Abstract
Bakgrunn
Tumor-forbundet makrofager (TAM), oppussing kolorektal kreft (CRC) mikromiljøet. Likevel funn på rollen til TAM i CRC synes å være motstridende i forhold til andre kreftformer. Foxp3
+ regulatoriske T (treg)-cellene dominant infiltrere CRC. Men den underliggende molekylære mekanismen som TAMs kan bidra til smugling av Treg-celler til tumormassen forblir ukjent.
metodikk /hovedfunnene
CRC ble enten indusert av N-metyl N-nitrosourea (MNU) og H.
pylori
eller etablert ved subkutan injeksjon av mus tykktarms tumor cellelinje (CMT93) i mus. CMT93 celler ble dyrket med primære makrofager i en transwell apparat. Rekruttering av foxp3 grønn fluorescens protein positive (foxp3
GFP +) Treg-celler ble vurdert ved hjelp av IVIS Imaging System eller immunfluorescens farging. En rolle for makrofager i omsetning av treg-celler og i utviklingen av CRC ble undersøkt i CD11b difteri-toksin-reseptoren (CD11b-DTR) transgene C57BL /6J-mus, hvor makrofager selektivt kan oppbrukt. Treg-celler bemerkelsesverdig infiltrert solid svulst, og overveiende uttrykte homing chemokine reseptor (SKR) 6 i den induserte CRC modell. Begge CMT93 kreftceller og makrofager produsert en stor mengde CCL20, den eneste ligand av CCR6
in vitro Hotell og
in vivo
. Injeksjon av rekombinant mus CCL20 til kreft nettsider forfremmet sin utvikling med en markert rekruttering av Treg-celler i pode CRC modell. Betinget makrofag ablasjon redusert CCL20 nivåer, blokkert Treg-celle rekruttering og hemmet tumorvekst i CD11b-DTR mus implantert med CMT93.
Konklusjoner /Betydning
TAM rekruttere CCR6
+ treg-celler til tumormasse og fremme utvikling via øke produksjonen av CCL20 i en CRC musemodell
Citation. Liu J, Zhang N, Li Q, Zhang W, Ke F, Leng Q, et al. (2011) Tumor-Associated Makrofager Recruit CCR6
+ regulatoriske T-celler og fremme utviklingen av tykktarmskreft via Styrking CCL20 Produksjonen i mus. PLoS ONE 6 (4): e19495. doi: 10,1371 /journal.pone.0019495
Redaktør: Sven G. Meuth, Universitetet i Münster, Tyskland
mottatt: 27 oktober 2010; Godkjent: 07.04.2011; Publisert: 29 april 2011
Copyright: © 2011 Liu et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne forskningen støttes av en bevilgning fra Natural Science Foundation National of China (No: 30972787), ved Program for professor i Special Appointment (Eastern Scholar) på Shanghai institusjoner for høyere utdanning, ved Science and Technology Commission av Shanghai kommune (No. : 09140902600), og av de ledende akademisk disiplin prosjekt Shanghai Municipal Education Commission (No: J50208 og No: J50207). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
tykktarms~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP (CRC) er en av de vanligste kreftformene over hele verden, og den fjerde vanligste årsaken til kreft-assosiert død [1]. I likhet med andre typer kreft, oppstår CRC i kronisk betent vev, og dens utvikling er under immun overvåking og avhenger av cytokiner og chemokiner utskilt fra tumor infiltrere immunceller [2]
Regulatory T (treg). – cellene ble først preget av deres CD4
+ CD25
+ foxp3
+ fenotype og er tenkt å balansere nødvendig aggressivitet mot fiender med toleranse for selv bestanddeler [3]. Økt antall treg-celler er blitt rapportert i blodet og tumorer i pasienter med forskjellige typer kreft, inkludert brystkreft, tykktarmskreft, spiserørskreft, magekreft, leverkreft, leukemi, lungekreft, lymfom, melanom, eggstokk-kreft, og pankreatisk kreft [4]. Videre studier som utarmet Treg-celler resultert i forbedret antitumor immunitet og markert redusert tumorvekst i flere musetumormodeller [4]. Hos pasienter med CRC, en økt antall av treg-celler i perifert blod, mesenteriske lymfeknuter og direkte i tumoren ble observert [5], [6]. Videre antistoff-mediert foxp3 protein behandling resulterte i en klinisk signifikant reduksjon i tumorbyrde i en syngene modell av tykktarmskreft metastaser til leveren i Balb /c mus [7].
Kunnskap om opprinnelsen til treg-celler samler seg inni tumorlesjoner kommer fra dyr tumor modellstudier. Det er blitt foreslått at både pre-eksisterende naturlig forekommende treg-celler (nTreg-celler) og adaptive treg-celler (aTreg-celler) indusert fra ikke-treg forløperceller bidra til den totale pool av tumor-infiltrerende foxp3
+ treg-celler [8], [9]. Intratumorale Treg-celler er antigen erfarne, høyt aktivert og ser ut til å gjennomgå omfattende celleproliferasjon som flertallet av intratumoral Treg-celler har mistet CD62L og CD45RB uttrykk, men deres uttrykk for CD25, CTLA-4 og GITR er sterkt økt [8], [10]. Uttømming av eksisterende nTreg-celler ved hjelp av anti-CD25 mAb resulterte i raskere og mer omfattende konvertering av forloperceller til aTreg-celler, som i stor grad kan kompensere for tapet av nTreg-celler [8]. Aktivering og ekspansjon av enten nTreg-celler eller aTreg-celler ved tumor områder er avhengig antigen, og bidrar til den spesifikke tumoren toleranse [4]. Spesielt er antigenpresenterende celler så som tumor-infiltrerende DC og makrofager sannsynligvis involvert i den lokale aktivering og ekspansjon av nTreg-celler inne tumorlesjoner [11]. Videre, i mennesker, tumor antigen-spesifikk foxp3
+ treg-celler har blitt isolert fra tumorvev, så vel som perifert blod fra pasienter med melanom og livmorhalskreft [12], [13].
foxp3
+ treg-cellene begynner å infiltrere begynnende tumorlesjon på et svært tidlig stadium av svulst utvikling [14]. Studier med human eggstokk-kreft har vist at treg-celler traffick til tumormassen og ascites via chemokin-reseptor CCR4 reagerer på CCL22 utgitt av tumorceller og tumorassosierte makrofager (TAM). Dette tyder på at chemokin og kjemokinreseptorer er viktig for treg-celle homing til svulster [15]. Men andre kjemokinreseptorer, for eksempel, CXCR3, og CCR6, som er delt med minne TM1, TM2 og Th17-celler, er også blitt vist å bli uttrykt av tumor-infiltrerende treg-celler [16], [17]. CCR6 er en kjemokinreseptor med bare en enkelt kjent spesifikk kjemokin-ligand, den inflammatoriske og homeostatisk chemokin CCL20 som også er kjent som lever og aktivering regulert kjemokin (LARC) [18] eller Mos [19]. I motsetning til mange andre kjemokiner, har CCL20 en relativt spesifikk reseptor og binder seg nesten utelukkende til kjemokinreseptoren CCR6, som også uttrykkes av CD45RO
+ minne T-celler og andre [20].
Til tross for det faktum at tumorutviklingen kunne bli fremmet i en del av immunsystemet i seg selv, den undertrykkende funksjon av treg-celler, samt den molekylære mekanismen bak deres trafficking til kreft områder fortsatt ukjent. I denne studien undersøkte vi de homing kjennetegn Treg-celler, og potensialet tumor-fremme funksjon av TAMs i en CRC modell. Vi rapporterer at i solide svulster hos mus med CRC, Treg-celler ble betydelig økt sammenlignet med kontrollgrupper. TAMs bidro til den økte CCL20 produksjon i tumormiljøet og rekruttert treg-celler som uttrykte høye nivåer av CCR6. Injeksjon av rekombinant mus CCL20 inn CRC fremmet svulst utvikling med en markert rekruttering av Treg-celler i villtype mus og stimulert tumorvekst ved direkte aktivering CMT93 celler i CCR6 – /- mus. Viktigst, ved hjelp av CD11b-DTR transgen musemodell vi demonstrerer for første gang at betinget makrofag ablasjon ikke bare reduserte ekspresjon av CCL20 og foxp3 men resulterte i en signifikant inhibering av CRC. Våre data tyder på at selektivt rettet mot CCL20 ved nedregulering av aktiviteten til TAMs eller tilhørende telleren reseptor CCR6 å blokkere minne Treg celler rekruttering kan representere en roman terapeutisk strategi mot CRC hos mennesker.
Resultater
tall av foxp3
+ treg-celler ble økt i tumor-infiltrerende lymfocytter av CRC i mus
et hovedmål med denne studien var å gi en endelig demonstrasjon av menneskehandel mekanisme for foxp3
+ treg-celler i CRC
in vivo
. For å oppnå dette, induserte vi CRC i mus med MNU og H.
pylori
. MNU er en direkte alkyleringsmiddel som ikke krever metabolsk aktivering, og således er en potent aktuell karsinogen [21]. Tidligere har intrarektal instillasjon av MNU blitt rapportert å indusere CRC hos rotter [21]. Som forventet, etter 80 uker, 85% mus brukt i denne studien utviklet synlig CRC indusert av MNU og H.
pylori plakater (Figur 1A-C). H E farging videre viste spredt kreftceller i deler avledet fra CRC i mus (figur 1D, E). Disse data antyder klart at fremgangsmåten anvendt i denne studien representerer en effektiv strategi for induksjon av CRC i mus.
(A) Åtti uker gamle C57BL /6J mus med store CRC indusert ved MNU og H.
pylori
. (B) Høyere forstørrelse av det området som er angitt av trekanten (Δ) av (A). (C) sekter av det området som er angitt med asterisk (*) i (B). (D) H E farging av tykktarmskreft vev avledet fra CRC indusert av MNU og H.
pylori plakater (opprinnelig forstørrelse, × 20). (E) Høyere forstørrelse av (D) som angitt ved rektangelet. For å undersøke foxp3
+ Treg-celler i mus med CRC indusert av MNU og H.
pylori
, immunfluorescens farging av foxp3 ble utført på frysesnitt fra mus CRC eller normal kolon vev. (F) Uttrykk for foxp3 (Red flekker) i mus CRC (original forstørrelse, × 20 × 40 og × 100). (G) Negativ ekspresjon av foxp3 i mus colon vev (opprinnelig forstørrelse x 20). (H) Rotte IgG kontroll farging (opprinnelig forstørrelse x 20). Lymfocytter infiltrere CRC (n = 10) og normal slimhinne (n = 6) ble isolert for flowcytometrisk analyse av foxp3 uttrykk. (I, J) Hyppigheten av treg-celler i CRC avledet fra åtti uker gamle C57BL /6J mus og normal slimhinne hos mus. (K) En betydelig økning i hyppigheten av treg-celler ble funnet i TIL fra CRC sammenlignet med normal slimhinne (
p
0,0001 ved Student «s t-test). Representative data vises som hadde blitt gjengitt i 3 uavhengige eksperimenter.
For å undersøke om foxp3
+ Treg-celler ble infiltrerende svulster forårsaket av MNU og H.
pylori
i mus, immunfluorescens farging av tumor og normal colon for foxp3 ble utført. Som observert i PBMC fra humane pasienter (fig S1), ble foxp3 (rød farging) rikelig uttrykt i tumorvevet avledet fra mus behandlet med MNU og H.
pylori
sammenlignet med normal tykktarm av ubehandlede mus eller IgG kontroll flekker (Figur 1F-H). For å se mer nøyaktig ved frekvensen for treg-celler som infiltrerer CRC, ble enkeltcellesuspensjon av CRC og normal slimhinne fremstilt og hyppigheten av treg-celler ble bestemt ved flow cytomery. Vi har bekreftet at en betydelig høyere frekvens av CD4
+ foxp3
+ treg-celler var tilstede i tumoren, sammenlignet med normal tykktarm (gjennomsnittlig 9,095% ± 1,038% vs bety 0,478% ± 0,095%,
p
0,0001) (Figur 1I-K). Den økede tetthet av treg-celler i tumor-infiltrerende lymfocytter (TIL) tyder på at treg-celler kan spille en viktig rolle i modulering av anti-tumor immunresponser i musemodellen av CRC indusert av MNU og H.
pylori
.
CCR6 var nødvendig for rekruttering av treg-celler til CRC i mus
for å ta opp spørsmålet om naturlig forekommende foxp3
+ treg-celler er i stand til å migrere til tumor vev etter adoptiv overføring, vi injisert 0,5-1 x 10
6 treg-celler som ble isolert fra foxp3
GFP transgene mus til mus med CRC indusert av MNU og H.
pylori
eller sunt kontroller. To uker etter adoptiv overføring, frysesnitt avledet fra tumorvev hos mus injisert med foxp3
GFP + celler ble undersøkt for GFP
+ Treg-celler. Vi observerte at GFP
+ Treg-celler massivt akkumulert i tumor (Figur 2A). Spesielt, identifiserte vi at disse akkumuleres GFP
+ Treg-celler i tykktarms svulst uttrykt CCR6, den Treg celle homing reseptor (figur 2B). Men naive Treg-celler avledet fra foxp3
GFP transgene mus uttrykte ikke CCR6 (figur 2C-D). I tillegg fordøyd vi kolorektal svulst fra mus behandlet med MNU og H.
pylori
, og bestemt CCR6 uttrykk for tumor-infiltrerende Treg-celler ved Flow cytomery. Konsekvent, fant vi tumor-infiltrerende Treg-celler nesten utelukkende uttrykt CCR6 (figur 2E, F). For å bekrefte hvorvidt CCR6 var nødvendig for migrering av treg-celler til tumor områder, podet vi mus colorektal tumorcellelinje CMT93 inn i CCR6 – /- mus. To uker etter CMT93 pode, tumor-infiltrerende Treg-celler i CCR6 – /- mus ble undersøkt av Flow cytomery. Vi har observert at infiltrasjon av treg-celler ble fullstendig forhindret i fravær av CCR6 i CCR6 – /- mus sammenlignet med CCR6 + /+ mus (figur 2G, H). Disse dataene antyder at homing og smugling av tumor-infiltrerende Treg-celler til tumormassen er avhengig kjemokinreseptoren CCR6
in vivo
i CRC musemodell podet med CMT93.
treg -cellene (0,5-1 x 10
6) renset fra milten av foxp3
GFP mus ble adoptiv overført til mus med CRC indusert av MNU og H.
pylori
. (A) frysesnitt fra tumor ble farget for cellekjerner med DAPI å undersøke infiltrering av foxp3
GFP + treg-celler i tumormasse (opprinnelig forstørrelse x 20). (B) samlokalisering av GFP med CCR6 farging. (C, D) flowcytometrisk analyse for CCR6 av FoxP
GFP + Treg-celler avledet fra perifert blod naive foxp3
GFP mus. (E, F) flowcytometrisk analyse for CCR6 av infiltrerende Treg-celler avledet fra CRC indusert av MNU og H.
pylori
hos mus. For å bekrefte om CCR6 er nødvendig for foxp3
+ Treg celler smugling, ble CMT93 cellelinje podet inn CCR6 – /- og CCR6 + /+ mus. (G, H) Strømningscytometrisk analyse av tumor-infiltrerende CD4
+ foxp3
+ treg-celler to uker etter CMT93 cellelinje poding i CCR6 – /- (G) og CCR6 + /+ (H) mus. Representative data er vist som hadde blitt gjengitt i 4 uavhengige eksperimenter.
TAMs bidro til produksjonen av CCL20, liganden av CCR6
CCL20 er hittil kjent for å være den eneste ligand for CCR6 og i stand til å styre migreringen av CCR6
+ celler [20]. For å undersøke mulig produksjon av CCL20 i svulstvev, tumor frysesnitt tatt fra C57BL /6J mus behandlet med MNU og H.
pylori
ble immunostained med anti-mus CCL20 mAb. Det ble observert at ekspresjon av chemokine CCL20 (røde flekker) ble markert økt i CRC vev sammenlignet med normal slimhinne (figur 3A, B). Koordinert signalering mellom tumorceller og ikke-ondartede betennelsesceller i svulsten mikromiljøet er nødvendig for utvikling av svulster. Blant dem, makrofager er store produsenter av proinflammatoriske cytokiner som tumor nekrose faktor-a (TNF-α), IL-1β og IL-6, og spiller en avgjørende rolle i modulerimmunresponser [22]. For å undersøke om makrofager er en viktig kilde til CCL20 i tumor områder, var dobbelt immunfluorescens farging utført på kryo-seksjoner avledet fra tumor biopsier av mus behandlet med MNU og H.
pylori
. Det ble observert at i tillegg til F4 /80
+ makrofager, andre celler også produsert CCL20 i tumor områder av mus (figur 3C), noe som indikerer at CCL20 utgitt av TAMs eller andre kan indusere treg-cellemigrering til tumorer. For å klargjøre hva andre celler produserer CCL20, transducted vi CMT93 med GFP, og podet subkutant til C57BL /6J mus (Figur 3D). Tre uker senere, vi oppdaget de fleste av CCL20
+ -celler (78,98%) ble GFP
+ CMT93 tumorceller, noe som antyder de fleste andre CCL20-produserende celler er tumorceller (figur 3E). For å avgjøre om makrofager er ansvarlig for overproduksjon av CCL20 i tumormassen, vi ko-dyrkede CMT93 kreftceller med fersk muse peritonealmakrofager i 48 timer i en transwell apparat. Vi demonstrerte at i ko-kulturen både makrofager og CMT93 kreftceller produsert økte nivåer av CCL20, sammenlignet med enten makrofager eller CMT93 kultur alene (figur 3F, G). Påfallende, i co-kultur CMT93 og mus bukhinnemakrofager, CMT93 kreftceller produsert 26,4 ganger mer CCL20 enn makrofager på mRNA nivåer, noe som tyder på at makrofager kan samspill med kreftceller for produksjon av CCL20 i svulsten mikromiljøet (figur 3F). I tillegg ble økt proteinnivå CCL20 bekreftet av ELISA i co-kultur (figur 3 H).
(A, B) frysesnitt fra mus CRC indusert av MNU og H.
pylori
eller mus normal kolon ble farget for CCL20 (rød, original Magni-fiseringen, × 20). Dobbel farging med anti-mus CCL20 og F4 /80 mAb ble utført på frysesnitt som stammer fra mus CRC. (C) co-lokalisering av CCL20 med F4 /80 farging (opprinnelig forstørrelse x 20). (D) CMT93 ble transducted med GFP, og bekreftet ved strømningscytometri. (E) Flowcytometrisk analyse av CCL20
+ celler tre uker etter GFP
+ CMT93 celler pode i C57BL /6J mus. (F) mRNA nivåer av CCL20 samarbeidskultur muse bukhinnemakrofager med CMT93 kreftceller. AU, vilkårlige enheter. (G) Protein nivåer av CCL20 samarbeidskultur muse bukhinnemakrofager med CMT93 kreftceller. Representative data er vist som hadde blitt gjengitt i minst 2 uavhengige eksperimenter. *
p
0,05, **
p
0,01, ***
p
. 0,001, Students
t
test
Samtidig injeksjon av rekombinante muse CCL20 resultater i smugling av CCR6
+ treg-celler i svulster, og fremming av CRC vekst i mus
tumor-infiltrerende treg-celler undertrykke priming og effektor funksjon av tumor drepe effektor-T-celler, noe som bidrar til tumorvekst og utvikling [11]. For å finne ut hvilken rolle CCL20 i migrasjon av Treg-celler
in vivo
, vi subkutan injisert CMT93 murine CRC cellene sammen med rekombinant mus CCL20 inn foxp3
GFP transgene mus. Ved hjelp av hele kroppen små dyr fluorescens bildesystem for å overvåke overføringen av treg-celler [23], demonstrerte vi at rekombinant mus CCL20 rekruttert et stort antall GFP
+ treg-celler i tumorer (hvit pil) sammenlignet med PBS- behandlede gruppene (figur 4A-C). For ytterligere å bekrefte GFP-merket treg-celler migrert til tumormassen i respons til rekombinant mus CCL20, ble enkeltcellesuspensjoner av tumorvev fremstilt og foxp3
GFP + treg-celler ble påvist ved Flow cytomery ved slutten av forsøket . I kontrast til PBS behandling, observerte vi at GFP
+ treg-celler ble signifikant økt i løpet av tumoren som ble behandlet med rekombinant mus CCL20 (figur 4D). For ytterligere å studere patologiske betydningen av CCL20, administreres vi rekombinant mus CCL20 rundt kreft nettsider ukentlig i 4 uker. Vi viste at tumorstørrelse øker betydelig hos mus behandlet med rekombinant mus CCL20 sammenlignet med PBS kontroller (Figur 4E), noe som tyder på en kritisk rolle CCL20 i CRC vekst og utvikling. I menneskelige CRC pasienter ble CCR6 også funnet å bli uttrykt ved primær CRC celler [24]. Derfor, for definitiv bekreftende undersøkelse, podet vi CMT93 CRC kreftceller i CCR6 – /- mus. I denne modellen vil tumor-infiltrerende lymfocytter (TIL) ikke uttrykke CCR6. To uker senere vi analysert ved flowcytometri for CCR6 uttrykk for enkelt cellesuspensjon fremstilt fra pode CRC. I samsvar med studie i menneskelig CRC pasienter [24], vi bemerket at i CCR6 – /- mus, så mye som 73,71% av pode CRC celler uttrykt CCR6 (figur 4F). Mest interessant, observerte vi at rekombinant mus CCL20 stimulert CMT93 CRC cellevekst ved å direkte aktivere CCR6 på tumorceller i fravær av CCR6
+ TIL i CCR6 – /- mus (figur 4G). Dette CCL20 mediert effekt er sannsynlig å skje via tiltrekke Treg-celler til svulsten masse eller direkte stimulerende CRC kreftceller eller begge.
Mus kolorektal cellelinje, CMT 93 (1 × 10
6) med eller uten 0,5 pg rekombinant mus mus CCL20 i 100 ul PBS ble injisert sc inn i foxp3
GFP mus, og 0,5 pg rekombinant mus CCL20 i 100 ul PBS ble injisert s.c. ukentlig i 28 dager. Kontroll foxp3
GFP mus fikk bare 100 mL PBS injeksjon. (A) Normal foxp3
GFP-mus ble anvendt som en kontroll teknikk. (B, C) grønn fluorescens av foxp3
GFP + celler i mus behandlet PBS eller rekombinant mus CCL20 (hvit pil) ble overvåket ved hjelp av IVIS Imaging System på dag 28. (D) Numbers of tumor-infiltrerende foxp3
GFP + treg-celler avledet fra podet CRC hos mus behandlet med PBS eller rekombinant mus CCL20 ble analysert ved flow-cytometri. (E) størrelsene av tumorer ble målt av målepunkter på de angitte tidspunkter i 28 dager. Injeksjon av rekombinant mus CCL20 resulterte i en signifikant økning i tumorstørrelser (n = 5). (F) Expression nivåer av CCR6 av podet CRC i CCR6 – /- mus. (G) CMT 93 (1 x 10
6) med eller uten 0,5 pg rekombinant mus mus CCL20 i 100 ul PBS ble injisert s.c. til CCR6 – /- mus, og 0,5 pg rekombinant mus CCL20 i 100 ul PBS eller 100 ul PBS ble injisert s.c. ved annenhver dag i 21 dager. Tumorvekt av CRC ble målt ved slutten av forsøket. Representative data er vist som hadde blitt gjengitt i 3 uavhengige eksperimenter. *
p
0,05, **
p
0,01, Student
t
test
Selektiv uttømming av makrofager i CD11b. -DTR mus som CCL20 reduserte tumornivåer, blokkert CCR6
+ treg-cellerekruttering inn i tumormassen og hemmet tumorvekst
CD11b-DTR transgene mus har CD11b promoter-mediert ekspresjon av det humane difteri-toksin (DT ) reseptor, og dette induserbar system selektivt utarmer makrofager
in vivo
når DT injiseres [25]. For å undersøke om
in vivo
DT behandling kan eliminere TAMs i CMT93 pode CRC modell, må vi først injisert DT eller DT
mu i en konsentrasjon på 25 ng /g mus vekt en dag før pode CMT93 i CD11b -DTR transgene mus. Deretter, behandlet vi mus med DT eller DT
mu ved en konsentrasjon på 5 ng /g hver tredje dag i 14 dager. Etter avtale med andre, viste vi at DT selektivt utarmet F4 /80
+ makrofager 24 timer etter injeksjon, men hadde ingen signifikant effekt på T-celler, nøytrofile, mastceller eller modne Langerhans celler /dendrittiske celler (data ikke vist) [ ,,,0],26]. På slutten av eksperimentet, våre data viste at DT behandling fullstendig eliminert F4 /80
+ TAMs i CRC sammenlignet med DT
mu injeksjon (figur 5A, B). Vi videre undersøkt CCL20 uttrykk i svulstvev avledet fra mus behandlet med DT, fant vi at selektiv nedbrytning av makrofager resultert i en markert nedgang i både CCL20 mRNA nivå (figur 5C) og CCL20 proteinnivå (figur 5D) i tumormasse sammenlignet med DT
mu behandling. For å undersøke om TAMs promotere utgivelsen av CCL20 fra CMT93 tumorceller
in vivo
, vi podet GFP
+ CMT93 tumorceller i CD11b-DTR transgene mus. Etter behandling av DT eller DT
mu i 14 dager, observerte vi at den selektive uttømming av TAMs tydeligvis hemmet produksjonen av CCL20 ved CMT93
GFP mus kreftceller, noe som tyder på at TAMs er ikke bare den viktigste kilden til CCL20 men også tydelig bidra til utgivelsen av CCL20 fra CRC celler i mus (figur 5E). Videre viste vi at DT behandling ikke redusere CCR6 uttrykk ved CMT93
GFP mus tumorceller i forhold til DT
mu (Figur 5F). Men mus CRC celler har lav CCR6 uttrykk før pode til verter (figur 5F). Viktigst, makrofag uttømming ved administrering av DT førte til en markert reduksjon i antall tumor-infiltrerende foxp3
+ treg-celler (figur 5G, H). Sammen indikerer disse data at TAMs støtter akkumulering av CCR6
+ tumor-infiltrerende treg-celler, og, i det minste delvis via denne mekanisme, for å fremme frigjøring av CCL20 i CRC hos mus. Til slutt fant vi at selektiv fjerning av TAMs dramatisk hemmet veksten av CRC i mus (figur 5i, J), viser en kritisk svulst fremmende rolle TAMs i CRC musemodell.
(A, B) Flow cytometri analyse av TAMs avledet fra podet CRC i CD11b-DTR mus injisert med DT
mu eller DT. (C) CCL20 mRNA nivåer i podet CRC i CD11b-DTR mus injisert med DT
mu eller DT (data fra 5 mus i hver gruppe ble slått sammen). (D) Lysates av podet CRC fra CD11b-DTR mus injisert med DT
mu eller DT ble utsatt for western blotting for CCL20 uttrykk. Actin – lasting kontroll. (E) Immunofluorescens farging med anti-mus CCL20 ble utført på frysesnitt av GFP
+ CMT93 podet tumormasse avledet fra CD11b-DTR mus injisert med DT
mu eller DT i 14 dager. (F) Flowcytometrisk analyse av CCR6 uttrykk for GFP
+ CMT93 celler før pode (venstre panel), og CCR6 flekker på frysesnitt av GFP
+ CMT93 podet tumormasse avledet fra CD11b-DTR mus injisert med DT
mu eller DT i 14 dager (midtre og høyre panel). (G, H) Antall tumor-infiltrerende foxp3
+ Treg-celler i podet CRC i CD11b-DTR mus injisert med DT
mu eller DT. (I) CRC podet i CD11b-DTR mus injisert med DT
mu eller DT i 14 dager. (J) Tumorvekt av CRC podet i CD11b-DTR mus injisert med DT
mu eller DT i 14 dager. Representative data vises som hadde blitt gjengitt i 2 uavhengige eksperimenter.
Diskusjoner
De medfødte og ervervede immunforsvar kan fremme svulst utvikling gjennom betennelse avhengige mekanismer [2], [27 ]. Denne hendelsen er koordinert av mange betennelsesceller, blant dem foxp3
+ Treg-celler er tenkt å undertrykke T-celle immunitet mot tumorassosierte antigener og legge til rette for tumorprogresjon [4]. Foxp3 er den mest definitive maker av treg-celler, og dets deteksjon kunne tillate en bedre forståelse av mekanismene gjennom hvilke treg-celler er involvert i autoimmune og infeksjonssykdommer, såvel som transplantasjon og tumorimmunitet [28]. Selv om mange studier har fokusert på rollen Treg-celler i å kontrollere selv reaktivitet, det er en økende mengde bevis som indikerer at Treg-celler har en betydelig innvirkning på vertsresponsen til kreft [29], [30], inkludert CRC [31], [32]. Det ble tidligere rapportert at pasienter med høye frekvenser av infiltrerende CD3
+ T celler innenfor sine kolorektal tumorer har vært antatt å ha en bedre 5-års overlevelse (73%) enn de med lave nivåer av CD3
+ T -celler (30%) [33]. Men innenfor dette CD3
+ -T-cellepopulasjonen, bortsett fra effektor-T-celler, treg-celler er ansett å undertrykke anti-tumor immunrespons hos pasienter med CRC [34]. I denne studien har vi også bekreftet at foxp3
+ Treg-celler er høyt akkumulert i mikromiljøet i CRC musemodell, støtter ideen om at tilstedeværelsen av Treg-celler kan tillate utslipp av kreftceller fra immun overvåking av cytotoksiske T lymfocytter i CRC pasienter.
som andre menneskelige sykdommer, er musemodeller mye brukt til å belyse mekanismene som er involvert i kolon kreftutvikling (initiering, promotering og progresjon) samt studier på chemoprevention og intervensjon [35]. Heri vi indusert CRC i C57BL /6J mus med MNU og H.
pylori
å undersøke Treg-celle trafficking, differensiering og funksjon. MNU er en direkte alkyleringsmiddel som ikke krever metabolsk aktivering, og således er en potent aktuell karsinogener [21]. Vi har funnet den strategi som brukes for induksjon av CRC i mus er ganske effektiv som 85% mus brukt i denne studien utviklet synlig CRC under utfordringen med MNU og H.
pylori
(upubliserte observasjoner).
Bevis støtter en viktig rolle for foxp3
+ treg-celler i svulsten immune evasion kommer fra studier som elimineres treg-celler før svulsten utfordring. Denne behandlingen resulterte i tumor avvisning i flere musetumormodeller [10], [36], [37], [38]. Som i innstillingene menneskelige [34], ble en økt antall Treg-celler observert både i perifert blod (figur S2) og solide svulster hos mus behandlet med MNU og H.
pylori
sammenlignet med vanlig kolon av ubehandlet mus . Mest interessant, i faste tumorer avledet fra mus behandlet MNU og H.
pylori
, hyppigheten av CD4
+ foxp3
+ treg-celler var et gjennomsnitt på 9,095% av det totale TIL, noe som tyder at disse akkumulerte treg-celler kan tjene som en felles immunsvik mekanisme for å hindre immunosurveillance mot autologe tumorceller. Treg-celler utfører en viktig funksjon for å begrense autoimmunitet og så målretting Treg-celle migrasjon kan tjene som en roman og foretrukne tilnærming i immunterapi av samlede tumorprogresjon. I tillegg har vi oppdaget noen CD4
– celler som uttrykker foxp3 i tumormassen. Opprinnelsen til CD4
-FoxP3
+ celler vil bli sendt til fremtiden etterforskningen.
For å fungere effektivt i svulsten mikromiljøet, Treg-celler må migrere til og operere i ulike lymfoide og ikke- lymfoide organer. I likhet med effektor-T-cellepopulasjoner, er treg-cellepopulasjoner oppdelt på grunnlag av deres ekspresjon av homing reseptorer inn i undergrupper som er anslått til å migrere fortrinnsvis til visse vev [39]. Studier med humane eggstokkreft har avdekket at Treg-celler hjem til tumormassen og ascites
via
CCR4 svar på svulst celle- og TAM-avledet CCL22 [15]. Likevel har voksende bevis antydet at bortsett fra CCR4 noen andre kjemokin reseptorer er involvert i førings treg-celletrafikken i forskjellige typer tumorer i både humane og mus [17], [40]. Derfor kjemokinreseptor ekspresjonsmønstre synes å være svært heterogene innenfor den perifere foxp3
+ treg-cellepopulasjonen [11]. Til dags dato har ingen enkelt homing reseptor blitt identifisert som er spesielt uttrykt av Treg-celler. Men blant CD4
+ T-celler, kjemokinreseptoren CCR6 er hovedsakelig uttrykt av treg-celler i forskjellige inflammatoriske innstillinger [41]. Tilsvarende er det CCR6 ligand CCL20 konstitutivt uttrykt av intestinale epitelceller, og oppregulert i epitel-celler i løpet av inflammasjon [42].
