Abstract
Deregulering av miRNA uttrykk kan bidra til tumorigenesis og andre Patho-fysiologi forbundet med kreft. Ved hjelp TLDA, uttrykk av 762 miRNAs ble sjekket inn 18 par gingivo kinnkreft tilstøtende kontroll vev. Uttrykk for betydelig deregulerte miRNAs ble ytterligere validert i kreft og undersøkt i to typer forstadier til kreft (leukoplaki og lichen planus) vev av primer spesifikke TaqMan analyser. Biologiske konsekvenser av disse mirnas ble vurdert bioinformatically. Uttrykk for
HSA-MIR-1293, HSA-MIR-31, HSA-MIR-31 * Hotell og
HSA-MIR-7
signifikant oppregulert og de av
HSA -miR-206, HSA-MIR-204 Hotell og
HSA-MIR-133a
var signifikant nedregulert i alle kreftprøver. Uttrykk for bare
HSA-Mir
-31 ble signifikant oppregulert i leukoplaki, men ingen i lichen planus prøver. Analyse av ekspresjon heterogenitet fordelt 18 kreftprøvene i klynger av 13 og 5 prøver og viste at ekspresjon av 30 mirnas (inkludert de ovennevnte 7 mirnas), var signifikant deregulert i klyngen av 13 prøver. Fra database gruvedrift og sti-analyse ble det observert at disse mirnas i betydelig grad kan målrettes mot mange av de gener som er tilstede i forskjellige kreftrelaterte trasé som «proteoglykaner i cancer»,
PI3K-AKT
etc. som spiller en viktig rolle i ekspresjon av ulike molekylære funksjoner for kreft. Uttrykk for
HSA-MIR-31
var signifikant oppregulert i både kreft og leukoplakimateriale vev, og dermed kan være en av de molekylære markører for leukoplaki som kan utvikle seg til gingivo-kinn kreft.
Citation: De Sarkar N, Roy R, Mitra JK, Ghose S, Chakraborty A, Paul RR, et al. (2014) En Quest for miRNA Bio-Marker: En spor Tilbake tilnærming fra Gingivo Buckal Cancer til to forskjellige typer precancers. PLoS ONE 9 (8): e104839. doi: 10,1371 /journal.pone.0104839
Redaktør: Ratna B. Ray, Saint Louis University, USA
mottatt: 5 april 2014; Godkjent: 15 juli 2014; Publisert: 15 august 2014
Copyright: © 2014 De Sarkar et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle relevante data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. All støtte kom fra Institutt for Biotechnolgy, Government of India, og indisk Statistisk Institute professor Bidyut Roy. Den Funder har ingen rolle i studiedesign, datainnsamling, analyse, beslutning om å publisere og manuskript forberedelse
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Gingivo kinn plateepitelkarsinom (GBSCC) er en av de mest utbredte (-60%) kreft i munnhulen, spesielt blant tobakksbrukere i India. Hele settet med hode og hals plateepitelkarsinom står som den femte vanligste kreftformen i verden [1]. Men hode og nakke kreft består ~24% av totalt antall krefttilfeller i India som er tatt opp på et høyere sykehus, Tata Memorial Centre, Mumbai og om ~13.5% av dem er fra munnhulen [2]. Fem år overlevelsesrate (-50%) av pasienter som lider av hode og hals plateepitelkarsinom har ikke bedret seg mye, selv etter intens forskning i løpet av siste 15 årene, så tidlig påvisning er fortsatt et sentralt tema for bedre overlevelse [3].
Siden 1993 miRNA har dukket opp for å være en av de mest fremtredende biologiske regulatorer, som spiller viktige roller i å kontrollere og finjustere sin målets (mRNA) uttrykk [4] – [9]. De siste årene har det blitt demonstrert at microRNAs (mirnas) er også involvert i menneskelig tumorigenesis og kan fungere enten som tumorigene /onkogene eller anti-tumorigen molekyler. Således er det å lage et nytt lag i de molekylære hendelser i human kreft. Genuttrykkstudier avdekket at mange mirnas er deregulert i ulike krefttyper og funksjonelle studier avklart at mirnas er involvert i flere molekylære og biologiske prosesser som driver tumorigenesis [10] – [12]. Derfor, i tillegg til ulike skalaer av variasjon i form av nye mutasjoner i genomet eller genetisk bakgrunn av pasientene (dvs. kjønnsceller mutasjon), variasjon i uttrykket av ulike miRNAs er også et viktig aspekt for undersøkelse. Med denne troen, studerte vi uttrykk deregulering av 762 miRNAs i GBSCC og også sjekket om lignende type uttrykk deregulering kunne observeres i forstadier leukoplaki og lichen planus vev fra munnhulen. Arbeidet er gjort for å forstå hvordan disse mirnas kan være involvert i kreft ved hjelp pathway analyse og informasjon fra Lit
e
temperaturer som og databaser.
Materialer og metoder
Prøver
Denne studien ble godkjent av «omtale komité for beskyttelse av forskning risiko for mennesker, Indian Statistical Institute». Alle individer i denne studien har gitt skriftlig informert samtykke til å publisere tilfelle detaljer. Alle deltakerne signerte et spørreskjema som inneholder demografi, tobakk vane og en erklæring som beskriver at han /hun ikke har noen innvendinger til bruk av blod- og vevsprøver i denne studien, og deltar i denne undersøkelsen frivillig. Urelaterte pasienter som lider av kreft (n = 18), lichen planus (n = 12) og leukoplaki (n = 18) ble vurdert for denne studien fra Guru Nanak Institute of Dental vitenskap og forskning, Panihati, Kolkata, (Tabell 1, Tabell 2 tabell 3). En vev slag mot kreft /forstadium område og en annen trøkk fra tilstøtende «klinisk» normal område (minst 1,5 tommer vekk fra grensen til lesjonen) ble vevsprøve av oral patolog. En del av biopsi vev ble brukt for histopatologisk bekreftelse og gjenværende del av vev ble holdt separat i «RNA senere» ved -80 ° C og brukes innen 2 måneder.
RNA isolasjon og TLDA analysen
RNA isolering ble gjort ved hjelp av Mirvana kit (Life Technologies, USA). RNA utbyttet kvantifisering ble gjort av Nano Drop og integritet ble sjekket med Agilient sin Bioanalyzer (Agilent RNA6000 Nano Kit), henholdsvis. RIN nummer cut-off ble valgt som ≥6.9. Parallell uttrykk analyse av 762 miRNAs ble utført ved hjelp TLDA-A (V2) og TLDA-B (V3) -kort i 7900HT FAST Real Time PCR system (Applied Biosystems, USA) ved hjelp TLDA flat blokk [13]. Primær analyse ble gjort ved hjelp av SDS og data Assist (Life Technologies, USA) programvarepakker for å få uttrykk i form av Ct, ΔCt og ΔΔCt verdier der Ct = sykluser hvor PCR produkt kvantitet når en definert terskel, ΔCt = Ct
av en miRNA i kreftvev – Ct
av geometrisk gjennomsnitt av uttrykk av 3 mest stabile endogene kontroll mirnas i at vev og ΔΔCt = ΔCt
av en miRNA i kreftvev – ΔCt
av at miRNA kontroll vev . Ut av de analysert 762 mirnas, fem var kandidater for endogene kontroller. Men på bakgrunn av deres ekspresjon stabilitet på tvers av alle prøvene, RNU-48, RNU-44 og U6 /nm-6 ble valgt som endogene kontroller. For å få ΔCt som normaliserte mål på uttrykk for en miRNA i begge kreft /precanser og kontroll vev, uttrykk for alle miRNAs i vev ble normalisert uavhengig ved hjelp geometrisk gjennomsnitt av uttrykk for utvalgte 3 endogene kontroll mirnas i samme vev. Ct verdi mindre enn 40 ble kun vurdert for videre analyse.
Analyse
Data Beskjæring.
Hvis ble observert uttrykk for noen spesiell miRNA å være til stede i at-minst 9 ut av 18 kreft-normal parede vev, da bare, har det vært ansett for videre nedstrøms analyse. Annotering av TLDA analysen V2 (A-kort) og V3 (B-kort) følger miRBase utgivelsen-14 [13] – [14]. Nå ble ekspresjonsdata av disse mirnas vurdert for videre analyse hvis merknaden er fortsatt gyldige i miRBase slipp-19 [15] – [16]. På denne måten uttrykk for 531 miRNAs ble ansett for påfølgende nedstrøms analyse.
Statistical Analysis.
I første omgang en prøve Kolmogorov-Smirnov (KS) test for uttrykk data av alle 531 gener ble utføres uavhengig av hverandre, slik som å sjekke for normalitet av differensial uttrykk verdiene for alle prøvene [(Zi = {(Ci-Ni) – (midlere C- middel N)}, så Zp = ΣZi /SD Z, KS testen ble utført på zp, Ci: i
th Kreft prøvens ΔCt verdi, Ni: i
th Normal prøvens ΔCt verdi] og til slutt uttrykk ble funnet å være normalfordelt Det skal bemerkes at ΔCt verdier er allerede log transformert, så. ., ikke lenger log transformasjon ble gjort med dette settet med ekspresjonsdata Fulgt av normalitet test, ble en tailed paret t-test utført [(Ci-Ni) 1 / 1]. Null hypotesen om en tailed paret t -test var «uttrykk for en bestemt miRNA er ikke større enn to ganger opp /ned-regulert» So naturlig alternativ hypotese var «uttrykk for en bestemt miRNA er . 2 brette opp /ned-regulert. Test for oppregulering (lavere hale test) ble utført hvis medianen av en bestemt miRNA s ΔΔCt er mindre enn null. Tilsvarende test for nedregulering ble utført hvis medianen av en bestemt miRNA er ΔΔCt er mer enn null. Flere test korreksjoner ved hjelp Benjamini-Hochberg metoden ble utført ved 5% signifikansnivå [17] og korrigert avskåret p-verdien var 0,00065.
Cluster Analyse av miRNAs uttrykt i kreftvevet.
K-median clustering metoden ble brukt for hele beskjæres datasettet for å se om genom bredt miRNA uttrykket variasjoner mellom individer var store nok til å pålitelig dele prøvene inn i en rekke under klynger. For dette clustering, valgte avstanden metrisk var euklidsk. Siden, uttrykk for mange mirnas var fraværende i vår datasettet, ble det skape «Fraværende data» situasjon. Denne situasjonen er kjent for å skjevhet clustering hvis de mest populære clustering metode-K-midler ble vedtatt. Så, valget av clustering var K-median. Antallet pålitelige klynger, dataene vil danne, ble bestemt ved hjelp av «albuen» metoden.
TaqMan analysen.
Uttrykk for betydelig de-regulert mirnas, oppdaget i kreftvevet ved TLDA metode ble også validert i samme kreftvev og undersøkt i leukoplaki og lichen planus vev ved TaqMan analysen (7900HT Fast real Time PCR system, Applied Biosystems, USA). Prober og primere ble levert av Invitrogen India Ltd og data ble hentet som «fold change» i forhold til tilstøtende kontroller. Normalisering av ekspresjon av hvert gen i hver prøve ble gjort ved hjelp av geometrisk gjennomsnitt av de samme 3 endogene kontroller, nemlig.
RNU-44, RNU-48 Hotell og
nm-6
, for å få ΔΔCt verdien av at miRNA.
Resultater
Expression profil i kreftvev av TLDA
Expression data for 762 mirnas ble analysert ved denne metoden, men etter data beskjæring, ble ekspresjonsdata av 531 mirnas (inkludert 5 endogene kontroller) brukes for andre nedstrømsanalyse (File S1). Under statistisk test, var minst to ganger ekspresjon endring i kreftvevet sammenlignet med parvise kontroll vev ansett for å være den benken-merket av ekspresjon deregulering. Således, ekspresjon av 7 mirnas ble funnet å være signifikant deregulert etter multippel forsøks korrigering og alle disse syv mirnas hadde 4-fold gjennomsnitt uttrykk deregulering (dvs. enten opp- eller nedregulering). Validering av uttrykk av miRNA bestemt TaqMan analysen også bekreftet uttrykk deregulering i kreftvevet selv fold-endringer ble redusert i forhold til TLDA utfallet (tabell 4). Forskjellen i følsomhet av disse to RT-PCR-baserte (TLDA og MIR-spesifikk TaqMan®-analyse) eksperimentelle metoder, kombinert med det faktum at disse to sett av eksperimenter ble utført ved to forskjellige tidspunkter, kan være den påvirkende faktorer for forskjellen i grader uttrykks deregulering av miRNAs. Relative plasseringene av disse 7 mirnas sammen med andre miRNA gener på tvers av ulike kromosomer avdekket at
HSA-MIR-133a
og
HSA Anmeldelser –
mir-7
ligger på to ( chr 18 og chr 20) og tre kromosomer (chr 9, Chr 15 og chr 19), henholdsvis (figur 1a). Her ble utført kun modne mirnas, dermed uttrykk for
HSA-MIR-133a Hotell og
HSA Anmeldelser –
mir-7
kan være kumulative summen av alle modne former for respektive miRNAs. Blant disse 7 mirnas, uttrykk for 4 miRNAs nemlig.
HSA-MIR-1293, HSA-MIR-31, HSA-MIR-31 * Hotell og
HSA-MIR-7
signifikant oppregulert og de av 3 miRNAs viz.
HSA-MIR-206, HSA-MIR-204 Hotell og
HSA-MIR-133a
var signifikant nedregulert i kreftprøver (tabell 4). Heat kartet ble konstruert i henhold til to måter uten tilsyn hierarkisk clustering. Slik at alle nedregulert mirnas gruppert sammen i den øvre delen av plottet, mens alle oppregulert mirnas gruppert i bunnen (figur 1b). Den viste verdiene av uttrykket (dvs. ΔΔCt) i forhold til tilstøtende kontroll, så vel som antall prøver som gir uttrykk data. Uttrykk for
HSA-mir-1293
ble innhentet fra ni kreft-kontroll parede prøver, men seks av dem hadde ΔΔCt verdier ≤-2 og resterende 3 prøvene hadde ΔΔCt verdier mellom 0 og -2. Så, for
HSA-mir-1293
, alle disse 9 prøvene hadde ΔΔCt verdier med ve tegn, noe som betyr; når ekspresjon ble oppnådd, er det alltid oppregulert men seks av dem viste mer enn fire ganger uttrykk endring. Tilsvarende uttrykk data for
HSA-mir-31 *
ble hentet fra 16 kreftkontroll parede prøver. Ut av disse 16 prøver, én prøve hadde ΔΔCt mellom 0 +2, To prøver hadde ΔΔCt verdier mellom 0 -2 Og øvrige 13 prøvene hadde ΔΔCt verdier ≤-2
A:. Manhattan tomt på p-verdier for alle 528 mirnas 18 prøver. AB-linje (dvs. horisontal linje i midten av figur) representerer P-verdi avskåret, p = 0,00065. Relative plassering av 528 mirnas (langs horisontal akse) på tvers av det humane genomet og deres tilsvarende -log
10 transformerte p-verdi (langs den vertikale akse) ble plottet. B: Heat kartet diagram av ΔΔCt verdier. Toveis unsupervised hierarkisk clustering av 7 mirnas hvis uttrykk var betydelig deregulerte prøver. Hver rad representerer ekspresjon av en miRNA og hver kolonne representerer en prøve. Sky-blå fargede celler står for mislykket analysen dvs. ingen data i disse cellene. Røde og grønne farger betegne opp- og nedregulering, henholdsvis. Dendogram langs den vertikale akse representerer hierarkisk klassifisering av mirnas på grunnlag av uttrykk likhet. Avstand beregninger av hierarkisk clustering var Euklidsk avstand. Heat kartet ble bygget ved hjelp av Heatmap to av R «gplot» pakken. C:. Sterkt korrelert uttrykk for
MIR-206 Hotell og
Mir-1
Normalisert uttrykk (ΔCt) av disse 7 miRNAs i kreft og kontroll vev var for det meste ikke-overlappende og ΔCt verdier av forskjellige mirnas over regulerings vev viste også ganske bredt variasjonsområde (figur 2). Så for å få riktig relative uttrykk, er det viktig å sammenligne ekspresjon av mirnas i kreftvevet med de av kontroll vev fra det samme individ. I denne figur, ble mirnas plassert etter hvor høy p-verdier (fra topp til bunn) vertikalt. De ΔCt verdier av 8 mirnas i forskjellige tumor- og kontrollprøver hadde blitt plottet på den horisontale aksen for å vise fordelingen av ΔCt verdiene for alle prøvene. Det er åpenbart at flere overlappingen mellom områder av ekspresjon av mirnas i kreft og kontroll vev, mindre er graden av betydning. Her
HSA-mir1293
med lavest p-verdi 0,000028 hadde blitt plassert på toppen og
HSA-mir-en
med p-verdi på 0,00094 (like under korrigert signifikansnivå) ble plassert nederst på den vertikale aksen (figur 2).
horisontal boksplott er vist for fordeling av uttrykket (ΔCt) av miRNAs langs den horisontale aksen. P-verdier av mirnas er plottet i stigende rekkefølge (øverst til nederst). Uttrykk for
har-Mir-1
er ikke vesentlig deregulert og vist å sammenligne med de andre 7 miRNAs. Hver boks og værhår par (Gray for kreft og hvit for Normal) representerer spekter av variasjon av ΔCt-verdier for en miRNA fra TLDA data. Denne serien representerer uttrykk for alle med hell analysert prøver data for at miRNA.
Uttrykk av miRNAs i forstadier leukoplaki og lichen planus prøver
Blant 7 mirnas som ble observert å være signifikant deregulert i kreftprøver (tabell 4), uttrykk for bare
MIR-31
var signifikant oppregulert i leukoplakimateriale vev der som uttrykk for ingen av disse 7 miRNAs ble deregulert betydelig i lichen planus vev. Uttrykk for
MIR-31 * Hotell og
MIR-204
var også opp- (4,75 folder) og nedregulert (1,99 folder), henholdsvis i leukoplakimateriale vev, men ikke signifikant forskjellig.
Database gruvedrift og bioinformatikk analyser
Publiserte rapporter om disse 7 mirnas hadde også vist lignende retning av uttrykk deregulering i enkelte krefttyper, inkludert hode og nakke [10], [18] – [20]. Totalt 561 unike mål ble identifisert når disse 7 mirnas ble brukt til å søke målene ved hjelp miRWalk [21] og videre kryss validert fra Pubmed (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed).
HSA-MIR-31 *
har validert mål,
RhoA
, som angivelig innblandet i munnen svulst [18].
HSA-MIR-1293
til nå er kjent for å målrette
GCN1L1 plakater (tabell 5) og
HSA-MIR-1293
mediert nedregulering av denne svulsten-genet ( dvs.
GCN1L1
) kan bidra til dårlig prognose av svulsten [22]. IPA verktøy ble brukt for «sykdom sikt søk» (Ingenuity® Systems, www.ingenuity.com) og mest betydningsfulle «sykdom begrepet» i kreft kategori av IPA var «hode og nakke» kreft. IPA kunne ikke gi noen truffet av
HSA-MIR-1293 Hotell og regnes
HSA-MIR-31 Hotell og
HSA-MIR-31 *
som synonymt slik at produksjonen var fra 5 miRNAs. Det ble også lagt merke til at IPA anses
HSA-MIR-206
synonymt til
HSA-Mir-1
siden de har samme ætt sekvens [23]. Det ble også observert at uttrykket deregulering status for
HSA-Mir-1 Hotell og
HSA-MIR-206
tvers av prøvene var svært lik hverandre (r = 0,94) (figur 1c) . Inkludering av
HSA-Mir-1
i mål søkelisten økt antall mål til 702. I KEGG pathway kartlegging portal [24] – [25] validerte mål av disse 8 mirnas har blitt brukt. Top de fleste baner i kartlagt listen var «microRNAs i kreft» etterfulgt av «proteoglykaner i kreft» og «global kreft bane» (tabell S1 i File S2). Andre topp relevant veien var
PI3K-AKT
som er en av de mest vanlige veier involvert i kreft. Andre mest betydningsfulle endringer som kan ha skjedd på grunn av disse mirnas er forstyrrelse av aktin cytoskjelettet vedlikehold og fokal heft. Andre sannsynlige impliserte signalveier var
RAS
,
RAP1, MAPK, HIF-1
,
FOXO, TNF, erbB
, apoptose etc (tabell S1 i File S2). «GO» term berikelse søket ble utført ved hjelp av innspill fra 702 validerte mål av disse åtte mirnas (data ikke vist), og det ble observert at mest fremtredende forstyrret biologiske prosesser er primært knyttet til celle migrasjon, tap av apoptose, celleproliferasjon etc. Men DAVID baserte «GO» term berikelse for biologisk prosess viste mest fremtredende biologiske prosessen er «apoptose» (tabell S2 i File S2) [26] – [28]. Alle disse observasjonene støtter at disse 8 mirnas kan spille viktige funksjonelle roller i gingivo kinn kreft. Vår RNA-Seq data viser at uttrykket av
FN1, MSN Hotell og
MMP9
, som tilhører «Proteoglycans i kreft» genet liste og er mål for nedregulert mirnas ble oppregulert i 10 av 13 vevsprøver (i gjennomsnitt, 6,83, 2,43 og 21,89 folder, henholdsvis, sammenlignet med tilstøtende normal). På samme måte forutsagte oppregulering av
LAMC
og nedregulering av
PAI
, som tilhører
PI3K-AKT
vei, ble også bekreftet på RNA-Seq data i en under satt av disse vevsprøver (upubliserte data). Disse observasjonene støtter også vår prediktiv pathway analyse vedrørende involvert biologisk prosess /veier som kan bli målrettet av dette settet med 8 miRNAs.
Utvalgte prøver hadde liten variasjon i form av sin differensiering status eller klinisk stadieinndeling. Cluster analyse ble utført for å sjekke om genom bredt miRNA profilen kan forklare en slik karakteristikk variasjon. Det ble utført ved hjelp av uttrykk deregulering data (ΔΔCt) av 531 mirnas fra 18 kreftprøver ved hjelp av K-median-metoden. Optimalt ble bare to distinkte klynger oppnådd; en besto av 13 sammenkoblede tumor normal prøver og andre besto av 5 sammenkoblede tumor normal prøver. Det var tydelig at disse to grupper av prøvene ikke ble dannet på grunnlag av deres differensiering status eller kliniske faser. Uttrykk av 30 miRNAs ble betydelig deregulert i klyngen av 13 prøver (p-verdi avskåret 0,00298 etter Benjamini-Hochberg Correction, 3a, figur 3b), men ingen av miRNAs ble betydelig deregulert i klyngen av 5 prøver (data ikke vist ). Brett uttrykket (opp- eller ned-regulert) av en miRNA i et tumorvev sammenlignet med dens tilstøtende kontroll og antallet prøver som gir uttrykk data for en miRNA kunne observeres i varmekartet diagrammer av klynge av 13 prøver (figur 3b). Den viste at ekspresjon av alle mirnas ikke var tilgjengelig fra alle prøver. Uttrykk for noen miRNAs var oppregulert i de fleste av prøvene (f.eks uttrykk for
MIR-31 *, MIR-7, MIR-21
vist nederst på figuren) og uttrykket av noen miRNAs var nede -regulated i de fleste av prøvene (f.eks
MIR-206, MIR-1, MIR-133a
vist på midten av figuren) (figur 3b)
A:. Manhattan tomt på p-verdier for 520 mirnas fra klyngen av 13 prøver. Plottet av relativ plassering av 520 mirnas (langs horisontal akse) på tvers av humane kromosom og deres tilsvarende -log
10 transformerte p-verdi (langs den vertikale akse). Benjamini-Hochberg korrigert P-verdi avskåret var 0,00298 (horisontal linje i midten av figuren). B: Heat kartet diagram av ΔΔCt verdier av 30 miRNAs. Uttrykk av disse miRNAs ble betydelig deregulert i klyngen av 13 prøver. Hver rad representerer en miRNA og hver kolonne representerer en prøve. Sky-blå fargede celler står for mislykket analysen (i.e.no data i disse cellene). Røde og grønne farger betegne opp- og nedregulering av ekspresjon, respektivt. Heat kartet ble bygget ved hjelp av Heatmap to av R «gplot» pakken. C:. Meget korrelert uttrykk for MIR-411 * og MIR-411
Ut av disse 30 mirnas (tabell 6), uttrykk for 28 mirnas viste lignende uttrykk deregulering mønster som det allerede er rapportert i tidligere studier på kreft [10], [29] – [30]. Av de resterende to mirnas har en miRNA
(HSA-MIR-770-5p
) ikke vært assosiert ennå med noen kreft. Uttrykk for rester en miRNA (
HSA-MIR-211
) har blitt deregulert i motsatt retning i denne studien sammenlignet med tidligere rapporter om tykktarmskreft [29] – [30]. Egentlig 7 mirnas, hvis uttrykket ble betydelig deregulert i analysen av 18 prøver, er en undergruppe av disse 30 miRNAs. Imidlertid ble det observert uttrykk for
HSA-MIR-411 *
å bli betydelig deregulert i denne studien, men ingen tidligere rapport hadde vist sitt engasjement med kreft. Igjen, er det kjent at
HSA-MIR-411 Hotell og
MIR-411 *
er stammer fra samme forløper miRNA og
HSA-MIR-411
har en sterk assosiasjon med kreft [31]. Når vi sjekket uttrykk for modne
HSA-MIR-411 Hotell og
HSA-MIR-411 *
, en sterk positiv korrelasjon ble observert (r = 0,95) (figur 3c) selv uttrykk for
HSA-MIR-411
ble ikke funnet å være statistisk signifikant. Tilsvarende har vi observert betydelig uttrykk deregulering av
HSA-MIR-135b * Hotell og
HSA
-miR-99a * og rapporter om sammenslutning av kreft med
HSA-MIR-135b
og
HSA Anmeldelser –
MIR-99a product: [32]. Søke i lignende måte, ble 1207 unike målgener oppnådd for disse 30 miRNAs. IPA og KEGG kartlegging ble utført ved hjelp av disse 30 mirnas og deres kjente 1207 målgener. I IPA analyse, tre kreftformer, som ble funnet å være assosiert med uttrykk deregulering av en stor undergruppe av disse miRNAs, var hypo svelget, spiserøret og hode- og halskreft (p-verdier 1,71 × 10
-07, 2,20 × 10
-07 og 1,02 × 10
-07 henholdsvis). Interessant nok ble samme biologiske signalveier (som er relevante for kreft) som er rapportert å være involvert i disse sett 30 mirnas slik det ble observert med 8 mirnas tidligere. Men forskjellen ligger i repertoaret og antall målrettede noder for alle disse banene (Tabell S1 i File S2, Tabell S2 i File S2, Tabell S3 i File S2 og tabell S4 i File S2).
diskusjon og konklusjoner
uttrykk for 7 mirnas ble betydelig deregulert i 18 kreftprøver og betydelig oppregulering av
HSA-MIR-1293
blir rapportert for første gang i gingivo kinn kreft ( tabell 4). Per nå, funksjonell rolle
HSA-MIR-1293
i kreft er svært begrenset. Ifølge miRWalk [21] og Starbase [33], en av de antatte målene for
HSA-MIR-1293
er
MAPK14 plakater (p38) som har vist seg å være assosiert med svulst følsomhet til
cis
-platinum behandling [34]. Hvis dette spådd forholdet kan godkjennes, kan da uttrykk for dette miRNA være nyttig i prediksjon av pasientens følsomhet for
cis
-platinum behandling. To mirnas,
HSA-MIR-206 Hotell og
HSA-Mir-1
, er kjent for å spille anti-tumorigent rolle [35] – [37] og
HSA-speil
206 kan indirekte aktivere apoptose, inhibering av cellemigrering og fokus formasjon [38]. Nedregulering av uttrykk for
HSA-Mir-1 Hotell og
HSA-MIR-133a
, som har blitt observert i denne studien (tabell 5), har allerede blitt rapportert i en tidligere studie med muntlig plateepitelkarsinom [39]. Faktisk,
HSA-MIR-133a
retter seg mot flere onkogener og er rapportert å være vanlig ned regulert i en rekke andre orale kreftstudier [35] – [40]. Uttrykk for både
HSA-MIR-31 Hotell og
HSA-MIR-31 *
ble rapportert i noen tidligere studie om kreft [41] – [42]. Studier på OSCC cellelinjen viste at eksogen levering av
pre-mir-31
, som øker opp mengden av moden
HSA-MIR-31 Hotell og
HSA-MIR-31 *
, forbedret OSCC onkogenisitet [41] – [42]. Derfor vår observasjon av oppregulering av
HSA-MIR-31 Hotell og
HSA-MIR-31 *
, bekrefter med eksisterende rapporter om muntlige og andre kreftformer. I likhet med en tidligere rapport om hode- og halskreft, her også, uttrykk for
HSA-MIR-204
ble også funnet å være signifikant nedregulert [43]. Uttrykk for
HSA-MIR-7
, en kjent OncomiR, er angivelig oppregulert i OSCC [44]. Det mål primært tumorsupressorproteinene transkripsjoner fra
RECK product: [16]. I denne studien uttrykk for
HSA-MIR-7
var også signifikant oppregulert og dermed bekrefter med tidligere funn knyttet til kreft i munnhulen. Arbeidet er gjort for å forstå mulige biologiske konsekvensen av gruvedrift ulike databaser. Pathway analyse viste at de fleste forstyrret biologiske prosesser vil være cellemigrasjon, apoptose og proliferasjon (tabell S2 i File S2). Mest forstyrret trasé ble spådd å være «proteoglykaner i kreft» og
PI3K-AKT plakater (Tabell S1 i File S2) som også er støttet av våre RNA-Seq data på uttrykk deregulering av noen proteoglykan gener og
LAMC Hotell og
PAI
som tilhører
PI3K-AKT
pathway (upubliserte data). Disse observasjonene støtter også vår prediktiv pathway analyse vedrørende involvert biologisk prosess /veier som kan bli målrettet av dette settet med 8 miRNAs.
Cluster analyse av 18 prøver hadde vist at uttrykket av 30 miRNAs ble funnet å være signifikant deregulert i klynge av 13 prøver (figur 3b). Litteratursøk og database gruvedrift med disse 30 mirnas viste relevansen av disse genene med muntlige og andre kreftformer (tabell 6). Selv om veien analyse ved hjelp av 8 mirnas (identifisert fra ekspresjonsdata av 18 prøver) og 30 mirnas (identifisert fra ekspresjonsdata av klyngen av 13 prøver) snevret ned til lignende signalveier, men antallet og repertoar av noder målrettet av disse sett miRNAs er helt forskjellige (data ikke vist). Denne klyngeanalyse er faktisk avsløre eksistensen av molekylær heterogenitet som kan tygge opp vedtak om å finne finere molekylær markør. Interessant, observerte molekylære heterogenitet mønster på ingen måte er relatert til differensiering subtype som finnes i vev eller kliniske stadier av prøvene.
Blant to pre-kreftformer, er leukoplaki kjent for å være assosiert med tobakks vane, mens lichen planus er en auto immun sykdom. Det er rapportert at alle muntlige kreft innledes med forstadier til kreft. Så sjekket vi om, i likhet med kreftprøver, kan uttrykk deregulering av miRNAs observeres i disse to forstadier til kreft. Her, TaqMan data viste at ekspresjon av kun
HSA-mir-31
var signifikant oppregulert (4,55 ganger mer enn tilstøtende kontroll vev) i leukoplaki prøvene (tabell 4), men ikke i lichen planus vev. Skjønt, uttrykk for en annen miRNA,
HSA-mir-31 *
, var også oppregulert ved 4,75 folder men signifikant ikke annerledes på grunn av større standardavvik mellom prøvene. Så, trenger uttrykk for disse to mirnas å bli sjekket i flere leukoplakimateriale prøver. Dette gjentar nok en gang om molekylær nærhet av leukoplakier med GBSCC enn andre pre-kreft, lichen planus. Så, uttrykk for
HSA-mir-31 og HSA-mir-31 *
i leukoplaki vev kan være potensielle risiko-markører for progresjon av forstadier til kreft i GBSCC.
Lite antall og blandet trinn tumorprøver og uttrykk analyse av kun 762 mirnas av TLDA (tilgjengelig på tidspunktet for vårt eksperiment) begrenset denne studien å antyde at uttrykk for bare 7 miRNAs ble betydelig deregulerte i GBSCC vev i forhold til tilstøtende kontroll vev. Det er stor sjanse for at antall deregulerte mirnas vil øke hvis vi kunne analysere uttrykk for ~2578 mirnas hittil kjente i menneskelig vev som nevnt i miRBase-20 [45]. Som et resultat, kan uttrykk for flere miRNAs har blitt sjekket i kreft og leukoplakimateriale vev å antyde mer om molekylære markører. Enda viktigere, er rollen til disse miRNAs i kreftutvikling som skal godkjennes av funksjonell studie.
Hjelpemiddel Informasjon
Fil S1.
Genome bredt miRNA uttrykket profil for 528 mirnas (unntatt 3 endogene kontroller) i GBSCC. Hver kolonne fra S1 til S24 representerer data for 18 prøver, hver rad representerer data for ΔΔCt av en bestemt miRNA. N /A representerer ingen data
doi:. 10,1371 /journal.pone.0104839.s001 plakater (XLSX)
File S2.
Inneholder supplerende tabeller
doi:. 10,1371 /journal.pone.0104839.s002 plakater (docx)
Takk
Vi hjertelig takker Dr. Analabha Basu og Dr.
