Abstract
Oppnå en effektiv behandling av kreft er vanskelig, spesielt når motstand mot konvensjonell kjemoterapi er utviklet. P-glykoprotein (P-gp) aktivitet styrer multimedikamentresistens (MDR) utvikling i forskjellige cancercelletyper. Identifikasjon av kreftlegemidler med potensial til å drepe kreftceller og samtidig hemme MDR er viktig å intensivere jakten på nye terapeutiske tilnærminger. Vi undersøkte effekten av sulfinosine (SF), et ganske uutforsket purinnukleosidanalogen, i MDR (P-gp overuttrykkende) ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) og glioblastom cellelinjer (NCI-H460 /R og U87-TXR , henholdsvis). SF viste samme effekt mot MDR kreftcellelinjer og deres sensitive kolleger. Men det var ikke-toksisk for normale humane keratinocytter (HaCaT). SF indusert caspase-avhengig apoptotisk celledød og autofagi i MDR kreftceller. Etter SF søknaden, ble reaktive oksygenforbindelser (ROS) generert og (GSH) konsentrasjon glutation ble redusert. Ekspresjonen av nøkkelenzymet for GSH-syntese, ble gamma Glutamyl-cystein-syntetase (γGCS) ble redusert, så vel som ekspresjon av
GST-π
mRNA. Derfor SF betydelig redusert uttrykk for
HIF-1α
,
MDR1 Hotell og
VEGF
mRNA selv i hypoksiske forhold. SF forårsaket inhibering av P-gp (kodet ved
MDR1
) ekspresjon og aktivitet. Oppbyggingen av standard kjemoterapeutisk middel – doxorubicin (DOX) ble indusert ved SF i treringstrinnet og tidsavhengig måte. Den beste effekten av SF ble oppnådd etter 72 timer når det oppnådd effekten av kjente P-gp-hemmere (Dex-verapamil og tariquidar). Følgelig SF sensitivisert de resistente kreftceller til DOX i etterfølgende behandling. Videre redusert SF experssion av vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF) på mRNA og proteinnivå og modulert dens sekresjon. I konklusjonen, virkningene på P-gp (innblandet i farmakokinetikk og MDR), GSH (innblandet i avgiftning) og VEGF (involvert i tumor-angiogenese og progresjon) kvalifisere SF som multi-potent anti-kreft agent, som bruk må vurderes , spesielt for resistente maligniteter
Citation. Dačević M, Isakovic A, Podolski-Renić A, Isakovic AM, Stanković T, Milošević Z, et al. (2013) purinnukleosidanalogen – Sulfinosine modulerer Diverse Mekanismer av kreft progresjon i multiresistent Cancer Cell Lines. PLoS ONE 8 (1): e54044. doi: 10,1371 /journal.pone.0054044
Redaktør: Michihiko Kuwano, Kyushu University, Japan
mottatt: 26. juli 2012; Godkjent: 05.12.2012; Publisert: 11 januar 2013
Copyright: © 2013 Dačević et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Departementet utdanning, vitenskap og teknologisk utvikling av Serbia (tilskudds tall III 41031 og III 41025) støttet denne forskningen. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Sulfinosine eller SF (figur 1, [R, S] -2-amino-9-β-D-ribofuranosylpurine-6-sulfinamidet) er oksidert form av 6-thioguanosine [1]. Det er en ganske uutforsket middel mot kreft i forhold til andre thiopurines (6-tioguanin og 6-merkaptopurin). SF hemmer kreftcellevekst, i det minste delvis, ved inkorporering av dens fosforylerte derivater i DNA. Den metabolske konvertering av SF til tilsvarende 5′-monofosfat derivat er mer kompleks enn for andre thiopurines [2].
Siden SF benytter ulike metabolske veier for sin intracellulær aktivering, SF behandling induserer ikke motstand i kreftceller. I motsetning til dette er delesjon av et enkelt enzym som er ansvarlig for metabolsk aktivering av andre purin-nukleosid-analoger nok for utvikling av resistens. SF bedre trenger inn i sentralnervesystemet (CNS) enn foreldremolekylet – 6-thioguanosine og er mer effektiv i behandling av kreft. SF er nyttig mot ondartede sykdommer som er resistente mot andre thiopurines [3]. Til tross for begrensninger for deres bruk, noen purinanaloger nært knyttet til SF viste betydelige anti-angiogene aktiviteter som fortjener vitenskapelig oppmerksomhet [4].
Metabolismen av SF innebærer cellene «glutation system. SF adduktene lett å sulfhydryl-forbindelser (glutation og cystein) og ved å undertrykke den glutation avgiftning system og heve konsentrasjonen av reaktive oksygenarter (ROS), kan SF indusere død av kreftceller [2].
I betraktning av dens betydelige effektivitet i kreftbehandling og moderat toksisitet overfor normale celler [2], er SF egnet for kombinasjon med andre kjemoterapeutiske midler. SF virker synergistisk med doxorubicin (DOX), curcumine (CUR) og verapamil (VER) i ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) cellelinjer [5] – [7]. Effektiviteten av den kombinerte anvendelsen sammen med SF tillatt bruk av disse stoffene ved lavere konsentrasjoner som er mindre toksiske med færre bivirkninger. Vi antok at alle nevnte anti-kreft-effekter av SF kan være nyttig for tilbakeføring av resistens mot kjemoterapeutika.
multimedikamentresistens (MDR) er den viktigste begrensning for gjennomføringen av vellykket behandling av kreft. MDR-fenotypen ofte er knyttet til overekspresjon av P-glykoprotein (P-gp), en membran transportør som effektivt ekstruderer de cytotoksiske medikamenter fra kreftceller og endrer deres farmakokinetikk. P-gp fungerer som en efflukspumpen for ulike hydrofobe kreft narkotika som antracykliner, vinkaalkaloider, taxaner, epipodofyllotoksiner, og noen av de nye stoffene (f.eks imatinib, nilotinib, everolimus). P-gp over-ekspresjon er vanlig hos cancer eksperimentelle modeller samt i cancervev fra pasienter [8]. Derfor har P-gp blitt en viktig terapeutisk mål for å overvinne MDR.
Blant mange muligheter for å gå tilbake MDR, kunne agenter med en anti-kreft aktivitet av sine egne bli undersøkt som potensielle MDR modulatorer. Vi har spekulert tidligere at foruten synergien mellom SF og DOX som anti-kreft legemidler som virker gjennom separate baner, kan de forandringer av MDR-relaterte gener ekspresjon og reduksjon av P-gp-aktivitet bidrar til den chemo-sensibilisering virkning av SF [5], [6].
Derfor gjennomførte vi videre undersøkelser av mekanismene som er involvert i SF aksjon i resistente og uhelbredelig kreft. For dette formålet, ansatt vi to forskjellige MDR kreftcellelinjer med overekspresjon av P-gp (NCI-H460 /R og U87-TXR) [9], [10]. Vi har studert mulighetene for SF å drepe resistente kreftceller og induserer autofagi, så vel som å modulere de mekanismene som er involvert i cancer progresjon, for eksempel glutation (GSH) avgiftning system, P-gp-mediert medikamenttransport, vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF) ekspresjon and.secretion. Vi har funnet at modifiseringen av redoks-status ved SF ført til en reduksjon i ekspresjonen av hypoksi induserbar faktor-1α (HIF-1α) som regulerer ekspresjon av P-gp og VEGF. Dermed modulering av MDR ved SF er konsekvensen av GSH avgiftning system undertrykkelse.
Materialer og metoder
Drugs
SF ([R, S] -2-amino -9-β-D-ribofuranosylpurine-6-sulfinamidet) ble syntetisert fra 6-thioguanosine i henhold til den publiserte fremgangsmåten [1]. DOX Løsningen ble hentet fra Ebewe Arzneimittel GmbH, Wien, Østerrike. R ± Verapamil (Dex-VER) ble kjøpt fra Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Tyskland. Tariquidar (TQ) ble vennlig levert av Dr. Sven Rottenberg fra Nederland Cancer Institute, Amsterdam. CoCl
2 ble hentet fra Fisher Scientific, USA. SF ble holdt ved -20 ° C. Før behandling, SF og CoCl
2 ble friskt fortynnet i vann, mens alikvoter av DOX ble tint fra -20 ° C. Dex-VER ble holdt som en mM lagerløsning ved romtemperatur. TQ ble fortynnet i dimetylsulfoksid (DMSO) og 10 uM aliquoter ble holdt ved -20 ° C.
Chemicals
RPMI 1640 medium, Minimum Essential Medium (MEM), penicillin-streptomycin-løsning, antibiotika-antimycotic løsning, L-glutamin og trypsin /EDTA ble kjøpt fra PAA, Wien, Østerrike. Føtalt bovint serum (FBS), ble sulforhodamin B (SRB) og akridin orange oppnådd fra Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Tyskland. Matrigel ble vennlig levert av Dr. Sanja Mijatovic fra Institute for Biological Research «Sinisa Stankovic», Universitetet i Beograd, Serbia. Propidiumjodid (PI) ble kjøpt fra Roche Applied Science, Basel, Sveits og Annexin-V-FITC (AV) fra Abcam, Cambridge, UK. FITC-konjugert anti-P-gp antistoff ble gitt av BD Biosciences, Storbritannia, mens PE-konjugert anti-VEGF antistoff ble hentet fra R D Systems, Minneapolis, MN USA. Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE), dihydroethidium (DHE) ble oppnådd fra Molecular Probes®, Invitrogen, CA, USA. Primære antistoffer mot caspase 3 og β-aktin ble kjøpt fra Cell Signaling Technology Inc, Danvers, MA, USA, mens primær antistoff mot gamma-glutamyl syntetase (γGCS) var en slags gave fra Dr Bato Korac, Institutt for biologisk forskning «Sinisa Stankovic «Universitetet i Beograd, Serbia. Konjugert geit anti-kanin IgG ble hentet fra Jackson Immunoresearch Laboratories Inc, West Grove, PA, USA.
Celler og cellekultur
NCI-H460 og U87-cellelinjer ble kjøpt fra American Type Culture Collection, Rockville, MD. NCI-H460-celler ble holdt i RPMI 1640 supplert med 10% FBS, 2 mM L-glutamin, 4,5 g /l glukose, 10 000 U /ml penicillin, 10 mg /ml streptomycin, 25 ug /ml amfotericin B-løsning ved 37 ° C i en fuktet 5% CO
2 atmosfære. NCI-H460 /R-celler ble opprinnelig valgt fra NCI-H460-celler i vårt laboratorium og dyrket i et medium inneholdende 100 nM DOX som tidligere beskrevet [9]. U87-celler ble dyrket i MEM supplert med 10% FBS, L-glutamin (2 mM) og 5 000 U /ml penicillin, 5 mg /ml streptomycin-løsning. U87-TXR-celler ble valgt fra U87-celler i vårt laboratorium etter kontinuerlig eksponering for trinnvis økende konsentrasjoner av paklitaxel (100-300 nM) i en periode på 9 måneder som allerede er publisert [10]. HaCaT cellelinje (normale humane keratinocytter hentet fra CLS – Cell Lines tøy, Eppelheim, Tyskland) var raus gave fra professor Andra Jorg, Seksjon for biofysikk, Research Center Borstel, Leibniz-Center for medisin og biovitenskap, Borstel, Tyskland. HaCaT-celler ble dyrket i DMEM supplementert med 10% FBS, 4 g /l glukose, L-glutamin (2 mM) og 5 000 U /ml penicillin, 5 mg /ml streptomycin-løsning. MDR kreftceller ble sub-dyrket ved 72 timers intervaller ved bruk av 0,25% trypsin /EDTA og utsådd i et friskt medium med følgende densiteter: 8000 celler /cm
2 til NCI-H460, 16.000 celler /cm
2 etter NCI-H460 /R og U87, 32.000 celler /cm
2 for U87-TXR. HaCaT cellene ble sub-dyrket ved 144 timers mellomrom bruker 0,25% trypsin /EDTA og sådd inn i en frisk medium på 64 000 celler /cm
2.
Sulforhodamine B analysen
Celler dyrket i 25 cm
2 vevs kolber ble trypsinert, sådd ut i flatbunnede 96-brønners vevskultur-plater og inkubert over natten. Undersøkte cellelinjer NCI-H460, NCI-H460 /R, U87, U87-TXR og HaCaT celler ble sådd ved 4, 000, 8000, 8000 og 16.000 celler /brønn, hhv. SF behandling (1-100 pM) varte i 72 timer. De cellulære proteiner ble beiset med sulforhodamin B (SRB) analyse, etter noe modifisert protokoll av Skehan et al [11]. I korthet ble cellene i 96-brønners plater fiksert i 50% trikloreddiksyre (50 pl /brønn) i en time ved 4 ° C, skylt i springvann og farget med 0,4% (w /v) sulforhodamin B i 1% eddiksyre syre (50 pl /brønn) i 30 minutter ved romtemperatur. Cellene ble deretter skylt tre ganger i 1% eddiksyre for å fjerne ubundet flekken. Det proteinbundne flekken ble ekstrahert med 200 pl 10 mM Tris-base (pH 10,5) per brønn. Den optiske tetthet ble avlest ved 540 nm, med korreksjon på 670 nm (LKB 5060-006 Micro Plate Reader, Wien, Østerrike).
Matrigel Vekst
For tredimensjonale (3-D ) kulturer, ble cellene sådd ut i samme tettheter som for to (2-D) kulturer på rekonstituert (pre-gelert) basalmembran (Matrigel, BD Biosciences, San Jose, CA, USA) i RPMI 1640 medium med 10% FBS. Celler ble inkubert i 72 timer og fotografert levende ved fasemikroskopi.
Bestemmelse av celleproliferasjon (CFSE Farging)
Hastigheten av celleproliferasjon ble målt ved flow-cytometrisk analyse av celler merket med karboksyfluorescein succinimidylester eller CFSE [12]. I korthet, frittliggende celler (5 x 10
6 celler /ml) ble merket med 1 uM CFSE i 10 minutter i mørke ved 37 ° C, vasket to ganger i friskt medium, sådd ut i seks-brønns plater ved 5 x 10
4 per brønn, og deretter eksponert for SF. Etter 72 timers dyrkning ble cellene trypsinert og vasket to ganger i PBS. Til slutt, ble cellene resuspendert i PBS og analysert ved flow-cytometri. Grønn fluorescens utslipp ble målt ved hjelp av en FACSCalibur flow-cytometer (Becton Dickinson, Oxford, Storbritannia) og analysert ved hjelp av Cell-Quest programvare.
Cell Død Detection
De prosenter av apoptotisk, nekrotisk og levedyktige celler ble bestemt ved Annexin V-FITC-(aV) og propidiumjodid (PI) merking. NCI-H460 /R og U87-TXR celler ble sådd ut og inkubert over natten i 6-brønners plater ved tetthet på 80.000 og 160.000 celler /brønn, respektivt. Etter 72 timer med SF behandling ble festet og flytende cellene oppsamlet ved sentrifugering. Den celler pellet ble re-suspendert i 100 ul bindingsbuffer inneholdende 10 mM HEPES /NaOH, 140 mM NaCl, 5 mM CaCl
2 (pH 7,4), supplert med 0,2 ug AV og 1 ug PI. Etter inkubasjonsperioden (30 minutter ved 37 ° C i mørke), ble ytterligere 400 ul av bindingsbuffer tilsatt, og AV /PI farging ble analysert i løpet av 1 time ved flow-cytometri. Fluorescens intensitet (grønn FL1-H og rød FL2-H) ble målt på FACSClibur flow-cytometer (Becton Dickinson, Oxford, Storbritannia). I hver prøve ble 10.000 celler registrert (gated for å utelukke celleavfall), og prosentandelene av levedyktige (AV- PI-), tidlig apoptotisk (AV + PI-), apoptotiske og nekrotiske (AV + PI +), og som allerede er døde (AV- PI +) celler ble analysert ved hjelp av Cellquest Pro dataanalyse-programvare.
caspaseaktivering
aktivering av kaspaser ble målt ved flow-cytometri etter merking av cellene med en celle-gjennomtrengelig, FITC-konjugert pan- caspaser inhibitor (ApoStat; R D Systems, USA). En isotypekontroll IgG2a (Abcam, Cambridge, Storbritannia) ble evaluert for hver forsøksprøve for å diskriminere graden av bakgrunnsfluorescens av negative celler. Mean fluorescens intensitet ble bestemt for positivt fargede celler. Prøvene ble holdt på is i mørke før analysen på FACSCalibur flow-cytometer (Becton Dickinson, Oxford, Storbritannia). Fluorescensen av FITC-konjugert anti-P-gp ble vurdert på fluorescens kanal 1 (FL1-H) ved 530 nm, mens PE-konjugert anti-VEGF ble vurdert på fluorescens kanal 2 (FL2-H) ved 585 nm. Minst 10.000 hendelsene ble analysert for hver prøve (porten ekskludert cellerester og døde celler) og de oppnådde resultatene ble analysert ved hjelp av Cell quest Pro programvare (Becton Dickinson, Oxford, Storbritannia).
MTT-analyse
Cell metabolsk aktivitet ble bedømt ved MTT-assay basert på reduksjonen av 3- (4,5-dimetyl-2-thizolyl) -2,5-difenyl-2H-tetrazolium-bromid (MTT, Sigma, St. Louis , MO) i formazanforbindelsen fargestoff av aktive mitokondrier av levende celler. De kombinerte effekten av samtidige og etterfølgende behandling ble undersøkt på MDR kreftcellelinjer. NCI-H460 /R og U87-TXR celler fremstilt for samtidig behandling ble sådd ved 4, 000 og 8000 celler /brønn, hhv. SF behandling (5 uM) i kombinasjon med forskjellige konsentrasjoner DOX varte i 72 timer. De påfølgende behandlinger ble utført på NCI-H460 /R og U87-celler TXR opprinnelig sådd ut ved lavere tettheter (500 celler /brønn og henholdsvis 1.000 celler /brønn,). Forbehandling med 5 uM SF varte i 72 timer og ble etterfulgt av ytterligere 72 timers behandling med forskjellige konsentrasjoner av DOX. MTT ble tilsatt til endelig konsentrasjon på 0,1 mg /ml i hver brønn av en 96-brønners mikroplate, og platene ble inkubert ved 37 ° C i 4 timer. Deretter DMSO ble tilsatt for å oppløse formazanprodukt, hvilken mengde var proporsjonal med antallet levende celler. Absorbansen av oppløste fargestoff ble målt ved 540 nm ved hjelp av en automatisk mikroplateleser (LKB 5060-006 Micro Plate Reader, Wien, Østerrike). Vekstinhibering (I) ble bestemt i henhold til følgende rir:. Hvor A er for absorbans
IC
50-verdien ble definert som konsentrasjonen av hvert medikament som hemmet cellevekst med 50%. IC
50 ble beregnet ved lineær regresjonsanalyse ved hjelp av Excel-programvare.
ELISA for påvisning av humant VEGF
165 i cellekulturmedium
MDR-celler (NCI-H460 /R og U87-TXR), sådd i 6-brønns plater ble inkubert over natten og deretter behandlet med SF. Cellen mediet (supernatant) ble oppsamlet 24 timer, 48 timer og 72 timer etter behandling for bestemmelse av utskilt VEGF
165 protein av VEGF immunoassay kit (Quantikine human VEGF ELISA kit, R 0,05 (*), p 0,01 (**), p. 0,001 (***)
Diskusjon
SF hemmer veksten av MDR
Resultater og kreft~~POS=TRUNC celler~~POS=HEADCOMP
Vi etablerte NSCLC og glioblastom P-gp over-uttrykker cellelinjer (NCI-H460 /R og U87-TXR) med MDR fenotype for å undersøke mulige kreftlegemidler [9], [10 ]. NCI-H460 /R og U87-TXR er MDR kreftcellelinjer som stammer fra NCI-H460 (NSCLC cellelinje) og U87 (glioblastom cellelinje). Foreldrecellelinjer ble betraktet som sensitive siden celler avledet fra pasienter som ikke hadde gjennomgått kjemoterapi. I den foreliggende undersøkelse har vi forsøkt å belyse virkningen av sulfinosine (SF), en syntetisk purin-nukleosid-analog, i disse to MDR kreftcellelinjer. Vi velger SF grunn av bevisene for at dets terapeutisk effektive konsentrasjoner ikke kunne indusere motstand. SF også effektivt trenger inn til CNS [2]. Videre fersk klinisk studie viste at kombinasjonsterapi inkludert 6-tioguanin (nært beslektet molekyl til SF) er lovende for pasienter med residiverende høyverdig anaplastic gliom [19].
Effektene av SF på kreftcellevekst etter 72 timer behandling ble evaluert av chemo-følsomhet analysen – sulforhodamin B (SRB). SF hemmet veksten av sensitive og MDR kreftcellelinjer på en doseavhengig måte (figur 2A, C). Siden anvendelse av anti-cancermidler er begrenset av deres toksisitet overfor normale celler, testet vi effekten av SF på HaCaT-celler (normale humane keratinocytter). Effektene på vekst av HaCaT etter kontinuerlig behandling av 72 timer ble undersøkt også ved SRB-analysen. SF reduserte ikke signifikant antall av normale celler, selv med den høyeste konsentrasjon (100 uM) (figur 2C). Vi demonstrerte at SF hemmer veksten av sensitive så vel som resistente NSCLC og glioblastom-celler i mikro molar område av konsentrasjoner, og at dens effekt ikke ble påvirket av tilstedeværelsen av MDR-fenotype. Dessuten, SF var ikke-toksiske for normale celler (HaCaT) i det område av konsentrasjoner nødvendig for å hemme veksten av kreftceller.
veksthemmende virkninger av SF på NCI-H460 og NCI-H460 /R ( A), ble U87, U87-TXR og HaCaT (C) celler dyrket på plast etter 72 timer behandling bedømt ved SRB-analysen. Gjennomsnittlig ± S.D. verdiene ble beregnet fra fem uavhengige eksperimenter (n = 5). NCI-H460 og NCI-H460 /R (B), U87 og U87-TXR (D) celler ble farget med CFSE og inkubert i 72 timer med 10 uM SF. Satsen for spredning (CFSE deklinasjon) ble bestemt ved flow-cytometri på kanal FL1. Lysmikroskopi av NCI-H460 og NCI-H460 /R (E), U87 og U87-TXR (F) cellevekst på plast (2-D kultur) og matrigel vekst (3-D-kultur) etter 72 timer med 10 uM SF behandling.
Deretter vurderte vi cytostatisk effekt på 10 mikrometer SF i hver cellelinje ved CFSE farging (figur 2B, D). CFSE er en vital fargestoff stabil i cytoplasma i ca 7-8 generasjoner, men intensiteten av fluorescens CFSE avtar på grunn av den progressive halvering i datterceller som følger hver celledeling. På den måten kan det CFSE fordeling i cellene estimere hastigheten av celleproliferasjon. Den CFSE fordeling i kontroll og SF behandlede prøvene er illustrert ved strømnings-cytometrisk profilerte histogrammer (figur 2B, D). Inhiberingen av proliferasjon observert i nærvær av SF var den mest pronunced i NCI-H460 /R-celler. Disse resultatene indikerer at inhibering av proliferasjon er delvis ansvarlig for den anti-kreft-aktivitet av SF.
Siden NSCLC og glioblastoma cellelinjer som har høyt metastatisk potensiale, sammenlignet vi effektene av SF for å hemme cellevekst etter 72 t på plast (2-D kultur) og i rekonstituert basalmembran – matrigel (3-D kultur) (figur 2E, F). Vi fant at SF hemmet veksten i 3-D kultur med den samme effekten som ble observert i 2-D-kultur. Det faktum at cellene ble løsnet fra hverandre etter SF behandling i matrigel, spesielt glioblastom-celler, peker på endring i sine adhesive egenskaper. Derfor spekulerer vi at SF kan påvirke affinitet av kreftceller til å invadere blodårene, indusere tumor-angiogenese og metastasering.
SF Induserer caspase-avhengig apoptose i MDR kreftceller
Neste, vi gikk videre til å undersøke hvorvidt induksjon av apoptose bidrar til anti-kreft virkning av SF i MDR kreftcellelinjer. For å vurdere apoptose indusert ved SF etter 72 timer ble cellene sådd ut ved en optimal tetthet for deres vekstegenskaper. På denne måten fikk de ubehandlede kontrollene ikke oppnå konfluens ved slutten av inkubasjonsperioden. Annexin-V-FITC /propidiumjodidfarging avslørte at SF øker andelen av apoptotiske celler (AV + PI-) i begge MDR kreftcellelinjer. Resultatene er oppsummert i (figur 3A, B, C, D): levende celler som er negative for begge, Annexin V-og propidium jodid (AV-PI-);
