Abstract
Formål
For å bestemme hyppighet og prognostisk verdi av forhøyede mikro endringer på utvalgte tetranukleotid repetisjoner (EMAST ) i metastatisk kolorektalcancer (mCRC) pasienter i forhold til mikro ustabilitet (MSI) status og MSH3 protein uttrykk.
Materiale og metode
hyppigheten av EMAST ble evaluert i mCRC pasienter med MSI svulster og mikro stabil (MSS) svulster. En litteraturoversikt ble utført for å sammenligne hyppigheten av EMAST i vår undersøkelse med eksisterende data. Immunhistokjemi for MSH3 ble sammenlignet med EMAST status. Utfallet ble studert i forhold til total overlevelse (OS) for mCRC pasienter med MSI og MSS svulster.
Resultater
EMAST ble evaluert i 89 pasienter med MSI svulster (inkludert 39 pasienter med Lynch syndrom) og 94 pasienter med MSS svulster. EMAST ble observert hos 45,9% (84 av 183) av pasientene, med økt frekvens i MSI svulster (79,8% versus 13,8%, p 0,001). Vi fant ingen sammenheng mellom EMAST og MSH3 protein uttrykk. Det var ingen effekt av EMAST på prognose hos pasienter med MSS svulster, men pasienter med MSI /non-EMAST svulster hadde signifikant bedre prognose enn pasienter med MSI /EMAST svulster. (OS: HR 3,22, 95% KI 1.25 til 8.30)
Konklusjon
Frekvens av EMAST ble økt i mCRC pasienter med MSI svulster, sammenlignet med MSS svulster. Våre data tyder på at tilstedeværelsen av EMAST korrelerer med dårligere OS hos disse pasientene. Det var ingen effekt av EMAST på prognosen for pasienter med MSS tumorer. En begrensning av vår studie er det lite antall pasienter i vår subgruppeanalyse
Citation. Venderbosch S, van Lent-van Vliet S, de Haan AFJ, Ligtenberg MJ, Goossens M, Punt CJA, et al. (2015) EMAST er assosiert med dårlig prognose i mikro ustabil metastatisk kolorektalcancer. PLoS ONE 10 (4): e0124538. doi: 10,1371 /journal.pone.0124538
Academic Redaktør: Hiromu Suzuki, Sapporo Medical University, JAPAN
mottatt: 27 juni 2014; Godkjent: 15 mars 2015; Publisert: 17 april 2015
Copyright: © 2015 Venderbosch et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: På grunn av etiske restriksjoner, relevante data er tilgjengelig på forespørsel fra [email protected]
Finansiering:. Denne studien ble støttet av en bevilgning fra den nederlandske Colorectal Cancer Gruppe (DCCG). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
tykktarms~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP (CRC) kreftutvikling er en flertrinnsprosess der ulike veier er involvert, blant annet mikro ustabilitet (MSI) er viktig [1-3]. MSI er karakterisert ved en mangelfull misparringssystemet, noe som fører til kreftutvikling gjennom oppbygging av unrepaired rammeskiftmutasjoner i enkle repeterte sekvenser eller mikrosatellitter [4]. Til dags dato flere mismatch reparasjon (MMR) proteiner har blitt identifisert hos mennesker: MSH2, MSH3, MSH6, MLH1 og PMS2. MSH2 danner en heterodimer med MSH6 eller MSH3, som gir opphav til MutSα eller MutSβ henholdsvis [5]. MutSα gjenkjenner enkelt base-par uoverensstemmelser og små innsetting-sletting sløyfer (IDLs), mens MutSβ fortrinnsvis gjenkjenner større uoverensstemmelser og IDLs. Videre MLH1 og PMS2 danner MutLα, som virker som et molekylært LIGHT. I tillegg til den primære MMR defekt, kan sekundære tap av MMR proteiner oppstå som en konsekvens av
MSH3 Hotell og
MSH6
frame shift mutasjoner fremmet av
MLH1
inaktive [6, 7] eller på grunn av MSH3 og MSH6 protein nedbrytning i svulster ikke uttrykke sin heterodimere partner MSH2 [8,9]. Som et resultat, kan enkle eller kombinerte defekter av MMR subenheter (MutSα, MutSβ og MutL) løst til grunn for genetisk ustabilitet av MSI svulster. Kimcellelinje endringer av MMR gener er årsaken til MSI i Lynch syndrom pasienter [10]. MSI er også observert i 10-20% av pasienter med sporadisk CRC, vanligvis på grunn av arrangøren hypermethylation av
MLH1
gen [11,12]. MSI svulster har særtrekk, for eksempel plassering i proksimale colon, en høy forekomst av lymfatisk infiltrere, en dårlig differensiert, mucinous eller signetring histologi [13]. MSI svulster er forbundet med en gunstig prognose i tidlig stadium tykktarmskreft [14].
En distinkt form for MSI er observert i flere typer kreft, og kalles «forhøyede mikro endringer på valgt tetranukleotid gjentar» (EMAST) i motsetning til mono- og dinukleotid basert ustabilitet i felles MSI [15-20]. Bare noen få studier beskriver dette undertype i et lite antall av CRC-pasienter [21-24]. EMAST har ikke vært knyttet til store defekter i DNA mismatch reparasjon. Heterogen og redusert protein uttrykk for MSH3 ble observert i forbindelse med EMAST i CRC [21-24]. Nyere rapporter tyder på at MSH3 mangel er årsaken til EMAST i menneskelige CRC celler [25,26]. Koblingen mellom MSH3 og EMAST antyder en ervervet effekt, som ingen kjønnsceller mutasjon i
MSH3
noensinne har blitt vist [4]. Det er et bredt spekter i forekomsten av EMAST er CRC og den biologiske betydningen av EMAST i CRC er ikke klart. Bare én artikkel beskrevet en sammenheng med utfallet for stadium II /III CRC pasienter. [27]
Bare begrenset data er tilgjengelig om EMAST eller MSH3 uttrykk i CRC pasienter. I denne studien evaluerte vi hyppigheten av EMAST i MSI og mikro stabile (MSS) CRC svulster. I tillegg har vi vurdert i en utforskende analyse rolle EMAST som en prognostisk biomarkør med metastatisk CRC (mCRC) pasienter.
Materiale og metode
pasientpopulasjoner
Data var avledet fra mCRC pasienter inkludert i to store fase III-studier: Kairo (ClinicalTrials.gov NCT00312000) (n = 820) og CAIRO2 (n = 755) (ClinicalTrials.gov NCT00208546), hvorav resultatene har blitt publisert tidligere [28,29 ]. Innsamling av formalinfiksert parafin-embedded (FFPE) materiale av primærtumor var en del av den opprinnelige protokollen i begge studiene. For å bestemme hyppighet og prognostisk verdi av EMAST i mCRC pasienter med MSI svulster vi valgt 50 mCRC pasienter med MSI svulster behandlet i begge KAIRO studier. Siden MSI er relativt sjelden i mCRC vi kombinert pasientene av KAIRO (n = 19) og CAIRO2 (n = 31) studie. Ingen validering kohort kan velges for MSI pasienter. For ytterligere å vurdere forholdet mellom EMAST og MSI, hentet vi 39 svulster fra CRC pasienter (anonyme prøver) med kjent Lynch syndrom (stadium I-IV) fra vår egen database (som er satt opp i samsvar retningslinjene i den lokale medisinske etisk komité (Commissie Mensgebonden Onderzoek Radboudumc) med skriftlig informert samtykke fra pasientene, som bruk av vev, er godkjent for denne studien). For å bestemme hyppighet og prognostisk verdi av EMAST i mCRC pasienter med MSS svulster vi valgt 54 pasienter av KAIRO studie med sammenlignbare egenskaper (testgruppe). Pasienter i testgruppen ble behandlet med førstelinje kapecitabin monoterapi i minst 3 sykluser, lokalisering av primær svulst i tykktarmen eller recto- sigmoid som ble resected, WHO Performance Score 0, normal baseline serum laktatdehydrogenase konsentrasjon (LDH), og hadde ikke tidligere fått adjuvant kjemoterapi. I tillegg har vi tilfeldig valgt 40 flere mCRC pasienter med MSS svulster behandlet på samme KAIRO studien som en valideringsgruppe. (Fig 1)
EMAST analyse
Genomisk DNA ble ekstrahert fra fire til åtte manuelt microdissected 30 mikrometer i FFPE vev av de primære svulster. Områder som inneholder 50% tumorceller ble valgt ved mikroskopisk evaluering på en referanse lysbilde farget med H E. Genomisk DNA fra microdissected vev ble isolert ved hjelp av QIAamp DNA mikro kit (Qiagen, Valencia, CA) etter produsentens anvisninger. DNA-konsentrasjonen ble bestemt ved 260 nm ved hjelp av Nanodrop ND-1000 spektrofotometer (Nanodrop Technologies, Inc., Wilmington, DE, USA). EMAST analyse ble utført i duplikat på normal og tumor-DNA av de utvalgte pasienter. EMAST status ble bestemt ved PCR og Genescan analyse ved hjelp av fem tetranukleotid markører: MYCL1, D8S321, D9S242, D20S82 og D20S85 (S1 Table) [23]. En tumor ble definert EMAST dersom minst to av de fem markører viste ustabilitet og ikke-EMAST hvis bare en eller ingen av markører viste ustabilitet [22].
Pasienter ble analysert med hensyn på frekvens og prognostisk verdi i fire ulike grupper: pasienter med kombinert MSI og EMAST svulster (MSI /EMAST), pasienter med kombinert MSI og ikke-EMAST tumorer (MSI /non-EMAST), pasienter med kombinert MSS og EMAST svulster (MSS /EMAST) og pasienter med kombinert MSS og ikke-EMAST tumorer (MSS /non-EMAST). Frekvensen av EMAST ble sammenlignet for pasienter med MSI og MSS tumorer. Utfallet ble analysert innenfor gruppen av pasienter med MSI svulster (unntatt Lynch syndrom pasienter) for EMAST sammenlignet med ikke-EMAST svulster og innenfor gruppen av pasienter med MSS svulster for EMAST sammenlignet med ikke-EMAST svulster.
Immunohistokjemi MSH3
Immunohistochemistry (IHC) ble utført på microarray (TMA) av de primære svulster i 549 kvalifiserte randomiserte pasienter i KAIRO studien som beskrevet tidligere. [30] 4 pm lysbilder ble kuttet av hver TMA og montert på glass. Xylen og etanol ble brukt for deparaffinization og dehydrering av TMA lysbilder. Vann og fosfat-bufret saltvann (PBS) ble anvendt for vasking av skinnene. Endogen peroksidaseaktivitet ble blokkert med 3% hydrogenperoksid i PBS i 30 min og Objektglassene ble vasket med vann, hvoretter varme-induserte epitop gjenfinning ble utført. Glassene ble farget med et monoklonalt antistoff mot MSH3 (klone ERP4334, Epitomics-en Abcam selskap, Burlingame, CA, USA), fortynning 1: 5000. To uavhengige etterforskere utførte score, og hvis lysbildet scoring var ikke entydig, den oppfatning av en tredje etterforsker (patolog IDN) var endelig. Fargemønster av MSH3 protein ble evaluert ved hjelp av normal epitelial, stromal og betennelsesceller som intern kontroll. Lav MSH3 protein uttrykk ble definert som 85% brun farging av cellekjerner i tumorceller og høy MSH3 protein uttrykk ble definert som ≥85% brun farging av cellekjerner i tumorceller og ikke til anvendelse dersom verken kreft eller stromale celler viste MSH3 protein uttrykk [21].
MSI, hypermethylation av MLH1 genet arrangøren og BRAF status
for prøver av begge KAIRO studier, immunhistokjemi (IHC) ble utført på FFPE vev med antistoffer mot MLH1, MSH2 , MSH6 og PMS2. I tillegg ble det utført MSI analyse hvor det var et fravær av MMR-proteinekspresjon eller tvetydige IHC resultater. MSI status ble bestemt ved hjelp av to mikro markører (BAT 25 og BAT 26). Hvis bare en av disse markørene viste ustabilitet, ble analysen utvidet med ytterligere fire markører (BAT 40, D2S123, D5S346, og D17S250). En svulst ble definert som MSI dersom minst to av de seks markører viste ustabilitet eller MSS hvis ingen av markørene viste ustabilitet. Svulster med bare en av markørene viser ustabilitet ble definert som MSI-lav og inkludert i MSS kategorien. [30] Hypermethylation status for
MLH1
gen promotoren og
BRAF
V600E mutasjon status ble vurdert som beskrevet tidligere [30-32]
Statistisk analyse
For EMAST analyse, ble pasientene delt inn i to kategorier:. EMAST og ikke-EMAST svulster. Sammenhengen mellom EMAST og MSH3 protein uttrykk ble undersøkt med en logistisk regresjonsmodell med uavhengige faktorer gruppe og MSH3 uttrykk. OS ble definert som tiden fra dato for randomisering til dato for død av enhver årsak. OS Kurver ble beregnet ved hjelp av Kaplan-Meier metoden og sammenlignet ved hjelp av en Cox proporsjonal risikomodell. Alle testene var tosidig og p 0,05 ble ansett som statistisk signifikant. Alle analyser ble utført ved bruk av SAS-systemet versjon 9.2.
Litteratur søkestrategi, inklusjonskriterier, og data utvinning
Vi vurderte litteraturen om hyppigheten av EMAST i CRC pasienter med MSI og MSS svulster . Et søk ble utført av Medline, PubMed og Cochrane Library fra januar 1990 til april 2014 med en engelskspråklig begrensning, ved hjelp av følgende søkeord: EMAST, tetranukleotid gjentar, i kombinasjon med tykktarmskreft og endetarmskreft. Originale publikasjoner ble valgt hvis det abstrakte inneholdt data for pasienter med EMAST. Ved dupliserte publikasjoner, ble den siste og /eller mest komplette studien inkluderte. Publikasjoner ble ekskludert dersom hyppigheten av EMAST var begrenset til enten pasienter med MSI eller MSS svulster.
Resultater
Prevalens av EMAST
Totalt EMAST ble observert blant 45,9% av en totalt 183 svulster (tabell 1). Frekvens av EMAST var signifikant høyere blant pasienter med MSI svulster i forhold til MSS svulster:. 79,8% sammenlignet med 13,8% (p 0,001)
Hos pasienter med MSS /EMAST svulster ustabilitet ble Vanligvis vist 2 EMAST loci (69,2%, 9 av 13), mens hos pasienter med MSI /EMAST svulster ustabilitet ble hyppig vist på fire (33,8%, 24 av 71), eller 5 (50,7%, 36 ut av 71) EMAST loci ( figur 2A). Den høyeste frekvensen til ustabilitet i EMAST tumorer ble demonstrert ved D20S82 locus (91,7%, 77 ut av 84), etterfulgt av MYCL1 locus (86,9%, 73 ut av 84), den D9S242 locus (84,5%, 71 ut av 84 ), det D8S321 locus (72,6%, 61 av 84) og D20S85 locus (65,5%, 55 av 84) (figur 2B).
EMAST og MSH3
flertallet av mCRC pasienter (n = 381, 69,4%) hadde en høy ekspresjon av MSH3 i tumorceller (figur 3). 21,1% av tumorer demonstrert atom heterogenitet etter ekspresjon av både positive og negative kjerner ved MSH3 IHC-farging (fig 3A-3C). Både MSH3 uttrykk og EMAST status ble kjent i 139 pasienter. Heterogen eller høy MSH3 protein ekspresjon ble ikke korrelert til EMAST status (p = 0,088 og p = 0,856, respektivt).
heterogen MSH3 protein uttrykket (A), demonstreres ved ekspresjon av både brun (positiv) og blå ( negativ) kjerner ved MSH3 IHC flekker. Lav MSH3 protein-ekspresjon ble definert som 85% brun farging av cellekjerner i tumorceller (B) og høy MSH3 protein-ekspresjon ble definert som ≥85% brun farging av cellekjerner i tumorceller (C)
Utfallet av pasienter med MSI svulster
pasienter med MSI /EMAST svulster var for det meste kvinner (52% mot 22%, henholdsvis p = 0,038) (tabell 2). Videre EMAST svulster ble oftere plassert over rektosigmoid området (93% versus 63%, p = 0,006).
Median OS var betydelig verre for pasienter med MSI /EMAST forhold til MSI /ikke- EMAST svulster behandlet i begge KAIRO studier (11,4 versus 39,4 måneder, henholdsvis HR 3,22, 95% KI 1.25 til 8.30) (tabell 3).
MSI /EMAST og forholdet til MMR proteiner
fordelingen av tap av MMR proteiner i mCRC svulster er oppsummert i figur 4A. De fleste pasienter med MSI svulster viste tap av MLH1 og /eller PMS2 protein uttrykk (72,0%, 36 av 50 pasienter). Tap av MSH2 og /eller MSH6 protein-ekspresjon ble funnet i 18,0% (9 av 50) av pasientene. Disse pasientene er sannsynlig Lynch eller Lynch-lignende syndrom pasienter. Kun 7,1% (3 av 42) av pasientene med MSI /EMAST tumor viste tap av uttrykk for MSH6 protein, sammenlignet med 62,5% (5 av 8) av pasienter med MSI /non-EMAST svulster.
(A). Andel pasienter med kjent Lynch syndrom og kjønnsceller mutasjon av de ulike MSI gener, inndelt i pasienter med MSI /EMAST svulster og pasienter med MSI /ikke-EMAST tumorer (B).
Hypermethylation av
MLH1
genet promoter (32 av 40 pasienter) og
BRAF
mutasjoner (24 av 40 pasienter) var begrenset til pasienter med MSI /EMAST tumor (p 0,001 og p = 0,004 henholdsvis).
EMAST hos pasienter med Lynch syndrom
for ytterligere å analysere forholdet mellom MSI og EMAST vi valgt 39 pasienter med kjent Lynch syndrom (med bakterie linje mutasjoner i
MSH2
genet (n = 11),
MLH1
genet (n = 10),
MSH6
genet (n = 10) og
PMS2
genet (n = 8)). Flertallet av denne populasjonen viste EMAST (29 av 39 pasienter). Ingen av pasientene viste hypermethylation av
MLH1
genet promoter, og alle svulster var
BRAF
villtype. Ni av 10 pasienter med ikke-EMAST svulster hadde en germline mutasjon i
MSH6 plakater (figur 4B).
Utfallet av pasienter med MSS svulster
Baseline pasient og tumor egenskaper for pasienter med MSS tumorer (testgruppe og validering gruppe), inndelt etter EMAST og ikke-EMAST svulster er presentert i tabell 2. Det var ingen signifikant forskjell i utfallet for pasienter med EMAST sammenlignet med pasienter med ikke-EMAST tumorer (Tabell 3 ).
gjennomgang av litteratur
litteratur~~POS=TRUNC identifiserte 7 studier der EMAST ble beskrevet i fase i-IV CRC pasienter med MSI og MSS svulster [21-24,27,33, 34]. To studier ble ekskludert: en studie beskrev den samme befolkningen [23] og en studie vurderes utbredelsen av EMAST utelukkende hos pasienter med MSS svulster [27]. Tre studier hadde begrenset antall MSI svulster. Figur 5 oppsummerer en skog tomt på de 5 publiserte studier og gjeldende studie om utbredelsen av EMAST i fase I-IV CRC pasienter med MSI og MSS svulster. EMAST er betydelig hyppigere i svulster med MSI (148/174) (RR 4,80, 95% konfidensintervall 3,90 til 5,91). Betydelig heterogenitet ble observert.
Diskusjoner
Denne studien presenterer analysen på frekvens og prognostisk verdi av EMAST i mCRC pasienter. Selv EMAST ble observert hos 45,9% av alle mCRC pasienter, ble det mest uttalt i MSI svulster (79,8%). Hyppigheten av EMAST blant MSS svulster (13,8%) var mye lavere i vår studie sammenlignet med de fleste studier i stadium I-IV CRC [21-24,27,34]. Det brede frekvensområde (0,54 til 60,2%) av EMAST blant MSS tumorer som er beskrevet i litteraturen [21-24,27,33,34] kan skyldes det faktum at det er ingen enighet om definisjonen av EMAST og panelet som kreves for sin diagnose. På grunn av den polymorfe natur tetranukleotid gjentar i denne studien vi brukte strenge kriterier for definisjonen av EMAST:. I det minste to av de fem tetranukleotid markørene skal vise ustabilitet
Til tross for det faktum at flere små studier (n = 3 til n = 56) [21-24,33,34] viste at MSI alltid er forbundet med EMAST, sammenhengen mellom EMAST og MSI er ikke allment akseptert. Vi fant en høy frekvens av EMAST i MSI svulster, som ble bekreftet i en analyse av eksisterende litteratur i stadium I-IV CRC (fig 5). Bare en liten undergruppe av pasienter med MSI svulster er ikke-EMAST. Interessant, de fleste pasienter med MSI /non-EMAST svulster viste tap av MSH6. Dette er i tråd med det faktum at MSH6 er kun involvert i mononukleotid mismatch reparasjon [35,36]. Pasienter med MSI /ikke-EMAST svulster er oftere mannlige og svulster utviklet oftere i endetarmen, disse egenskapene er sammenlignbare med pasienter med
MSH6
germline mutasjoner [37]. I populasjonen av MSI svulster nærvær av EMAST er korrelert med
MLH1
mangel, noe som fører til en total DNA-reparasjon mismatch defekt, både i Lynch syndrom, så vel som i den sporadisk omgivelser, noe som bekrefter tidligere observasjoner [21,27 ].
data~~POS=TRUNC om EMAST fenotype i CRC er knappe og underliggende mekanismen (e) er fortsatt uklart. De tidligste rapportene antydet at EMAST kan være assosiert med mutasjoner i
TP53
gen [16,17] eller at miljøkreftfremkallende kan forverre denne fenotype [38] i andre enn CRC kreft. Senere ble en sammenslutning mellom tap av MSH3 og EMAST i CRC [21]. På grunn av det faktum at MutSβ har en sterk affinitet til å gjenkjenne flere enn to uparede nukleotider og genetisk komplementering av MSH3 mangel i humane celler økt stabilitet ved loci som inneholder dinukleotid og tetranukleotid gjentar [39], ble det hevdet at det tap av MutSβ grunn MSH3 inaktivering kan resultere i MSI ikke bare ved loci som inneholder dinukleotidpolyfosfater gjentas, men også ved loci med tetranukleotid gjentas, slik som EMAST [21]. Nyere studier bekrefter sammenhengen mellom tap av MSH3 og EMAST i CRC, men det nøyaktige underliggende mekanismen er fortsatt ukjent [25,26]. Vi klarte å demonstrere en sammenheng mellom MSH3 protein uttrykk og EMAST. Egentlig gjorde vi finner den heterogene uttrykk mønster av MSH3 i 21,1% av pasientene som beskrevet av andre, selv om dette ikke var korrelert til EMAST. Men denne studien hadde et lite antall pasienter. En annen mulig forklaring på forskjellen mellom vår studie og tidligere studier kan være en potensiell undersampeling skjevhet siden vi brukte en TMA eksemplar per svulst i stedet for fulle kreft lysbilder.
Vi viser at pasienter med MSI /non-EMAST svulster en betydelig bedre prognose enn pasienter med MSI /EMAST svulster. Tilsetningen av EMAST til MSI tumorer synes å forverre total prognose og overlevelse. MSI /ikke-EMAST gruppe forventes å bli beriket for
MSH6
mangel siden EMAST ville bli identifisert med en total DNA mismatch reparasjon defekt, slik som med
MLH1
eller
MSH2
mangel. Våre resultater på korrelasjon av EMAST med klinisk utfall bør tolkes med forsiktighet på grunn av det lave antallet pasienter i de ulike undergruppene.
I sammendraget, er lav frekvens EMAST blant mCRC pasienter med MSS svulster i forhold til pasienter med MSI svulster. Det var ingen sammenheng mellom EMAST og MSH3 protein uttrykk. Vi fant en klar sammenheng mellom MSI og EMAST, og resultatet var betydelig bedre for mCRC pasienter med MSI /non-EMAST svulster. Videre studier er garantert å belyse det molekylære grunnlaget for EMAST og for å vise om de tetranukleotid endringer observert i EMAST svulster kan ha en funksjonell effekt av seg selv eller bare representere tilskuer endringer i en undergruppe av svulster med spesifikke defekter i DNA replikasjon og reparasjon.
Hjelpemiddel Informasjon
S1 Table. Tetranukleotid mikro PCR primer sekvenser
doi:. 10,1371 /journal.pone.0124538.s001 product: (PDF)
Takk
Denne studien ble støttet av en bevilgning fra den nederlandske tykktarms Cancer Gruppe (DCCG).
