofte bidra til inaktiveringen av tumorsuppressorgener. Tap av heterozygocity (LOH) i Sesn1 (6q21) og Sesn2 (1p35) er også ofte observert i ulike kreft hos mennesker [14,31]. I motsetning til sin herre p53-genet, fant vi mutasjonsraten av Sesn2 genet i lungekreft vev er svært lav. Blant vevsprøver resected fra 77 lungekreftpasienter, bare én ble oppdaget med punktmutasjoner i Sesn2 genet. Gitt det faktum at 60-80% av lungekreft vev båtplass p53 mutasjoner, og Sesn1 og Sesn2 er direkte mål av p53 mediert transkripsjon, rollen Sesns i tumor genesis kan være en del av en underliggende mekanismen nedskrivning av p53 i lungekreftceller .

Den kliniske relevansen av Sesn2 uttrykk nivå ble evaluert i lungekreft vevsprøver resected fra 77 lungekreftpasienter. Selv om Sesn2 proteinnivåene variere mye i de undersøkte lungevev, er det en klar positiv korrelasjon mellom det lave Sesn2 ekspresjonsnivået og en dårlig overlevelse i de undersøkte lungekreftpasienter. Overraskende, i motsetning til de fleste tumor-suppressorer generelt nedregulert i kreftvev, er det også observert en vesentlig del av høy ekspresjon av Sesn2 (20 av 77) i de undersøkte lungekreftpasienter, deres Sesn2 nivåer, selv er mye høyere enn deres tilstøtende normale lungevev. I første omgang Sestrins har vært implisert i respons til oksidativt stress, inaktivering av Sestrins og akkumulering av reaktive oksygenarter (ROS) er koplet til karsinogenese [32]. Under onkogene tilstander slik som kronisk inflammasjon, langvarig vekstfaktor signalering og høye nivåer av oksidativt stress kanskje skadelig for overlevelse og formering av kreftceller, som et resultat av antioksidant mekanismer, er det ikke overrasket over å observere oppregulert Sestrins i visse deler av Mu76F1:5’-ATGTCCTCTGGGCGAGCAGACAACCTGGCAGTG-3’

Mu76R1:5’-CACTGCCAGGTTGTCTGCTCGCCCAGAGGACAT-3’

Mu103F2:

Legg att eit svar